Oligo-FISH涂染揭示柚粗線(xiàn)期1 號(hào)染色體的結(jié)構(gòu)及配對(duì)

何禮 張國(guó)艷 陳克玲 何建 關(guān)斌 李文婷 劉建軍

摘要：【目的】深化柑橘減數(shù)分裂粗線(xiàn)期染色體結(jié)構(gòu)組成和配對(duì)分析?！痉椒ā渴状卫酶涕偃旧w全長(zhǎng)特異寡核苷酸熒光原位雜交（oligo-fluorescence in situ hybridization，oligo-FISH）涂染探針，精準(zhǔn)示蹤鑒定沙田柚粗線(xiàn)期1 號(hào)染色體的結(jié)構(gòu)特征，比較其與有絲分裂間期細(xì)胞核、有絲分裂前中期和中期染色體的結(jié)構(gòu)差異，并揭示粗線(xiàn)期全長(zhǎng)染色體的同源配對(duì)?！窘Y(jié)果】觀(guān)測(cè)到同源配對(duì)的全長(zhǎng)粗線(xiàn)期與有絲分裂中期較大染色質(zhì)結(jié)構(gòu)差異。經(jīng)測(cè)定，柚粗線(xiàn)期1 號(hào)染色體平均全長(zhǎng)、長(zhǎng)臂長(zhǎng)、短臂長(zhǎng)和臂比分別為中期的13.93 倍、16.54 倍、10.44 倍和1.54 倍，表現(xiàn)出更高FISH 信號(hào)分辨率。檢測(cè)到柚粗線(xiàn)期1 號(hào)染色體著絲粒附近約3.01 Mb的探針信號(hào)缺失區(qū)?！窘Y(jié)論】首次實(shí)現(xiàn)柑橘特定全長(zhǎng)粗線(xiàn)期染色體的跟蹤研究，為深入開(kāi)展其結(jié)構(gòu)和配對(duì)遺傳利用的精準(zhǔn)研究提供了新方法。

關(guān)鍵詞：柑橘；粗線(xiàn)期；寡核苷酸熒光原位雜交；染色體涂染；分辨率

中圖分類(lèi)號(hào)：S666 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）04-0788-09

柑橘是世界上最重要和最廣泛種植的果樹(shù)之一。自然界中柑橘及其近緣種基本為二倍體（2n=2x=18）[1]，近年也創(chuàng)制、篩選并積累了大量柑橘多倍體材料[2]。染色體細(xì)胞遺傳研究不僅是柑橘類(lèi)種屬起源進(jìn)化分析的重要手段[3-4]，更是減數(shù)分裂同源或部分同源染色體配對(duì)遺傳利用研究的直接工具[5-6]，還能夠輔助全基因組測(cè)序的驗(yàn)證[7]。而對(duì)特定單條染色體特別是減數(shù)分裂前期Ⅰ中單條全長(zhǎng)染色體的精準(zhǔn)識(shí)別，是實(shí)現(xiàn)以上研究的關(guān)鍵。

由于缺乏染色體全長(zhǎng)特異的DNA 探針，在大多數(shù)植物中無(wú)法跟蹤研究單條染色體[8-9]。柑橘類(lèi)為小染色體（1～4 μm）物種[10]，已在其有絲分裂中期細(xì)胞上開(kāi)展了廣泛的染色體識(shí)別和比較鑒定，包括利用染色體色霉素A3（chromomycin A3，CMA）熒光顯帶[10-13]，以及綜合CMA顯帶、rDNA、基因組中其他重復(fù)序列[14-15]和染色體特異細(xì)菌人工染色體（bacterial artificial chromosome，BAC）探針標(biāo)記的熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）[16-18]。然而，以上標(biāo)記僅識(shí)別染色體上的特定區(qū)段，無(wú)法跟蹤研究細(xì)胞分裂活動(dòng)，特別是減數(shù)分裂各時(shí)期的單條全長(zhǎng)染色體，例如涉及同源染色體精細(xì)配對(duì)的粗線(xiàn)期染色體，它相較于中期Ⅰ的配對(duì)分析能更準(zhǔn)確評(píng)估染色體的同源性[6，19]。另外，雖已經(jīng)完成部分柑橘種的基因組測(cè)序，但精準(zhǔn)組裝仍受基因組中大量重復(fù)序列的干擾，可利用粗線(xiàn)期染色體高分辨率的FISH輔助基因組的組裝和驗(yàn)證，特別是含有大量重復(fù)序列的著絲粒及附近異染色質(zhì)區(qū)[7]。而中期染色體太小[10]，F(xiàn)ISH 信號(hào)的分辨率極低，難以精準(zhǔn)觀(guān)察測(cè)定。

