加味葛根芩連湯對糖尿病db/db小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及胰島素抵抗的影響

王佳慧 ，柳榮 ，郝民琦 ，朱向東 ，梁永林

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004

糖尿病是一種嚴重的慢性代謝性疾病，患病人數(shù)呈逐年上升趨勢，其中80%患者為2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）[1]。胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是T2DM發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，與T2DM發(fā)展密切相關(guān)[2]。肝臟為胰島素作用的重要靶器官，改善肝臟IR被認為是緩解T2DM的重要途徑[3]。研究顯示，IR可通過多種途徑破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS），ERS的發(fā)生又進一步加重IR[4]。當ERS持續(xù)發(fā)生時，肌醇需求酶1（IRE1）作為ERS 的主要標志物被激活，并啟動下游c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號通路[5]?；罨腏NK1/2可促進下游胰島素受體底物1（IRS1）磷酸化，IRS1作為重要的胰島素信號傳導(dǎo)蛋白，與脂質(zhì)代謝及IR有關(guān)[6-7]，下調(diào)JNK信號通路表達可抑制肥胖誘導(dǎo)的IR[8]。葛根芩連湯出自《傷寒論》，用于治療濕熱引起的腹瀉、痢疾等。研究發(fā)現(xiàn)，葛根芩連湯能改善T2DM，可能與降低氧化應(yīng)激水平、調(diào)節(jié)細胞因子表達有關(guān)[9-10]。本實驗從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路IRE1/JNK/IRS1 探究加味葛根芩連湯緩解T2DM小鼠IR的作用機制，為其治療T2DM提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

7周齡SPF級雄性db/db小鼠65只、雄性m/m小鼠13只，常州卡文斯實驗動物有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（蘇）2016-0010。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級屏障實驗室，溫度21～25 ℃，相對濕度50%～60%，12 h/12 h明暗交替，自由攝食飲水。本實驗經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會審批（2020-274）。

1.2 藥物及制備

加味葛根芩連湯（葛根、黃芩、黃連、炙甘草、干姜），飲片購于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。上述飲片按8∶3∶3∶2∶0.5比例配伍，加入8倍量蒸餾水浸泡30 min，葛根先煎30 min，再與其余藥物共煎30 min，過濾，殘渣加8倍量蒸餾水繼續(xù)煎煮30 min，合并2次濾液，濃縮成含原藥材2 g/mL藥液，分裝，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。鹽酸二甲雙胍片，上海賢鼎生物科技有限公司，0.25 g/片，批號YKCFZOB，使用時用蒸餾水配制成0.01 g/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

Trizol，日本Takara 公司，批號AJF1817A；5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液、10×電轉(zhuǎn)液、牛血清白蛋白、吐溫-20、改良油紅O染色液、HE染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司，批號分別為T1070-500、D1060、424T053、1121S014、G1261、G1120；p-JNK 抗體、JNK 抗體，美國Immunoway 公司，批號分別為YP0157、YT2440；IRS1抗體、p-IRS1抗體、β-actin抗體、山羊抗兔IgG（H+L）二抗，英國Affinity公司，批號分別為Ab-AF6273、Ab-AF7150、Ab-AF7018、HRP-S001；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒、TRIeasy，上海翌圣生物科技有限公司，貨號分別為11141-C、11202ES08、10606ES60；空腹胰島素（FINS）、游離脂肪酸（FFA）ELISA試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號分別為202111、202111。JXFSTPRP-24L全自動樣品快速研磨儀，上海凈信公司；RS232C型微量核酸測定儀，德國Eppendorf公司；ABI-9700PCR擴增儀，美國Applied BioSystems公司；Advantage型血糖儀，德國羅氏公司；A1Cnow+糖化血紅蛋白儀，三諾生物傳感股份有限公司；ME203E/02型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；D3024R型大龍臺式高速冷凍離心機，廣州深華公司；Epoch 型酶標儀，美國Bio Tek 公司；Chemray 240、Chemray 800型全自動生化分析儀，深圳雷杜生命科技公司。

2 實驗方法

2.1 分組及給藥

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后檢測空腹血糖（FBG），將FBG≥11.1 mmol/L db/db小鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組和加味葛根芩連湯低、中、高劑量組，每組13只。13只m/m小鼠作為空白組。各組均采用普通飼料喂養(yǎng)，加味葛根芩連湯低、中、高劑量組按70 kg成人每日臨床用量的3、9、15倍[9]并參照人與動物體表面積計算小鼠等效劑量，分別予6.4、19.1、31.9 g/kg加味葛根芩連湯灌胃，二甲雙胍組予0.2 g/kg二甲雙胍溶液灌胃，空白組和模型組予等量蒸餾水灌胃，每日1 次，連續(xù)12周。

