黑老虎內(nèi)生真菌及根際土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)與生態(tài)功能分析

劉濤 馬楠 金吉芬 彭志軍 李興忠 汪得凱

摘 要： 為探討黑老虎（Kadsura coccinea）根際土壤和組織內(nèi)生真菌菌群的組成及其生態(tài)功能，該研究采用ITS高通量測序技術(shù)對成熟黑老虎（根、莖、葉）內(nèi)生真菌及根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)、多樣性和生態(tài)功能進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：（1）從12個(gè)樣品中共獲得2 241個(gè)可操作分類單元（OTU），涉及10門、41綱、95目、212科、367屬，內(nèi)生真菌（根、莖、葉）和根際土壤真菌OTU數(shù)分別為386、536、258、1 435個(gè)，其中共有的OTU為18個(gè)。在門水平上，黑老虎內(nèi)生真菌及根際土壤真菌優(yōu)勢群落均為子囊菌門和擔(dān)子菌門，其中子囊菌門在葉和莖中占比分別高達(dá)96.99%和95.37%；在屬水平上，黑老虎根際土壤真菌中腐生真菌被孢霉屬占比較高（為13.5%），葉和莖等生長旺盛的組織中子囊菌門未分類屬和痂囊腔菌屬占比較高。（2）α多樣性分析結(jié)果顯示，黑老虎根際土壤真菌群落的豐度和多樣性明顯高于內(nèi)生真菌，莖中內(nèi)生真菌豐度顯著高于根和葉，而根、莖和葉組織間內(nèi)生真菌多樣性差異不顯著；PCoA分析結(jié)果顯示，葉和莖的真菌群落結(jié)構(gòu)相似性更高。（3）利用FUNGuild數(shù)據(jù)庫進(jìn)行的功能預(yù)測分析結(jié)果顯示，黑老虎根際土壤真菌和內(nèi)生真菌含有大量的未分類菌群；功能已分類菌群中，病理寄生型功能群在生長旺盛的組織中占比較高。該研究結(jié)果為黑老虎優(yōu)異功能菌的篩選和發(fā)掘提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 黑老虎， 高通量測序， ITS， 內(nèi)生真菌， 根際土壤真菌， 多樣性， FUNGuild

中圖分類號： Q945.8? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A? 文章編號： 1000-3142（2023）05-0869-11

Abstract： To investigate rhizosphere soil and endophytic fungal community structure， diversity， and ecological function in Kadsura coccinea， the endophytic fungal communities from roots， stems， leaves， and rhizosphere soils of mature K. coccinea were analyzed based on ITS high-throughput sequencing technology. The results were as follows：（1） A total of 2 241 operational taxonomic units （OTUs） were obtained from 12 samples at 97% of sequence homology level. The OTUs of endophytic （root， stem and leaf） and rhizosphere soil fungi were 386， 536， 258 and 1 435， respectively， of which 18 OTUs were in common. They belonged to 10 phyla， 41 classes， 95 orders， 212 families and 367 genera. The dominant fungal communities at the phylum level in the endophytic and rhizosphere soil of K. coccinea were Ascomycota and Basidiomycota. Among them， Ascomycota accounted for 96.99% and 95.37% of the endophytic fungal community in leaves and stems， respectively. At the genus level， the saprophytic fungi Mortierella accounted for a relatively high proportion （13.5%） in the rhizosphere soil. In contrast， pathogenic fungi such as Ascomycota_unclassified and Elsinoe were mainly found in vigorously growing tissues （leaves and stems）. （2） Alpha diversity analysis showed that the richness and diversity of the fungal community in the rhizosphere soil of K. coccinea were significantly higher than those in endophytic fungi. Although the abundance of endophytic fungi in stems was significantly higher than that in roots and leaves， the differences in endophytic fungal diversity among roots， stems and leaves were not significant. The principal component analysis （PCoA） revealed that the fungal community structures of leaves and stems were more similar， and those of roots and rhizosphere soils were more similar. （3） The function of fungal communities in different tissues and rhizosphere soils of K. coccinea was predicted and analyzed by using FUNGuild platform. The results showed that the rhizosphere soil fungi and endophytic fungi contained a large number of unclassified fungi. Among the functionally classified fungi， the pathotroph functional group had a higher proportion in the vigorously growing tissues. This study provides a theoretical basis for the screening and exploring of active functional fungi in K. coccinea.

Key words： Kadsura coccinea， high-throughput sequencing， ITS， endophytic fungi， rhizosphere soil fungi， diversity， FUNGuild

黑老虎（Kadsura coccinea），別名冷飯團(tuán)、臭飯團(tuán)、布福娜等，是木蘭科南五味子屬植物（林祁和楊志榮，2007），主要分布于我國湖南、貴州、云南、福建、廣西、四川、江西等地（曾建飛，1996），以根、莖入藥，具有行氣活血、消腫止痛等功效（Wang et al.， 2012）?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黑老虎提取物具有抗氧化、抗衰老、抗病毒、保肝護(hù)肝及抗癌等功能（Sun et al.， 2009；Zhao et al.， 2014；Zhao et al.， 2021）。黑老虎果實(shí)富含木脂素、氨基酸、花青素等活性物質(zhì)（舒永志等，2012；趙林峰和梁忠厚，2019），已作為一種新興水果逐漸為人們所熟知，在貴州黔東南、湖南通道及湖北恩施等地作為脫貧致富產(chǎn)業(yè)得以推廣（劉濤等，2009；高漸飛等，2022）。