最近，基于寡核苷酸的新型DNA文庫(kù)已迅速成為“新一代”的植物染色體精準(zhǔn)研究FISH 探針[9，19]。利用生物信息學(xué)手段，實(shí)現(xiàn)了從任何植物物種組裝的基因組序列中，篩選出針對(duì)染色體特定區(qū)域或整個(gè)染色體鑒定的寡核苷酸序列，經(jīng)人工合成后標(biāo)記作為染色體鑒定的特異FISH 探針[19]。利用覆蓋整個(gè)染色體的寡核苷酸探針能夠產(chǎn)生“染色體涂染（chromosome painting）”信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了有絲及減數(shù)分裂中特定單條染色體的精準(zhǔn)追蹤[4-6，19-21]。筆者已在柑橘中研創(chuàng)了所有9 條全長(zhǎng)染色體特異的寡核苷酸涂染探針，準(zhǔn)確鑒定了有絲分裂中期所有染色體[4]。筆者在本研究中旨在利用柑橘1 號(hào)染色體的特異涂染FISH探針，首次進(jìn)行沙田柚減數(shù)分裂粗線(xiàn)期染色體的跟蹤研究；同時(shí)以有絲分裂不同濃縮階段的染色質(zhì)做對(duì)比，揭示粗線(xiàn)期與有絲分裂各時(shí)期染色體結(jié)構(gòu)及FISH信號(hào)分辨率的巨大差異，為精準(zhǔn)解析粗線(xiàn)期染色體結(jié)構(gòu)和特定區(qū)段序列組成，輔助全基因組特別是測(cè)序組裝困難的著絲粒及附近異染色質(zhì)區(qū)的測(cè)序組裝驗(yàn)證提供新工具，也為染色體的配對(duì)遺傳利用，特別是柑橘多倍體減數(shù)分裂粗線(xiàn)期染色體的精準(zhǔn)研究奠定新的方法基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

選取柑橘類(lèi)代表種沙田柚[Citrus maxima（Burm.） Merr.‘Shatian pummelo，2n=2x=18]用作染色體涂染分析。植物材料保存于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所成都試驗(yàn)基地。

1.2 染色體特異涂染探針制備

前期，參照Albert 等[20]的方法開(kāi)發(fā)了柑橘染色體特異涂染探針[4]。利用Chorus2 軟件（https：//github.com/zhangtaolab/Chorus2）從Citrus maxima 的參考基因組中（https：//citrus.hzau.edu.cn/orange/index.php）篩選1 號(hào)染色體上的長(zhǎng)45 個(gè)堿基的單拷貝寡核苷酸。利用Citrus maxima 的基因組序列數(shù)據(jù)（SRR4294213）[22]過(guò)濾重復(fù)寡核苷酸序列。寡核苷酸探針文庫(kù)由Arbor Biosciences（Ann Arbor， 密歇根， 美國(guó)）合成。按照Han 等[19]的方法用地高辛標(biāo)記染色體涂染探針。

1.3 有絲分裂中期染色體制片

以根尖為材料制備有絲分裂中期染色體制片。截取新鮮的根尖在1.10 mPa壓力下用N2O處理2 h，然后在固定液（3 倍乙醇/1 倍冰醋酸）中固定備用。根尖用蒸餾水洗滌10 min 后，用2%（w，后同）纖維素酶（Yakult Pharmaceutical，日本）和1%果膠酶（Sigma，美國(guó)）在37 ℃水浴鍋中酶解140 min。采用滴片法制取有絲分裂中期染色體[4]。

1.4 減數(shù)分裂粗線(xiàn)期染色體制片

以花蕾為材料制取減數(shù)分裂粗線(xiàn)期染色體。選新鮮并未變白的花蕾，用固定液（3 倍乙醇/1 倍冰醋酸）固定備用。用花蕾中的1 個(gè)花藥壓片鏡檢花粉母細(xì)胞是否處于粗線(xiàn)期，其余花藥用作酶解制片?；ㄋ幱谜麴s水洗滌20 min，后用3%纖維素酶（Yakult Pharmaceutical，日本）和2%果膠酶（Sigma，美國(guó)）的酶解液在37 ℃水浴鍋中酶解5 h。采用滴片法制取粗線(xiàn)期染色體[6]。

1.5 寡核苷酸熒光原位雜交（Oligo-FISH）

參照He等[4]的方法開(kāi)展Oligo-FISH和檢測(cè)。雜交液含寡核苷酸探針200 ng，去離子甲酰胺10 μL，50%硫酸葡聚糖4 μL，20×SSC 2 μL，加蒸餾水至20 μL。地高辛標(biāo)記的探針用抗地高辛異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate isomer，F(xiàn)ITC）（Roche Diagnostics，美國(guó)）檢測(cè)。用含4，6-二脒基-2-苯基吲哚（4， 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的VectaShield 抗淬滅劑（Vector Laboratories，美國(guó)）對(duì)染色體進(jìn)行復(fù)染。用蔡司Axio Scope A1 熒光顯微鏡上耦合的電荷耦合器件（charge coupled device，CCD）相機(jī)（ORCA Flash4.0，濱松，日本）拍攝FISH圖像。用Adobe Photoshop 5.0 調(diào)整圖像的亮度和對(duì)比度。