2.2 取材

給藥結(jié)束后，小鼠禁食不禁水過夜，摘眼球取血，常溫靜置后4 ℃、3 500 r/min離心10 min，分離血清，EP管分裝后置于-80 ℃冰箱凍存。迅速分離完整肝臟，預(yù)冷生理鹽水清洗，濾紙吸干水分，取部分肝組織于4%多聚甲醛溶液中固定，用于病理形態(tài)觀察，剩余肝組織放入凍存管內(nèi)，于液氮中冷凍，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

2.3 體質(zhì)量檢測

給藥結(jié)束后，小鼠禁食不禁水12 h，稱量體質(zhì)量。

2.4 血糖及血脂相關(guān)指標檢測

給藥結(jié)束后，小鼠禁食不禁水12 h，尾靜脈采血，使用血糖儀檢測FPG，使用糖化血紅蛋白儀檢測糖化血紅蛋白（HbA1c）。ELISA 檢測血清FINS、FFA 含量。全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）含量。

2.5 HE染色

肝組織于4%多聚甲醛溶液中固定后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋、切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木素染細胞核，伊紅染細胞質(zhì)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察肝組織病理變化。

2.6 油紅O染色

從液氮中取出肝組織，蒸餾水充分洗滌，油紅O稀釋液避光染色10～15 min，60%乙醇鏡下分化至間質(zhì)清晰，水洗。蘇木素復(fù)染，水洗，甘油明膠封片，顯微鏡下觀察肝組織脂質(zhì)蓄積情況。

2.7 Western blot檢測

取肝組織剪碎，置于EP管中，預(yù)冷PBS漂洗2次，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），高通量冷凍組織研磨器研磨后，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA蛋白定量試劑盒進行定量分析后上樣，蛋白經(jīng)電泳分離，轉(zhuǎn)膜，加牛血清白蛋白于室溫輕搖封閉，TBST洗膜3次，加入IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK、IRS1、p-IRS1 一抗（均為1∶1 000）和β-actin一抗（1∶5 000），室溫輕搖1 h后放入4 ℃冰箱過夜。次日復(fù)溫30 min，TBST洗膜8 min×4 次，加入二抗（1∶5 000），37 ℃輕搖2 h，TBST洗膜，ECL顯色后曝光。采用Image J 1.8.0軟件進行分析，以β-actin為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達量。

2.8 RT-qPCR檢測

采用Trizol法提取肝組織總RNA，微量分光光度計測定OD值，計算RNA純度及濃度。將總RNA反轉(zhuǎn)錄為互補cDNA，反應(yīng)條件：42 ℃、2 min，24 ℃、5 min，55 ℃、15 min，85 ℃、5 min，1個循環(huán)。擴增程序為兩步法，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸30 s。以GAPDH 為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，符合正態(tài)分布組間比較用方差分析，方差不齊用秩和檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 加味葛根芩連湯對模型小鼠體質(zhì)量的影響

與空白組比較，模型組模型小鼠體質(zhì)量顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組和加味葛根芩連湯中、高劑量組小鼠體質(zhì)量顯著減少（P＜0.01）。見表2。

表2 各組小鼠體質(zhì)量比較（±s，g）

表2 各組小鼠體質(zhì)量比較（±s，g）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與二甲雙胍組比較，△△P＜0.01

體質(zhì)量24.09±0.87 52.08±2.83##45.35±1.59**49.32±1.81△△47.41±2.40**46.02±1.55**組別空白組模型組二甲雙胍組加味葛根芩連湯低劑量組加味葛根芩連湯中劑量組加味葛根芩連湯高劑量組只數(shù)13 13 13 13 13 13劑量/（g/kg）0.2 6.4 19.1 31.9

4.2 加味葛根芩連湯對模型小鼠血糖及血脂相關(guān)指標水平的影響

與空白組比較，模型組小鼠FPG、HbA1c、FINS、FFA、TC、TG水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組和加味葛根芩連湯高劑量組小鼠FPG、HbA1c、FINS、FFA、TC、TG 水平顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠FPG、HbA1c、FINS、FFA、TC、TG水平比較（±s）