植物內(nèi)生菌分布于植物組織表面或器官內(nèi)部，與寄主植物長期依存并協(xié)同進(jìn)化（Rodriguez et al.， 2009；Porras-Alfaro & Bayman， 2011）。植物內(nèi)生真菌可以促進(jìn)植物的生長發(fā)育、抵御非生物脅迫、增加宿主的抗病性，部分藥用植物內(nèi)生真菌可產(chǎn)生與寄主類似的次生代謝物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)、工業(yè)及生物技術(shù)等領(lǐng)域（Khan et al.， 2012；Liu et al.， 2018；Juri c＇ et al.， 2020）。目前，藥用植物內(nèi)生菌研究較多，如杜仲（楊娟等，2019）、重樓（王艷等，2019）、掌葉大黃（Chen et al.， 2021）、黃精（樊銳鋒等，2021）等。有研究表明，五味子科植物中含有豐富的內(nèi)生真菌，已分離的內(nèi)生菌具有抗氧化（趙玥等，2015）、拮抗植物病原菌（潘爭艷等，2007；張譽(yù)薺等，2021）和抑制病原菌（張譽(yù)薺等，2020）、抑制腫瘤細(xì)胞生長（Song et al.， 2021）等功能。從五味子科植物中陸續(xù)分離了一些能夠產(chǎn)生木質(zhì)素類或轉(zhuǎn)化宿主主要次生代謝物黑五味子酸的內(nèi)生真菌（Wang et al.， 2017；毛瑞華和竇智，2019；Qin et al.， 2019， 2020）。然而，五味子科植物長期種植會導(dǎo)致土壤菌群發(fā)生變化。江林春等（2020）用高通量測序方法分析了未種植華中五味子（CK）與種植3 a（Y3）、6 a（Y6）后根際土壤化學(xué)性質(zhì)和真菌群落變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)華中五味子種植6 a后根際土壤養(yǎng)分狀況和土壤真菌群落發(fā)生了明顯改變。這為五味子屬植物內(nèi)生真菌及根際真菌的研究提供了重要信息，但對黑老虎內(nèi)生真菌和根際真菌的研究報(bào)道還很少。

鑒于黑老虎內(nèi)生真菌和根際真菌的研究現(xiàn)狀，本研究采用Illumina高通量測序方法，以多年生成熟的黑老虎為對象，通過分析黑老虎內(nèi)生真菌及根際土壤真菌的真菌群落組成、多樣性和功能預(yù)測，探討以下問題：（1）黑老虎植株內(nèi)生真菌和根際土壤真菌的群落組成差異和優(yōu)勢菌群；（2）黑老虎內(nèi)生真菌和根際真菌功能差異及形成原因。本研究為黑老虎內(nèi)生真菌和根際真菌菌群的發(fā)掘和代謝活性產(chǎn)物的進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品處理

黑老虎根際土、根、莖和葉均采自貴州省果樹科學(xué)研究所試驗(yàn)基地，品種資源編號為GZ1，已種植5 a以上。2021年11月采收黑老虎果實(shí)后，選取長勢一致、發(fā)育良好的成熟根、莖和葉，每3株混合作為1個(gè)處理，重復(fù)3次。根部帶土，置于冷鏈箱內(nèi)，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，將根部土壤抖落，留存無法抖落的為根際土壤，將根際土壤收集于無菌PE管中，根樣品標(biāo)記為RT1、RT2和RT3，莖樣品標(biāo)記為ST1、ST2和ST3，葉樣品標(biāo)記為LF1、LF2和LF3，根際土樣品標(biāo)記為Rh1、Rh2和Rh3。根和根際土樣品的制備參照王艷等（2019）的方法，將黑老虎根、莖和葉用流動的自來水沖去表面多余的根際土后，先分別置于75%乙醇中處理2 min，再用5%次氯酸處理3 min，最后用無菌水清洗3次，最終獲得表面無菌的黑老虎根、莖和葉樣品，由于難以從黑老虎肉質(zhì)葉片中提取DNA，因此將表面滅菌的葉片放入無菌小網(wǎng)袋中，先置于變色硅膠中干燥24 h，再置于液氮中速凍用于后續(xù)DNA提取。

1.2 ITS文庫構(gòu)建及高通量測序

根、莖和葉組織樣品經(jīng)液氮研磨后，用植物基因組DNA試劑盒（天根生化科技有限公司，貨號：DP305）提取總DNA， 根際土樣品用液氮研磨后提取土壤微生物DNA，使用FastDNA SPIN Kit for Soil 試劑盒（ MP Biomedicals，LLC，Ail，Ohio，貨號：116560200），提取步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。ITS擴(kuò)增子采用通用引物fITS7/ITS4（ITS2區(qū)）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用的引物序列為fITS7（5′-GTGARTCATCGARTCTTTG-3′），ITS4（5′- TCCTCC