用Image J 軟件測(cè)定中期和粗線(xiàn)期染色體的長(zhǎng)度，并用其中的“Straighten”插件拉直彎曲的粗線(xiàn)期染色體。

2 結(jié)果與分析

2.1 柚有絲分裂中期染色體涂染鑒定

筆者前期利用Chorus2 軟件（https：//github.com/zhangtaolab/Chorus2），以柚基因組DNA 序列開(kāi)發(fā)了柑橘類(lèi)物種所有9 條染色體的特異性涂染探針[4]。為了篩選能夠均勻覆蓋1 號(hào)染色體的寡核苷酸，從1 號(hào)染色體的DNA序列中篩選了27 392 個(gè)長(zhǎng)為45 bp 的單拷貝寡核苷酸序列（寡核苷酸分布密度為0.85 個(gè)·kb-1）作為混合池，用作該染色體鑒定的特異涂染探針。

經(jīng)綠色熒光檢測(cè)，在柚有絲分裂中期細(xì)胞中，能清楚鑒定出1 號(hào)染色體的2 條同源染色體（圖1）。然而，F(xiàn)ISH信號(hào)在1 號(hào)染色體上的分布并不均勻，部分區(qū)域沒(méi)有觀(guān)察到信號(hào)或信號(hào)非常微弱（圖1-B）。這可能是1 號(hào)染色體對(duì)應(yīng)區(qū)域單拷貝寡核苷酸的密度相對(duì)較低（小于0.1 個(gè)·kb-1）引起的。

2.2 間期細(xì)胞核及前中期染色體可視化

為了識(shí)別中期染色體外其他不同分裂階段濃縮的染色質(zhì)，并展現(xiàn)可視化單個(gè)染色體占據(jù)的區(qū)域，利用1 號(hào)染色體特異涂染探針開(kāi)展了FISH（圖2）。對(duì)柚根尖細(xì)胞進(jìn)行FISH涂染，結(jié)果清晰顯示細(xì)胞核中的2 個(gè)同源染色體分別位于獨(dú)立的區(qū)域（圖2-B），且染色質(zhì)呈離散狀態(tài)，濃縮程度極低。前中期細(xì)胞上的探針信號(hào)顯示，每個(gè)同源染色體相較間期時(shí)更濃縮，但相對(duì)中期時(shí)濃縮程度更低。中部無(wú)信號(hào)或信號(hào)微弱的染色體區(qū)段清晰可見(jiàn)（圖2-D，箭頭）。然而，此時(shí)染色體各部位的特征，特別是著絲粒不易辨認(rèn)。試驗(yàn)表明，特異探針涂染能有效示蹤有絲分裂各周期的1 號(hào)染色體。

2.3 減數(shù)分裂粗線(xiàn)期染色體Oligo-FISH涂染

為了精準(zhǔn)示蹤減數(shù)分裂粗線(xiàn)期1 號(hào)染色體，利用特異涂染探針（圖3）進(jìn)行了FISH 標(biāo)記。除著絲粒及緊鄰的亞著絲粒小區(qū)段外，足夠密度的探針信號(hào)將該染色體從末端到末端標(biāo)記了出來(lái)，清晰地展示了粗線(xiàn)期2 條1 號(hào)同源染色體從末端到末端充分配對(duì)的情況。利用探針信號(hào)（圖3-B），清晰展示了減數(shù)分裂粗線(xiàn)期的狀態(tài)，即使在眾多染色體相互纏繞以致幾乎無(wú)法辨認(rèn)其形態(tài)的情況下（圖3-A），也能夠準(zhǔn)確反映特定粗線(xiàn)期染色體在細(xì)胞中的分布及配對(duì)情況，并進(jìn)行精準(zhǔn)跟蹤研究。在15 個(gè)粗線(xiàn)期細(xì)胞中觀(guān)察到，1 號(hào)染色體的2 條同源染色體均表現(xiàn)從末端到末端的完整配對(duì)，展示了它們之間高度的同源性。結(jié)果表明，采用特異探針涂染能精準(zhǔn)有效示蹤粗線(xiàn)期染色體及同源染色體配對(duì)。