表3 各組小鼠FPG、HbA1c、FINS、FFA、TC、TG水平比較（±s）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與二甲雙胍組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別空白組模型組二甲雙胍組加味葛根芩連湯低劑量組加味葛根芩連湯中劑量組加味葛根芩連湯高劑量組TG/（mmol/L）1.42±0.48 4.89±0.58##1.65±0.51**4.16±0.46△△2.24±0.98**1.92±0.56**只數(shù)13 13 13 13 13 13劑量/（g/kg）0.2 6.4 19.1 31.9 FPG/（mmol/L）6.78±1.03 32.34±0.61##27.61±1.93**31.13±1.01△△30.01±1.33*△28.14±2.07**HbA1c/%4.34±0.20 12.04±0.80##6.92±0.62**11.01±1.81△△10.23±0.79**△△8.62±1.21**△FINS/（pmol/L）177.01±11.40 244.72±24.16##292.99±19.67**255.83±17.86△△266.94±23.32△270.07±31.83*△FFA/（μmol/L）540.00± 125.5 923.33±176.60##590.00±138.30**862.92±178.50△754.58±171.10 629.58±169.40*TC/（mmol/L）1.99±0.19 4.09±0.53##2.81±0.25**3.93±0.95△△3.50±0.23 2.98±0.30**

4.3 加味葛根芩連湯對模型小鼠肝組織病理變化的影響

HE染色結(jié)果顯示，空白組小鼠肝組織染色均勻，組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，細胞排列整齊；模型組小鼠肝損傷嚴重，細胞排列紊亂，組織結(jié)構(gòu)破壞；與模型組比較，其余給藥組小鼠肝組織損傷均有減輕，以二甲雙胍組效果最顯著，加味葛根芩連湯高劑量組效果與二甲雙胍組接近。見圖1。

圖1 各組小鼠肝組織形態(tài)（HE染色）

4.4 加味葛根芩連湯對模型小鼠肝組織脂質(zhì)蓄積的影響

油紅O染色結(jié)果顯示，空白組小鼠肝組織染色清晰，細胞核呈藍色，細胞內(nèi)未出現(xiàn)紅色脂滴；模型組小鼠肝組織有大量脂滴；與模型組比較，各給藥組小鼠肝組織脂質(zhì)蓄積情況均有改善，隨著加味葛根芩連湯給藥劑量增加，脂質(zhì)蓄積顯著減少，以二甲雙胍組和加味葛根芩連湯高劑量組效果最顯著，與空白組接近。見圖2。

圖2 各組小鼠肝組織脂質(zhì)蓄積（油紅O染色，標尺=25 μm）

4.5 加味葛根芩連湯對模型小鼠肝組織蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組小鼠肝組織IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK蛋白表達顯著升高，IRS1、p-IRS1蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠肝組織IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK蛋白表達顯著降低，IRS1、p-IRS1蛋白表達顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與二甲雙胍組比較，加味葛根芩連湯低、中劑量組小鼠肝組織IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK蛋白表達顯著升高，IRS1、p-IRS1 蛋白表達顯著降低（P＜0.01）。見圖3、表4。

圖3 各組小鼠肝組織IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK、IRS1、p-IRS1蛋白免疫印跡

表4 各組小鼠肝組織IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK、IRS1、p-IRS1蛋白表達比較（±s）

表4 各組小鼠肝組織IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK、IRS1、p-IRS1蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與二甲雙胍組比較，△△P＜0.01

組別空白組模型組二甲雙胍組加味葛根芩連湯低劑量組加味葛根芩連湯中劑量組加味葛根芩連湯高劑量組p-IRS1 1.29±0.11 0.47±0.07##1.11±0.09**0.71±0.08**△△0.81±0.05**△△1.04±0.08**只數(shù)劑量/（g/kg）888888 0.2 6.4 19.1 31.9 IRE1 0.25±0.02 0.88±0.06##0.33±0.05**0.64±0.06**△△0.55±0.07**△△0.46±0.05**△△p-IRE1 0.36±0.03 1.15±0.08##0.41±0.04**0.67±0.05**△△0.49±0.05**0.37±0.04**JNK 0.23±0.02 0.86±0.04##0.37±0.05**0.69±0.06**△△0.62±0.08**△△0.46±0.03**p-JNK 0.77±0.13 1.72±0.12##0.87±0.06**1.44±0.12**△△1.13±0.10**△△0.95±0.12**IRS1 2.63±0.24 1.34±0.07##2.21±0.24**1.62±0.09*△△1.70±0.10**△△2.16±0.12**

4.6 加味葛根芩連湯對模型小鼠肝組織mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組小鼠肝組織IRE1、JNK mRNA表達顯著升高，IRS1 mRNA表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠肝組織IRE1、JNK mRNA表達顯著降低（P＜0.01），二甲雙胍組和加味葛根芩連湯高劑量組小鼠肝組織IRS1 mRNA表達顯著升高（P＜0.05）。見表5。

表5 各組小鼠肝組織IRE1、JNK、IRS1 mRNA表達比較（±s）

表5 各組小鼠肝組織IRE1、JNK、IRS1 mRNA表達比較（±s）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與二甲雙胍組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