GCTTATTGATATGC-3′），PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增體系為25 μL，含2 × Phanta Max Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，貨號：P515-01）12.5 μL，正向引物fITS7（1 μmol·L-1）和反向引物 ITS4（1 μmol·L-1）各2.5 μL，模板DNA 50 ng。 PCR程序： 95 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃變性30 s， 50 ℃退火30 s， 72 ℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳確證，PCR產(chǎn)物回收純化后，利用Illumina Mi Seq PE300平臺上機(jī)測序（杭州聯(lián)川生物科技公司，杭州）。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

測序獲得的原始數(shù)據(jù)去除接頭序列后，使用FLASH V1.2.7軟件進(jìn)行拼接，利用Trimmomatic V0.33軟件過濾低質(zhì)量的測序堿基，利用Vsearch V2.3.4軟件過濾掉嵌合的reads獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)后，使用UPARSE軟件（http：//drive5.com/uparse/）在97%的相似水平下聚類生成OTU并進(jìn)行注釋。利用QIIME 2軟件進(jìn)行α、β多樣性分析（Bolyen et al.， 2019）。方差分析和多重比較采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行。繪圖用R V3.5.2軟件完成。內(nèi)生真菌的生態(tài)功能利用FUNGuild平臺進(jìn)行分析（Nguyen et al.， 2016）。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌和根際土壤真菌群落測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

對黑老虎的3個(gè)不同組織及根際土共計(jì)12個(gè)樣品進(jìn)行ITS高通量測序，共測得1 023 870對讀長（reads），原始下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)雙端拼接、質(zhì)量控制、嵌合體過濾后，進(jìn)行高質(zhì)量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，共獲得988 991對有效reads，樣品有效reads為78 302～84 135對，每個(gè)樣品平均82 416對reads，有效率在94.79%～98.40%之間，Q20全部為98.98%及以上（表1），表明測序質(zhì)量評價(jià)各項(xiàng)指標(biāo)均符合ITS測序要求。內(nèi)生真菌及根際土樣本的稀釋曲線均表現(xiàn)為先急劇上升，之后隨著測序條數(shù)的增加曲線趨于平緩，文庫的覆蓋度均在99.9%以上（圖1），表明各樣品物種測序量趨于飽和，測序結(jié)果可以充分覆蓋樣品的物種。另外，從樣品稀釋曲線來看，根際土壤真菌豐度遠(yuǎn)大于內(nèi)生真菌，提示根際土壤真菌多樣性可能比內(nèi)生真菌更高。

2.2 內(nèi)生真菌和根際土壤真菌群落OTU分析

經(jīng)過分析和聚類，從12個(gè)樣品中共得到2 241個(gè)OTU，其中從根際土壤樣品中檢測到1 435個(gè)，從根、莖和葉3個(gè)組織樣品中分別檢測到386、536、258個(gè)。通過韋恩圖分析發(fā)現(xiàn)，根際土壤真菌和內(nèi)生真菌群落中共有的OTU數(shù)量為18個(gè)，其中根際土中擁有較多獨(dú)立的OTU（為1 192個(gè)），而根、莖和葉組織中獨(dú)立的OTU數(shù)分別為151、383、112個(gè)。根際土和根中共有的OTU數(shù)量為195個(gè)，根際土與莖、葉共有OTU分別為65、52個(gè)，根、莖和葉3個(gè)組織共有OTU為40個(gè)（圖2）。圖2結(jié)果表明，盡管所檢測的OTU數(shù)量較多，但根際土和各組織間共有的OTU只有18個(gè)，占比僅0.8%，根際土壤真菌、組織內(nèi)生真菌中形成了相對獨(dú)立的真菌群落。根際土壤與根共有的OTU占比相對較高（8.8%），提示黑老虎根長期生活在土壤中，可能與根際富集的真菌形成一定的互作關(guān)系，真菌群落之間產(chǎn)生相互影響。

2.3 內(nèi)生真菌和根際真菌的群落結(jié)構(gòu)組成

進(jìn)一步將OTU的代表序列在門和屬水平上進(jìn)行群落組成分析。在門水平上，根際土壤真菌和內(nèi)生真菌的優(yōu)勢群落均為子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota），其中子囊菌門占絕對優(yōu)勢，根際土和根占比分別為57.26%和58.76%，而葉和莖占比分別高達(dá)96.99%和95.37%。此外，根中優(yōu)勢菌門為擔(dān)子菌門和球囊菌門（Glomeromycota），分別占比為21.03%和17.96%，球囊菌門在莖、葉組織和根際土中分別占比為0.044%、0.004%和0.670%。接合菌門（Zygomycota）在根際土中占比為13.84%，在其他植物組織中占比為0.03%～1.31%（圖3：A）。未分類的OTU門在根際土中占比為13.66%，在植物組織中占比為0.19%～0.93%。