經(jīng)DAPI 染色后，著絲粒區(qū)染色淺且兩側(cè)分布DAPI 染色明亮的亞著絲粒異染色質(zhì)區(qū)（圖3-E），染色體臂上的常染色質(zhì)區(qū)染色較淺。短臂上綠色探針信號(hào)覆蓋至非常接近DAPI 染色淺的著絲粒區(qū)（圖3-E）。結(jié)合著絲粒位置及短臂挨著絲粒區(qū)信號(hào)消失的特征，甚至能在眾多相互纏繞的粗線(xiàn)期染色體上定位著絲粒（圖3-A～B箭頭指示），并能據(jù)此準(zhǔn)確測(cè)定染色體臂長(zhǎng)及總長(zhǎng)。測(cè)得15 個(gè)粗線(xiàn)期細(xì)胞1 號(hào)染色體的平均總長(zhǎng)為（27.48±1.89）μm，是有絲分裂中期高度濃縮染色體長(zhǎng)度的13.93 倍（表1）；粗線(xiàn)期長(zhǎng)臂平均長(zhǎng)度為中期長(zhǎng)臂的16.54 倍，高于染色體全長(zhǎng)的倍率，表明粗線(xiàn)期長(zhǎng)臂的伸展程度高于整條染色體的平均值；粗線(xiàn)期短臂長(zhǎng)為中期的10.44 倍，低于染色體全長(zhǎng)的倍率，更低于長(zhǎng)臂的倍率，表明粗線(xiàn)期短臂的伸展程度除低于整條染色體的平均值外，更遠(yuǎn)低于長(zhǎng)臂的伸展程度。

雖在有絲分裂中期和前中期1 號(hào)染色體上能夠觀(guān)察到探針信號(hào)較弱或缺失的區(qū)域，但因染色體濃縮程度較大，分辨率低，導(dǎo)致難以準(zhǔn)確鑒定其所處的區(qū)段。借助涂染探針信號(hào)，在粗線(xiàn)期染色體上清晰觀(guān)察到1 段信號(hào)缺失區(qū)，但在眾多染色體相互纏繞的減數(shù)分裂相中，較難厘清該區(qū)段所處區(qū)域及染色質(zhì)特征（圖3-A～B）。因此，利用涂染探針信號(hào)作指示，選取與其他染色體無(wú)交叉重疊的粗線(xiàn)期1 號(hào)染色體（圖3-D～E），以準(zhǔn)確鑒定整條染色體上常染色質(zhì)和異染色質(zhì)區(qū)的分布特征，以及涂染探針信號(hào)在不同染色質(zhì)區(qū)的精準(zhǔn)分布。用Image J 軟件分離并拉直了圖3-D來(lái)自2 個(gè)細(xì)胞中無(wú)交叉重疊的2 條粗線(xiàn)期1 號(hào)染色體。染色體灰度圖非常清晰地顯示，即使2 條粗線(xiàn)期染色體的濃縮程度存在差異，它們的常染色質(zhì)（DAPI 染色較淺）和異染色質(zhì)（DAPI 染色明亮）分布模式，以及探針信號(hào)在對(duì)應(yīng)位置的覆蓋情況仍極為相似（圖3-E）。短臂絕大多數(shù)區(qū)域?yàn)镈API染色明亮的異染色質(zhì)區(qū)。占長(zhǎng)臂約1/3 長(zhǎng)度且靠近著絲粒區(qū)域?yàn)檩^為集中的異染色質(zhì)區(qū)，余下近端粒段2/3 的長(zhǎng)臂均為DAPI 染色較淺的常染色質(zhì)區(qū)。然而，從細(xì)胞學(xué)的角度認(rèn)為富含重復(fù)序列的異染色質(zhì)區(qū)幾乎均被單拷貝寡核苷酸涂染探針信號(hào)覆蓋，說(shuō)明相應(yīng)區(qū)域仍含有一定比例的單拷貝DNA序列，能夠進(jìn)行基因組組裝。在DAPI 染色最強(qiáng)烈的區(qū)域，探針信號(hào)相對(duì)其他區(qū)域明顯更微弱，如短臂和長(zhǎng)臂上各有1 個(gè)明亮的異染色質(zhì)區(qū)域；在包括著絲粒及長(zhǎng)臂緊鄰著絲粒DAPI 染色明亮的整個(gè)亞著絲粒異染色質(zhì)區(qū)幾乎沒(méi)有任何信號(hào)。

經(jīng)Image J 軟件測(cè)定，粗線(xiàn)期1 號(hào)染色體上連續(xù)無(wú)信號(hào)的著絲粒及緊鄰亞著絲粒區(qū)長(zhǎng)度為（2.36 ±0.34）μm，占染色體總長(zhǎng)的8.58%。由于涂染探針篩選自基因組測(cè)序組裝大小為32.08 Mb的柚1 號(hào)染色體[22]，很可能完全對(duì)應(yīng)探針信號(hào)覆蓋區(qū)域的大小。假定DNA含量在全長(zhǎng)染色體上呈均衡分布，1號(hào)染色體的大小可計(jì)算為32.08 Mb ÷（100%-8.58%）=35.09 Mb，而著絲粒附近信號(hào)缺失區(qū)段的大小為35.09 Mb×8.58%=3.01 Mb。