IRS1 1.02±0.20 0.12±0.04##0.66±0.13**0.24±0.05△△0.35±0.03△0.44±0.09*組別空白組模型組二甲雙胍組加味葛根芩連湯低劑量組加味葛根芩連湯中劑量組加味葛根芩連湯高劑量組只數(shù)劑量/（g/kg）888888 0.2 6.4 19.1 31.9 IRE1 1.00±0.03 24.31±0.76##1.87±0.06**14.84±5.07**△△5.29±1.01**3.58±0.22**JNK 1.11±0.52 7.20±0.49##1.47±0.15**4.58±1.20**△△2.67±0.21**1.49±0.28**

5 討論

葛根芩連湯中葛根辛甘性涼，入脾胃經(jīng)，既升陽止瀉、生津止渴，又解表退熱，為君藥；黃連、黃芩清熱燥濕、厚腸止痢、瀉火解毒，為臣藥；甘草甘緩和中，調(diào)和諸藥，為佐使藥。臨床為避免苦寒傷胃，常佐以辛溫之干姜制其苦寒之性[11]?，F(xiàn)代對葛根芩連湯的應(yīng)用并不局限于胃腸疾病，已被廣泛用于糖尿病[9]、急性肺損傷[12]、高尿酸血癥[13]等多種疾病研究及臨床。

T2DM與代謝過程失調(diào)相關(guān)，顯著特點為血糖異常升高。IR是胰島素靶向組織對胰島素產(chǎn)生抑制或延遲反應(yīng)的狀態(tài)，被認為是代謝綜合征、非酒精性脂肪性肝病、動脈粥樣硬化和T2DM等多種疾病的致病因素[14]。IR主要由細胞信號傳導(dǎo)異?；虬ㄖ尽⒏闻K和骨骼肌在內(nèi)的外周組織對葡萄糖攝取受損導(dǎo)致[15]。肝臟作為調(diào)控身體能量代謝的關(guān)鍵器官，參與調(diào)節(jié)糖異生、脂肪生成、線粒體生物生成等多種過程[3]。因此，調(diào)節(jié)肝臟IR是改善T2DM進展的關(guān)鍵途徑。

ERS是發(fā)生IR主要原因[15]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一個巨大的膜狀網(wǎng)絡(luò)，負責蛋白質(zhì)合成、成熟和運輸。在真核細胞中，監(jiān)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)信號傳導(dǎo)主要通過3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相關(guān)蛋白實現(xiàn)，其中包括IRE1。生理狀態(tài)下，IRE1與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）結(jié)合，處于無活性狀態(tài)[16-17]。ERS可激活I(lǐng)RE1，進一步激活下游JNK[18]，JNK表達降低有助于改善肥胖誘導(dǎo)的IR。當胰島素與其受體結(jié)合時，p-IRS1會激活下游信號通路，影響糖原合成，JNK可通過調(diào)節(jié)IRS1磷酸化改善IR[19]。以上說明IRE1/JNK/IRS1信號通路在整個代謝網(wǎng)絡(luò)中起重要作用。瘦素受體缺陷型db/db小鼠是公認的肥胖型糖尿病小鼠模型[20]，本研究從ERS調(diào)控通路出發(fā)，進一步探究加味葛根芩連湯緩解糖尿病模型小鼠IR的作用機制。

與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量、FBG、FINS及HbA1c均顯著增加；各給藥組小鼠體質(zhì)量、FBG、FINS及HbA1c均有改善，以加味葛根芩連湯中、高劑量組和二甲雙胍組最明顯。模型組小鼠血清FFA、TC及TG水平顯著升高，各給藥組小鼠血清FFA、TC及TG水平顯著降低，以二甲雙胍組及加味葛根芩連湯中、高劑量組作用最明顯。HE染色結(jié)果顯示，模型組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)破壞嚴重，且組織內(nèi)有大量脂滴，各給藥組肝組織損傷均有減輕，肝細胞脂質(zhì)蓄積情況有所改善，尤以二甲雙胍組和加味葛根芩連湯高劑量組改善明顯。Western blot和RT-PCR結(jié)果表明，模型組小鼠肝組織IRE1、JNK蛋白和mRNA表達升高，IRS1蛋白和mRNA表達降低，p-IRE1、p-JNK蛋白表達升高，p-IRS1蛋白表達降低；各給藥組小鼠肝組織IRE1、JNK蛋白和mRNA表達降低，IRS1蛋白和mRNA 表達升高，p-IRE1、p-JNK 蛋白表達降低，p-IRS1蛋白表達升高，以加味葛根芩連湯中、高劑量組和二甲雙胍組最明顯。以上結(jié)果表明，加味葛根芩連湯可通過調(diào)控IRE1/JNK/IRS1信號通路減輕小鼠體質(zhì)量，改善糖脂代謝，從而抑制IR，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負荷，對T2DM治療起積極作用。