在屬水平上，黑老虎內(nèi)生真菌和根際土壤真菌主要分布于367屬。其中，根際土壤真菌相對含量前5的有未分類真菌（Fungi_unclassified，13.7%）、被孢霉屬（Mortierella，13.5%）、小不整球殼（Plectosphaerella，6.0%）、錐囊菌屬（Subulicystidium，4.5%）和新叢赤殼屬（Neonectria，4.3%）；根中占比前5的屬有蠟殼耳目未分類屬（Sebacinales_unclassified，19.7%）、外瓶霉屬（Exophiala，15.2%）、球囊菌門未分類屬（Glomeromycota_unclassified，12.1%）、刺盾炱目未分類屬（Chaetothyriales_unclassified，8.8%）和鐮刀菌屬（Fusarium，8.0%）；莖中占比前5的屬為子囊菌門未分類屬（Ascomycota_unclassified，17.7%）、格孢腔菌目未分類屬（Pleosporales_unclassified，16.3%）、痂囊腔菌科未分類屬（Elsinoaceae_unclassified，11.8%）、橫斷孢屬（Strelitziana，9.1%）和Trichomeriaceae未分類屬（Trichomeriaceae_unclassified，8.6%）； 葉中痂囊腔菌屬（Elsinoe，21.5%）、球腔菌屬（Mycosphaerella，18.2%）、球座菌屬（Guignardia，14.2%）、間座殼屬（Diaporthe，6.9%）、瓶霉菌屬（Phialophora，5.4%）相對含量位于前5。這表明黑老虎根內(nèi)生真菌及根際土真菌群落存在組織特異性，黑老虎根際真菌和內(nèi)生真菌分別有特異的屬，根際土壤真菌和內(nèi)生真菌菌群結(jié)構(gòu)存在多樣性（圖3：B）。對黑老虎根際真菌和內(nèi)生真菌測序所得的OTU結(jié)果在屬水平上進(jìn)行分類及相對豐度信息繪制熱圖（heat map）進(jìn)行分析，對根際真菌和內(nèi)生真菌在門和屬水平上前30的物種進(jìn)行聚類分析，在門水平上，莖和葉可以聚為一類（圖4：A）。在屬水平上，根際土與根聚為一類，莖和葉聚為一類（圖4：B）。結(jié)果顯示黑老虎根樣品和根際土樣品的真菌群落結(jié)構(gòu)更相似，根際土壤真菌和根內(nèi)生真菌群落之間可能存在相互影響，而莖和葉的內(nèi)生真菌群落來源相近或可能存在相互作用。

2.4 內(nèi)生真菌和根際土壤真菌群落的多樣性分析

ACE指數(shù)及Chao1指數(shù)反映物種豐度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)主要反映物種的多樣性。由表2可知，黑老虎根際土壤真菌群落豐度和多樣性顯著高于內(nèi)生真菌，與內(nèi)生真菌相比，根際土壤真菌群落的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均顯著高于內(nèi)生真菌（P<0.05）。根、葉和莖的ACE指數(shù)及Chao1指數(shù)無顯著差異（P>0.05），而莖與葉的ACE指數(shù)及Chao1指數(shù)有顯著差異（P<0.05）。以上結(jié)果表明根際土壤真菌的豐度和多樣性高于內(nèi)生真菌，莖中內(nèi)生真菌的豐度顯著高于葉，根、莖和葉各組織間的多樣性差異不顯著。

為分析黑老虎根際土壤真菌群落和內(nèi)生真菌群落之間的物種差異性，利用主坐標(biāo)（principal coordinates analysis，PCoA）分析了黑老虎內(nèi)生真菌和根際土壤真菌的結(jié)構(gòu)情況，基于非加權(quán)距離矩陣（unweighted distance matrix），圖5結(jié)果顯示，第一主軸解釋了OTU水平真菌群落結(jié)構(gòu)變化的32.44%，第二主軸解釋了OTU水平真菌群落結(jié)構(gòu)變化的16.11%，兩個(gè)主軸合計(jì)解釋了48.55%真菌群落結(jié)構(gòu)變化。PCoA分析結(jié)果顯示，在根際土壤和3種組織中，不同組織樣品間明顯分開，葉樣品與莖樣品相對聚集，而葉樣品與莖樣品真菌群落相似度較高，可能來自相同的起源。雖然根和根際土壤長期接觸，但從主坐標(biāo)分析來看，根內(nèi)生菌與根際土壤真菌的距離仍然較遠(yuǎn)，表明兩者真菌菌群來源并不相同。

2.5 內(nèi)生真菌及根際土壤真菌群落的FUNGuild功能類群預(yù)測

利用FUNGuild數(shù)據(jù)庫對黑老虎內(nèi)生真菌及根際土壤真菌群落進(jìn)行功能預(yù)測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未分類菌落（unassigned）在根際土、根、莖中占比較高，分別為31.5%、37.3%和35.8%；而病理寄生型（pathotroph）功能群在黑老虎組織和根際土壤中所占比例次序?yàn)槿~（62.9%）>莖（37.5%）>根際土（16.7%）>根（9.2%），表明病理寄生型功能群在生長旺盛的組織中占比較高。根際土壤中，其他營養(yǎng)類型如腐生型（saprotroph，10.2%）、病理寄生-腐生-共生型（pathotroph-saprotroph-symbiotroph，12.7%）、腐生-共生型 （saprotroph-symbiotroph，13.9%）在根際土中占比超過10%；而根中超過10%的功能菌群有腐生-共生型（saprotroph-symbiotroph，17.8%）和病理寄生-腐生型（pathotroph-saprotroph，17.2%）， 莖和葉中超過10%的功能菌群分別為共生型（symbiotroph，13.7%）和病理寄生-共生型（pathotroph-symbiotroph，10.7%）（圖6：A）。