3 討論

標(biāo)準(zhǔn)的單條染色體鑒定方法可實(shí)現(xiàn)中期染色體及其他不同細(xì)胞分裂階段濃縮染色質(zhì)的識(shí)別。最近的研究利用生物信息學(xué)手段，研發(fā)基于單拷貝寡核苷酸序列的FISH涂染探針，能夠在任何已獲得基因組序列的植物種中應(yīng)用[9，21]，并已在許多植物種中取得成功，包括黃瓜[19]、馬鈴薯[6，23]、水稻[24]和楊樹(shù)[25]等。即使在大基因組的小麥[26]和玉米[20]中也獲得了成功。這相對(duì)于傳統(tǒng)在小基因組模式植物擬南芥和二穗短柄草中采用大量BAC混合池作FISH 涂染探針[27-28]，取得了革命性的進(jìn)步，將極大地提升染色體FISH 涂染在眾多植物種中的應(yīng)用。已有柑橘及多個(gè)相關(guān)種屬完成了全基因組測(cè)序組裝[22，29-30]，可用作該新型染色體精準(zhǔn)鑒定單拷貝FISH 寡核苷酸探針的發(fā)掘。筆者新近研發(fā)了柑橘所有9 條染色體特異的涂染探針[4]，為基于FISH 技術(shù)開(kāi)展豐富的柑橘及相關(guān)種屬間系統(tǒng)精準(zhǔn)染色體結(jié)構(gòu)變異鑒定和進(jìn)化分析提供了有力工具[9，21]。筆者在本研究中利用柑橘1號(hào)染色體特異FISH涂染探針，實(shí)現(xiàn)了在有絲分裂間期細(xì)胞核、前中期和中期細(xì)胞染色體及減數(shù)分裂粗線(xiàn)期染色體和其所在區(qū)域的可視化，可為開(kāi)展柑橘染色體研究及育種利用提供強(qiáng)大工具，開(kāi)拓柑橘染色體結(jié)構(gòu)及特定區(qū)段序列組成精準(zhǔn)研究，特別是柑橘多倍體材料減數(shù)分裂粗線(xiàn)期染色體精準(zhǔn)配對(duì)和遺傳鑒定利用的新領(lǐng)域。

減數(shù)分裂是真核生物生命周期中染色體數(shù)目減少并產(chǎn)生配子的重要且特殊過(guò)程，有效地實(shí)現(xiàn)從末端到末端鑒定單條粗線(xiàn)期染色體，將大力推動(dòng)減數(shù)分裂染色體配對(duì)機(jī)制的精準(zhǔn)研究。前人研創(chuàng)了染色體全長(zhǎng)涂染FISH探針，實(shí)現(xiàn)了玉米1 號(hào)染色體[20]、馬鈴薯7 號(hào)和11 號(hào)染色體[6]、黃瓜3 號(hào)染色體的全長(zhǎng)示蹤[19]，以及不同倍性茄屬物種的粗線(xiàn)期染色體精細(xì)配對(duì)研究[6]。在柑橘中，前人采用的染色體鑒定方法包括CMA顯帶[10-13]，以及結(jié)合CMA顯帶、rDNA、基因組中篩選的其他重復(fù)序列[14- 15]和染色體特異BAC開(kāi)展FISH[16-18]，均無(wú)法對(duì)減數(shù)分裂粗線(xiàn)期特定的全長(zhǎng)染色體進(jìn)行跟蹤研究。筆者在本研究中首次在柑橘粗線(xiàn)期染色體上開(kāi)展FISH實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)了單條全長(zhǎng)粗線(xiàn)期染色體的精準(zhǔn)鑒定，可解決對(duì)柑橘粗線(xiàn)期特定全長(zhǎng)染色體進(jìn)行跟蹤研究的難題。

染色體涂染探針能否有效示蹤鑒定粗線(xiàn)期染色體，與探針設(shè)計(jì)時(shí)染色體上篩選到的寡核苷酸分布密度有關(guān)[9]。在幾個(gè)不同的植物中，染色體上寡核苷酸的密度為0.1～0.5 個(gè)·kb-1時(shí)，足以在濃縮的中期染色體上產(chǎn)生高質(zhì)量的全染色體涂染信號(hào)[9]。但粗線(xiàn)染色體的長(zhǎng)度為體細(xì)胞中期染色體的10～40倍[31]，因此，用涂染探針鑒定減數(shù)分裂粗線(xiàn)染色體，需要采用更高的寡核苷酸密度。1個(gè)密度為2個(gè)·kb-1的水稻9 號(hào)染色體探針在粗線(xiàn)染色體上顯示出良好的信號(hào)[24]。1 個(gè)密度為0.6 個(gè)·kb-1的馬鈴薯11 號(hào)染色體探針足以顯示整個(gè)粗線(xiàn)染色體[6]。玉米1 號(hào)染色體上密度為0.3 個(gè)·kb-1，可基本覆蓋粗線(xiàn)期染色體[20]，但信號(hào)覆蓋的密度明顯更低。本研究中柑橘1號(hào)染色體上寡核苷酸的密度為0.85 個(gè)·kb-1，在粗線(xiàn)期染色體上產(chǎn)生了很好的信號(hào)覆蓋，起到了很好的示蹤效果。涂染探針信號(hào)顯示，粗線(xiàn)期15 個(gè)細(xì)胞中的1 號(hào)染色體均表現(xiàn)從末端到末端的完整配對(duì)，證明2 條同源染色體的同源性高，與測(cè)序報(bào)道柚類(lèi)基因組雜合度低的特征相吻合[29]。