對各樣品中超過1%的菌群進(jìn)行詳細(xì)的物種生態(tài)功能預(yù)測分類，除未分類菌落（unassigned）占一定比例外，黑老虎內(nèi)生真菌和根際真菌已鑒定出的主要生態(tài)功能菌為植物病原菌（plant pathogen），在根際土、根、莖和葉中占比分別為15.4%、9.1%、37.5%和62.9%（圖6：B）。在超過10%的生態(tài)功能菌群中，根際土真菌為內(nèi)生菌-枯枝腐生型-土壤腐生型-未定義腐生型（endophyte-litter saprotroph-soil saprotroph-undefined saprotroph，13.6%） ，根中為動物病原菌-真菌寄生蟲-未定義腐生型（animal pathogen-fungal parasite-undefined saprotroph，17.1%）和叢枝菌根（arbuscular mycorrhizal，17.0%）兩種，莖和葉中無其他類型的功能菌群占比超過10.0%。

3 討論與結(jié)論

在漫長的自然進(jìn)化中，真菌與其宿主植物形成復(fù)雜的相互作用關(guān)系，真菌對植物的生長發(fā)育、抵御病原菌和外部非生物脅迫發(fā)揮了重要作用，同時(shí)部分內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生與宿主相同的次生代謝產(chǎn)物。由于傳統(tǒng)分離技術(shù)難以獲得不可培養(yǎng)的內(nèi)生真菌，因此限制了內(nèi)生真菌的進(jìn)一步發(fā)掘。本研究利用高通量測序技術(shù)對黑老虎內(nèi)生真菌和根際土壤真菌的群落組成和多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了大量未分類的OTU：其一，表明與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法相比，利用高通量測序技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)更多的內(nèi)生真菌；其二，表明黑老虎內(nèi)生真菌和根際土壤真菌中存在大量未分類的真菌群落，可能受限于真菌數(shù)據(jù)庫限制，無法對這些真菌群落進(jìn)行功能分類；其三，很多未被發(fā)掘的真菌群落可能難以進(jìn)行人工分離培養(yǎng)，需要通過改良分離培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)一步發(fā)掘內(nèi)生真菌。

Fuchs等（2017）研究表明，內(nèi)生真菌的組成和結(jié)構(gòu)受種屬、環(huán)境、組織等因素影響。從真菌群落結(jié)構(gòu)組成結(jié)果來看，黑老虎根際土、根、莖和葉中真菌群落結(jié)構(gòu)存在較大差異。在門水平上，黑老虎內(nèi)生真菌及根際真菌的優(yōu)勢群落均為子囊菌門和擔(dān)子菌門，但子囊菌門在葉和莖中占比超過90%，在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的植物內(nèi)生真菌中，優(yōu)勢菌門多為子囊菌門，子囊菌門在不同組織中占比不同，可能與種屬特異性有關(guān)。在屬水平上，根際土壤真菌群落中被孢霉屬占比較高（13.5%），被孢霉屬為腐生真菌，在秸稈分解和土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用（寧琪等，2022）。子囊菌門未分類屬和痂囊腔菌屬主要為植物致病菌，在葉片和莖稈等生長旺盛的組織中占比較高。通過聚類熱圖分析，黑老虎根樣品和根際土樣品的真菌群落結(jié)構(gòu)更相似，而莖和葉樣品的真菌群落結(jié)構(gòu)相近。土壤蘊(yùn)含著豐富的微生物多樣性，根與土壤長期直接接觸，土壤真菌與根內(nèi)生真菌相互影響，可能是造成真菌群落結(jié)構(gòu)更為相近的原因（Ren et al.， 2019）。葉片和莖稈與土壤接觸較少且發(fā)育來源更為相似，可能是兩者內(nèi)生真菌結(jié)構(gòu)更為類似的原因。

對黑老虎內(nèi)生真菌和根際土壤真菌群落進(jìn)行多樣性分析，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌和根際土壤真菌群落存在豐富的多樣性，其中根際真菌群落的豐度和多樣性顯著高于各組織的內(nèi)生真菌，研究結(jié)果與很多藥用植物的根際真菌和組織內(nèi)生真菌類似。王艷等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，重樓根際及內(nèi)生真菌多樣性的關(guān)系為根際土＞根莖＞根；周婕等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，紫莖澤蘭根、莖、鮮葉、腐葉之間內(nèi)生真菌群落組成差異明顯， 具有組織特異性，根際土壤與根內(nèi)生真菌群落組成存在一定程度的相似。

黑老虎是傳統(tǒng)中藥材，根、莖等藥用部位富含木脂素類、三萜類、花色苷等藥用成分（舒永志等，2012），果實(shí)中富含酚酸、黃酮、氨基酸（Yang et al.， 2020）。從黑老虎中分離的內(nèi)生真菌報(bào)道較少，而從五味子科藥材中分離到一些具有抗氧化、拮抗植物病原菌、轉(zhuǎn)化次級代謝物等功能的內(nèi)生菌，從已報(bào)道的五味子科中分離的內(nèi)生菌來看，主要有二形傘形屬 （Umbelopsis）和青霉屬（Penicillium）真菌等A. 營養(yǎng)型分類； B. Guild詳細(xì)分類。

（Wang et al.， 2017; 毛瑞華和竇智，2019；Qin et al.， 2019；Song et al.， 2021），這幾個(gè)真菌屬在本研究的組織中均有檢出，表明黑老虎與五味子同科植物中的內(nèi)生真菌群落具有一定程度的相似性，可以借鑒五味子科內(nèi)生真菌信息，發(fā)掘黑老虎中與次生代謝有關(guān)的內(nèi)生真菌。

本研究FUNGuild功能預(yù)測結(jié)果顯示，葉中未知功能群占比相對較少，根際土、根和莖中未知真菌菌群較多，表明黑老虎根際土和根、莖組織中有大量未知的功能菌群，還有待進(jìn)一步發(fā)掘。黑老虎根際土和組織中，病理寄生型（pathotroph）功能群較高，可能是因?yàn)楹诶匣槌＞G植物，葉和莖常年接觸外界空氣，此外莖和葉組織中營養(yǎng)物質(zhì)含量較高，可能是造成病理寄生型真菌占比較高的原因，這與譙利軍等（2018）報(bào)道的莖和葉組織病理寄生型功能群較高一致。根際土壤中，腐生型（saprotroph，10.2%）、病理寄生-腐生-共生型（pathotroph-saprotroph-symbiotroph，12.7%）、腐生-共生型（saprotroph-symbiotroph，13.9%）這3種類型功能菌群超過10%，腐生型功能菌群占比較高可能是因?yàn)楦H土壤中腐生真菌的種類繁多，根際土中存在腐生型功能菌群的機(jī)會更多（寧琪等，2021）。腐生真菌可以產(chǎn)生一系列水解酶和氧化酶，有助于碳水化合物的分解，與有機(jī)物分解和養(yǎng)分循環(huán)密切相關(guān) （梁元存等，2003） 。根中超過10%的功能菌群有腐生-共生型（saprotroph-symbiotroph，17.8%）和病理寄生-腐生型（pathotroph-saprotroph，17.2%）兩種，可能是根與土壤長期密切接觸，腐生真菌進(jìn)入根內(nèi)成為內(nèi)生真菌的機(jī)會更多（周婕等，2019）。莖和葉中的優(yōu)勢功能類群分布不同，可能是植物內(nèi)生真菌在不同組織中發(fā)揮了不同功能。隨著真菌功能的進(jìn)一步發(fā)掘，黑老虎內(nèi)生真菌和根際土真菌的功能將會進(jìn)一步明確。

參考文獻(xiàn)：

BOLYEN E， RIDEOUT JR， DILLON MR， et al.， 2019. Reproducible， interactive， scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2 ［J］. Nat Biotechnol， 37（8）： 852-857.

CHEN DW， JIA YL， HOU QZ， et al.， 2021. Analysis of endophyte diversity of Rheum palmatum from different production areas in Gansu Province of China and the association with secondary metabolite ［J］. Microorganisms， 9（5）： 978.

FAN RF， WANG RF， DU YQ， et al.， 2021. Community composition and ecological function of rhizosphere fungi and medicinal parts endophytic fungi in Polygonatum sibiricum ［J］. Guihaia， 41（5）： 799-807. ［樊銳鋒， 王若凡， 杜艷秋， 等， 2021. 黃精根際及藥用部位內(nèi)生真菌群落組成和生態(tài)功能分析 ［J］. 廣西植物， 41（5）： 799-807.］

FUCHS B， KRISCHKE M， MUELLER MJ， et al.， 2017. Plant age and seasonal timing determine endophyte growth and alkaloid biosynthesis ［J］. Fungal Ecol， 29： 52-58.

GAO JF， ZHOU W， LIU N， 2022. Differential analysis of phenolic acids from different parts of Kadsura coccinea ［J］. J Chin Med Mat， 45（2）： 351-358. ［高漸飛， 周瑋， 劉妮， 2022. 黑老虎不同部位酚酸類成分差異分析 ［J］. 中藥材， 45（2）： 351-358.］

JIANG LC， WEI JM， BAI SS， et al.， 2020. Characteristics of rhizosphere soil fungi community of Schisandra sphenanthera Rehd. Et Wils. ［J］. J Yanan Univ （Nat Sci Ed）， 39（4）： 15-20. ［江林春， 韋潔敏， 白尚尚， 等， 2020. 華中五味子根際土壤真菌群落特征研究 ［J］ . 延安大學(xué)學(xué)報(bào) （自然科學(xué)版）， 39（4）： 15-20.］

JURI C＇ S， STRACENSKI KS， KRL-KILI N＇ SKA? Z·， et al.， 2020. The enhancement of plant secondary metabolites content in Lactuca sativa L. by encapsulated bioactive agents ［J］. Sci Rep， 10（1）： 3737.

KHAN AL， HAMAYUN M， KANG SM， et al.， 2012. Endophytic fungal association via gibberellins and indole acetic acid can improve plant growth under abiotic stress： an example of Paecilomyces formosus LHL10 ［J］. BMC Microbiol， 12： 3.