前人研究表明，利用粗線(xiàn)期染色體開(kāi)展FISH定位，可大大提高信號(hào)分辨率。在不同基因組大小的代表性物種中，將粗線(xiàn)期與有絲分裂中期的染色體長(zhǎng)度進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)黑麥中的長(zhǎng)度差異大于7 倍、玉米為10 倍、番茄為15 倍、擬南芥大于20 倍、水稻為40 倍[31]。因此，以高度伸展的粗線(xiàn)期染色體相較于高度收縮的中期染色體作靶標(biāo)，具有高出數(shù)倍的FISH 信號(hào)分辨率[31-32]，是將DNA序列信息與染色體結(jié)構(gòu)特征相結(jié)合極有效的方法，是高分辨率細(xì)胞遺傳圖譜構(gòu)建的強(qiáng)大工具。例如在水稻早粗線(xiàn)期10號(hào)染色體上，可區(qū)分相距40 kb 的DNA 探針信號(hào)[32]。在番茄粗線(xiàn)期染色體常染色質(zhì)區(qū)FISH 定位的分辨率為120 kb，在異染色質(zhì)區(qū)為1.20 Mb[31]。本研究揭示，柑橘粗線(xiàn)期1 號(hào)染色體的平均長(zhǎng)度為中期的13.93 倍，實(shí)現(xiàn)了柑橘粗線(xiàn)期染色體高分辨率的FISH 鑒定，為深入開(kāi)展其結(jié)構(gòu)精準(zhǔn)研究提供了新方法。

本研究中測(cè)算出著絲粒及緊鄰的信號(hào)缺失區(qū)約為3.01 Mb，這在高度收縮的柑橘中期染色體上是極難測(cè)定的。由于著絲粒及附近異染色質(zhì)區(qū)DNA的濃縮程度高于全染色體上的平均值[31]，因此，該區(qū)段實(shí)際應(yīng)大于3.01 Mb。利用著絲粒功能蛋白CENH3 免疫共沉淀測(cè)序，估算1 號(hào)染色體著絲粒區(qū)大小為7.6 Mb，含有大量長(zhǎng)末端重復(fù)序列（long terminalrepeat，LTR）[33]。在基因組測(cè)序組裝時(shí)，很可能由于該區(qū)域富含高度重復(fù)DNA序列而未被當(dāng)前的參考基因組覆蓋，因此未篩選到單拷貝寡核苷酸，表現(xiàn)為探針信號(hào)的缺失。研究結(jié)果顯示著絲粒及其緊鄰異染色質(zhì)的特定區(qū)段無(wú)信號(hào)覆蓋，提示該區(qū)域可能未完全實(shí)現(xiàn)基因組的組裝。

本研究表明高分辨率粗線(xiàn)期染色體FISH 涂染可應(yīng)用于植物的基因組研究，檢查基因組序列組裝的完整性[34]，未來(lái)可用作測(cè)序組裝困難著絲粒和附近異染色質(zhì)區(qū)的輔助驗(yàn)證，以及其他植物細(xì)胞遺傳學(xué)新研究。

4 結(jié)論首次在柑橘上利用染色體全長(zhǎng)特異探針涂染，揭示了粗線(xiàn)期與有絲分裂各時(shí)期染色體結(jié)構(gòu)及FISH 信號(hào)分辨率的巨大差異，為進(jìn)一步探究柑橘減數(shù)分裂其余染色體的結(jié)構(gòu)組成及不同倍性材料中的配對(duì)遺傳利用奠定了新的試驗(yàn)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)References：

[1] NAITHANI S P，RAGHUVANSHI S S. Cytogenetical studies inthe genus Citrus[J]. Nature，1958，181 （4620）：1406-1407.

[2] 郭文武，葉俊麗，鄧秀新. 新中國(guó)果樹(shù)科學(xué)研究70 年：柑橘[J].果樹(shù)學(xué)報(bào)，2019，36（10）：1264-1272.

GUO Wenwu，YE Junli，DENG Xiuxin. Fruit scientific researchin New China in the past 70 years：Citrus[J]. Journal of Fruit Science，2019，36（10）：1264-1272.

[3] GUERRA M，DOS SANTOS K G，BARROS E S A E，EHRENDORFERF J. Heterochromatin banding patterns in Rutaceae-Aurantioideae：A case of parallel chromosomal evolution[J].American Journal of Botany，2000，87（5）：735-747.