LIANG YC， LIU YR， WANG YJ， et al.， 2003. Pathogenicity differentiation of Phytophthora parasitica and the disease resistance difference of tobacco against black shank ［J］. Acta Phytophy Sin， 30（2）： 143-147. ［梁元存， 劉延榮， 王玉軍， 等， 2003. 煙草黑脛病菌致病性分化和煙草品種的抗病性差異 ［J］. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 30（2）： 143-147.］

LIN Q， YANG ZR， 2007. A preliminary revision of taxonomic system of Schisandra （Schisandraceae） ［J］. Bull Bot Res， 27（1）： 6-15. ［林祁， 楊志榮， 2007. 五味子屬（ 五味子科） 分類系統(tǒng)的初步修訂 ［J］. 植物研究， 27（1）： 6-15.］

LIU T， WEI Q， WU XB， et al.， 2009. Research status and development and utilization prospect of wild fruit species Kadsura coccinea （Lem.） A.C.Smith ［J］. J Anhui Agric Sci， 37（23）： 10971-10972. ［劉濤， 韋茜， 吳小波， 等， 2009. 野生水果黑老虎的研究現(xiàn)狀及開發(fā)利用前景 ［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 37（23）： 10971-10972.］

LIU YB， YANG YP， TASNEEM S， et al.， 2018. Lignans from Tujia ethnomedicine heilaohu： chemical characterization and evaluation of their cytotoxicity and antioxidant activities ［J］. Molecules， 23（9）： 2147.

MAO RH， DOU Z， 2019. Chemical constituents of the fermentation broth of the endophytic fungi from fibrous roots of the Schisandra glaucescens Diels ［J］. World Latest Med Inf （Electron Ver）， 19（76）： 221-222. ［毛瑞華， 竇智， 2019. 金山五味子須根部位內(nèi)生真菌FR-1次生代謝產(chǎn)物研究 ［J］. 世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘， 19（76）： 221-222.］

NGUYEN NH， SONG ZW， BSTES ST， et al.， 2016. FUNGuild： an open annotation tool for parsing fungal community datasets by ecological guild ［J］. Fungal Ecol， 20： 241-248.

NING Q， CHEN L， LI F， et al.， 2022. Effects of Mortierella on nutrient availability and straw decomposition in soil ［J］. Acta Pedol Sin， 59（1）： 206-217. ［寧琪， 陳林， 李芳， 等， 2022. 被孢霉對土壤養(yǎng)分有效性和秸稈降解的影響 ［J］. 土壤學(xué)報(bào)， 59（1）： 206-217.］

PAN ZY， FU JF， ZHOU RJ， et al.， 2007. Preliminary study of soil fungi in Schisandra chinensis garden and screening antagonism strains ［J］. J Jilin Agric Univ， 29（6）： 636-639. ［潘爭艷， 傅俊范， 周如軍， 等， 2007. 五味子園根際真菌多樣性初探及拮抗菌株篩選 ［J］. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 29（6）： 636-639.］

PORRAS-ALFARO A， BAYMAN P， 2011. Hidden fungi， emergent properties： endophytes and microbiomes ［J］. Ann Rev Phytopathol， 49（1）： 291-315.

QIAO LJ， ZHOU SX， WEN TC， et al.， 2018.Diversity of endophytic fungi from Nothapodytes pittosporoides in Guizhou Province ［J］. Mycosystema， 37（1）： 43-51. ［譙利軍， 周思旋， 文庭池， 等， 2018. 貴州馬比木內(nèi)生真菌的多樣性研究 ［J］. 菌物學(xué)報(bào)， 37（1）： 43-51.］

QIN D， SHEN WY， GAO TC， et al.， 2020. Kadanguslactones A-E， further oxygenated terpenoids from Kadsura angustifolia fermented by a symbiotic endophytic fungus， Penicillium ochrochloron SWUKD4.1850 ［J］. Phyto-chemistry， 174： 112335.

QIN D， SHEN WY， WANG JQ， et al.， 2019. Enhanced production of unusual triterpenoids from Kadsura angustifolia fermented by a symbiont endophytic fungus， Penicillium sp. SWUKD4.1850 ［J］. Phytochemistry， 158： 56-66.

REN F， DONG W， YAN DH， 2019. Organs， cultivars， soil， and fruit properties affect structure of endophytic mycobiota of Pinggu peach trees ［J］. Microorganisms， 7（9）： 322.

RODRIGUEZ RJ， WHITE JF， AENOLD AE， et al.， 2009. Fungal endophytes： diversity and functional roles ［J］. New Phytol， 182： 314-330.

SHU YZ， CHENG L， CHO JC， et al.， 2012. Chemical constituents in roots and vine stems of Kadsura coccinea ［J］. Chin Trad Herb Drugs， 43（3）： 428-431. ［舒永志， 成亮， 曺濬喆， 等， 2012. 黑老虎的化學(xué)成分研究 ［J］. 中草藥， 43（3）： 428-431.］

SONG HC， QIN D， LIU HY， et al.， 2021. Resorcylic acid lactones produced by an endophytic Penicillium ochrochloron strain from Kadsura angustifolia ［J］. Planta Med， 87（3）： 225-235.