[4] HE L，ZHAO H N，HE J，YANG Z J，GUAN B，CHEN K L，HONG Q B，WANG J H，LIU J J，JIANG J M. Extraordinarilyconserved chromosomal synteny of Citrus species revealed bychromosome- specific painting[J]. The Plant Journal，2020，103（6）：2225-2235.

[5] BRAZ G T，YU F，ZHAO H N，DENG Z，BIRCHLER J A，JIANGJ M. Preferential meiotic chromosome pairing among homologouschromosomes with cryptic sequence variation in tetraploidmaize[J]. New Phytologist，2021，229（6）：3294-3302.

[6] HE L，BRAZ G T，TORRES GA，JIANG J M. Chromosome paintingin meiosis reveals pairing of specific chromosomes in polyploidSolanum species[J]. Chromosoma，2018，127（4）：505-513.

[7] WANG K，XIANG D，XIA K，SUN B，KHURSHID H，ESH AM H，ZHANG H. Characterization of repetitive DNA in Saccharumofficinarum and Saccharum spontaneum by genome sequencingand cytological assays[J]. Frontiers in Plant Science，2022，13：814620.

[8] SCHUBERT I，F(xiàn)RANSZ P F，F(xiàn)UCHS J，DE JONG J H. Chromosomepainting in plants[J]. Methods in Cell Science，2021，23（1）：57-69.

[9] JIANG J M. Fluorescence in situ hybridization in plants：Recentdevelopments and future applications[J]. Chromosome Research，2019，27（3）：153-165.

[10] GUERRA M. Cytogenetics of Rutaceae. V. High chromosomalvariability in Citrus species revealed by CMA/DAPI staining[J].Heredity，1993，71 （3）：234-241.

[11] GUERRA M D S. Cytogenetics of Rutaceae. III. heterochromatinpatterns[J]. Caryologia，1985，38（3/4）：335-346.

[12] 梁國(guó)魯. 部分柑桔屬及其近緣屬Giemsa C-帶帶型研究[J]. 遺傳學(xué)報(bào)，1988，15（6）：409-415.

LIANG Guolu. Studies on the Giemsa C- banding patterns ofsome Citrus and its related genera[J]. Acta Genetica Sinica，1988，15（6）：409-415.

[13] 魏文娜，程堯楚，李潤(rùn)唐，段映池. 從染色體核型及Giemsa 顯帶探討柑桔類(lèi)的演化[J]. 園藝學(xué)報(bào)，1988，15（4）：223-228.

WEI Wenna，CHENG Yaochu，LI Runtang，DUAN Yingchi.Studies on the evolution of Citrus based on karyotype and Giem- sa C-banding patterns[J]. Acta Horticulturae Sinica，1988，15（4）：223-228.

[14] DENG H H，XIANG S Q，GUO Q G，JIN W，CAI Z，LIANG G.Molecular cytogenetic analysis of genome-specific repetitive elementsin Citrus clementina Hort. Ex Tan. and its taxonomic implications[J]. BMC Plant Biology，2019，19（1）：77.

[15] YU C X，DENG X X，CHEN C L. Chromosomal characterizationof a potential model mini- Citrus （Fortunella hindsii） [J].Tree Genetics & Genomes，2019，15（5）：1-10.

[16] MENDES S，MORAES A P，MIRKOV T E，PEDROSAHARANDA. Chromosome homeologies and high variation inheterochromatin distribution between Citrus L. and PoncirusRaf. as evidenced by comparative cytogenetic mapping[J]. ChromosomeResearch，2011，19（4）：521-530.

[17] DA COSTA SILVA S，MENDES S，R?GIS T，PASSOS O S，F(xiàn)ILHO W D S S，PEDROSA-HARAND A. Cytogenetic map ofpummelo and chromosome evolution of true Citrus species andthe hybrid sweet orange[J]. Journal of Agricultural Science，2019，11（14）：148.

[18] COSTA S S，MARQUES A，SANTOS S F W，MIRKOV T E，PEDROSA-HARAND A，GUERRA M. The cytogenetic map ofthe Poncirus trifoliata （L.） Raf.：A nomenclature system forchromosomes of all citric species[J]. Tropical Plant Biology，2011，4（2）：99-105.

[19] HAN Y H，ZHANG T，THAMMAPICHAI P，WENGY，JIANG J.Chromosome-specific painting in Cucumis species using bulkedoligonucleotides[J]. Genetics，2015，200（3）：771-779.

[20] ALBERT P S，ZHANG T，SEMRAU K，ROUILLARD J M，KAO Y H，WANG C R，DANILOVAT V，JIANG J，BIRCHLERJ A. Whole-chromosome paints in maize reveal rearrangements，nuclear domains，and chromosomal relationships[J]. Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United Statesof America，2019，116（5）：1679-1685.

[21] ZHANG T，LIU G Q，ZHAO H N，BRAZ G T，JIANG J. Chorus2：Design of genome-scale oligonucleotide-based probes forfluorescence in situ hybridization[J]. Plant Biotechnology Journal，2021，19（10）：1967-1978.

[22] WANG X，XU Y，ZHANG S，CAO L，HUANG Y，CHENG J，WU G Z，TIAN S L，CHEN C L，LIU Y，YU H W，YANG XM，LAN H，WANG N，WANG L，XU J D，JIANG X L，XIE ZZ，TAN M L，LARKIN R M，CHEN L L，MA B G，RUAN Y J，DENG X X，XU Q. Genomic analyses of primitive，wild andcultivated Citrus provide insights into asexual reproduction[J].Nature Genetics，2017，49（5）：765-772.

[23] BRAZ G T，HE L，ZHAO H N，ZHANG T，SEMRAU K，ROUILLARD J M，TORRES G A，JIANG J M. Comparativeoligo-FISH mapping：An efficient and powerful methodology toreveal karyotypic and chromosomal evolution[J]. Genetics，2018，208（2）：513-523.

[24] HOU L L，XU M，ZHANG T，XU Z H，WANG WY，ZHANG JX，YU M M，JI W，ZHU C W，GONG Z Y，GU M H，JIANG JM，YU H X. Chromosome painting and its applications in cultivatedand wild rice[J]. BMC Plant Biology，2018，18（1）：110.

[25] XIN H Y，ZHANG T，WU Y F，ZHANG W，ZHANG P，XI M，JIANG J M. An extraordinarily stable karyotype of the woodyPopulus species revealed by chromosome painting[J]. The PlantJournal，2020，101（2）：253-264.

[26] LI G R，ZHANG T，YU Z H，WANG H，YANG E，YANG Z. Anefficient Oligo-FISH painting system for revealing chromosomerearrangements and polyploidization in Triticeae[J]. The PlantJournal，2021，105（4）：978-993.

[27] IDZIAK D，BETEKHTIN A，WOLNY E，LESNIEWSKA K，WRIGHT J，F(xiàn)EBRER M，BEVAN M W，JENKINS G，HASTEROKR. Painting the chromosomes of Brachypodium：Currentstatus and future prospects[J]. Chromosoma，2011，120（5）：469-479.

[28] LYSAK M A，F(xiàn)RANSZ P F，ALI H B，SCHUBERT I. Chromosomepainting in Arabidopsis thaliana[J]. The Plant Journal2001，28（6）：689-697.

[29] WU G A，TEROL J，IBANEZ V，LOPEZ-GARCIA A，PEREZROMANE，BORREDA C，DOMINGO C，TADEO F R，CARBONELL-CABALLERO J，ALONSO R，CURK F，DU D L，OLLITRAULT P，ROOSE M，DOPAZO J，GMITTER F G，ROKHSAR D S，TALON M. Genomics of the origin and evolutionof Citrus[J]. Nature，2018，554 （7692）：311-316.

[30] XU Q，CHEN L L，RUAN X，CHEN D，ZHUA，CHEN C L，BERTRANDD，JIAO W B，HAO B H，LYON M P，CHEN J J，GAOS，XING F，LAN H，CHANG JW，GE X H，LEI Y，HU Q，MIAOY，WANG L，XIAO S X，BISWAS M K，ZENG W F，GUO F，CAO H B，YANG X M，XU X W，CHENG Y J，XU J，LIU J H，LUO O J H，TANG Z H，GUOWW，KUANG H H，ZHANG HY，ROOSE M L，NAGARAJAN N R J，DENG X X，RUAN Y J. Thedraft genome of sweet orange （Citrus sinensis）[J]. Nature Genetics，2013，45（1）：59-66.

[31] DE JONG J H，F(xiàn)RANSZ P，ZABEL P. High resolution FISH inplants - techniques and applications[J]. Trends in Plant Science，1999，4（7）：258-263.

[32] CHENG Z K，PRESTING G G，BUELL C R，WING R A，JIANGJ M. High-resolution pachytene chromosome mapping ofbacterial artificial chromosomes anchored by genetic markers revealsthe centromere location and the distribution of genetic recombinationalong chromosome 10 of rice[J]. Genetics，2001，157（4）：1749-1757.

[33] XIA Q M，MIAO L K，XIE K D，YIN Z P，WU X M，CHEN CL，GROSSER J W，GUO W W. Localization and characterizationof Citrus centromeres by combining half- tetrad analysisand CenH3-associated sequence profiling[J]. Plant Cell Reports，2020，39（12）：1609-1622.

[34] XIN H Y，ZHANG T，HAN Y H，WU Y F，SHI J S，XI M L，JIANGJ M. Chromosome painting and comparative physical mappingof the sex chromosomes in Populus tomentosa and Populusdeltoides[J]. Chromosoma，2018，127（3）：313-321.