SUN J， YAO J， HUANG SX， 2009. Antioxidant activity of polyphenol and anthocyanin extracts from fruits of Kadsura coccinea （Lem.） A.C. Smith ［J］. Food Chem， 117（2）： 276-281.

WANG L， QIN D， ZHANG K， et al.， 2017. Metabolites from the co-culture of nigranoic acid and Umbelopsis dimorpha SWUKD3.1410， an endophytic fungus from Kadsura angustifolia ［J］. Nat Prod Res， 31（12）： 1414-1421.

WANG N， LI ZL， SONG DD， et al.， 2012. Five new 3，4-seco-lanostane-type triterpenoids with antiproliferative activity in human leukemia cells isolated from the roots of Kadsura coccinea ［J］. Planta Med， 78（15）： 1661-1666.

WANG Y， CHANG F， CHENG HY， et al.， 2019. Fungal diversity and differential analysis of fungi community composition in Paris polyphylla var. chinensis rhizosphere and endophytic ［J］. Chin Trad Herb Drugs， 50（5）： 1232-1237. ［王艷， 常帆， 程虎印， 等， 2019. 重樓根際及藥用部位內(nèi)生真菌多樣性與群落結(jié)構(gòu)差異分析 ［J］. 中草藥， 50（5）： 1232-1237.］

YANG J， DONG CB， ZHANG ZY， et al.， 2019. Analyses on fungal community composition of Eucommia ulmoides rhizosphere soil in different areas ［J］. Mycosystema， 38（3）： 327-340. ［楊娟， 董醇波， 張芝元， 等， 2019. 不同產(chǎn)地杜仲根際土真菌群落結(jié)構(gòu)的差異性分析 ［J］ . 菌物學(xué)報(bào)， 38（3）： 327-340.］

YANG YP， HUSSAIN N， ZHANG L， et al.， 2020. Kadsura coccinea： a rich source of structurally diverse and biologically important compounds ［J］. Chin Herb Med， 12（3）： 214-223.

ZENG JF， 1996. Southern Schisandra ［M］// Flora Reipublicae Polularis Sinicae. Beijing： Science Press： 23. ［曾建飛， 1996. 南五味子屬 ［M］∥中國植物志. 北京： 科學(xué)出版社： 23.］

ZHANG YQ， WEN XS， WANG YM， et al.， 2020. Isolation and identification of endophytic fungi from Schisandra chinensis seeds and bacteriostasis study ［J］. Chin Med Mat， 43（5）： 1087-1091. ［張譽(yù)薺， 文湘穗， 王雨濛， 等， 2020. 種子內(nèi)生真菌的分離鑒定及抑菌性研究 ［J］. 中藥材， 43（5）： 1087-1091.］

ZHANG YQ， XU YH， WEN XS， et al.， 2021. Response surface methodology for optimizing fermentation process of the endophytic fungus Purpureocillium lilacinum WG9 preventing Schisandra chinensis brown spot disease ［J］. Mycosystema， 40（6）： 1561-1574. ［張譽(yù)薺， 許永華， 文湘穗， 等， 2021. 響應(yīng)面法優(yōu)化北五味子褐斑病內(nèi)生生防真菌淡紫擬青霉WG9發(fā)酵工藝及發(fā)酵產(chǎn)物穩(wěn)定性研究 ［J］ . 菌物學(xué)報(bào)， 40（6）： 1561-1574.］

ZHAO LF，LIANG ZH， 2019. The research advance on gardening of Kadsura coccinea fruit ［J］. Mod Hortic， 3（6）： 109-110. ［趙林峰， 梁忠厚， 2019. 黑老虎在居室園藝中的應(yīng)用探究進(jìn)展 ［J］. 現(xiàn)代園藝， 93（6）： 109-110.］

ZHAO QJ， SONG Y， CHEN HS， et al.， 2014. Cytotoxic dibenzocyclooctadiene lignans from Kadsura coccinea ［J］. Arch Pharm Res， 37（11）： 1375-1379.

ZHAO TM， MA C， ZHU G， 2021. Chemical composition and biological activities of essential oils from the leaves， stems， and roots of Kadsura coccinea ［J］. Molecules， 26（20）： 6259.

ZHAO Y， QIN Y， LI N， et al.， 2015. Screening and identification of endophytic fungi from Schisandra chinensis with antioxidant activity ［J］. Chin Pharm， 26（31）： 4384-4388. ［趙玥， 秦源， 李娜， 等， 2015. 具有抗氧化活性的北五味子內(nèi)生真菌的篩選及鑒定 ［J］. 中國藥房， 26（31）： 4384-4388.］

ZHOU J， MIAO YF， FANG K， et al.， 2019. Diversity of the endophytic and rhizosphere soil fungi of Ageratina adenophora ［J］. Ecol Sci， 38（5）： 1-7. ［周婕， 苗一方， 方楷， 等， 2019. 紫莖澤蘭內(nèi)生真菌及其根際土壤真菌的多樣性研究 ［J］. 生態(tài)科學(xué)， 38（5）： 1-7.］

（責(zé)任編輯 蔣巧媛 鄧斯麗）