基于WGCNA 的刺葡萄抗白腐病關(guān)鍵基因的發(fā)掘

譚西北 李鵬 孫磊 樊秀彩 劉崇懷 姜建福 張穎

摘要：【目的】葡萄白腐病是危害最嚴(yán)重的病害之一，不同的葡萄種質(zhì)對(duì)白腐病的抗性存在差異。在前期的研究中篩選到了1 份抗病種質(zhì)刺葡萄0941，該種質(zhì)為中國野生葡萄，具有耐濕熱、抗病性強(qiáng)的特點(diǎn)。旨在通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和WGCNA篩選，挖掘刺葡萄抗白腐病關(guān)鍵基因?！痉椒ā恳钥共〉拇唐咸?941（Vd）和感病的歐亞種美人指（Vv）為試材，通過室內(nèi)接菌，設(shè)置0 h、24 h、48 h 三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，研究病原菌誘導(dǎo)下感病和抗病種質(zhì)的基因表達(dá)差異，篩選出抗病基因，并利用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證?！窘Y(jié)果】根據(jù)|Log2Fold Change|≥2 和p≤0.05 的篩選條件，在0 h、24 h、48 h 抗病品種刺葡萄和感病品種美人指之間篩選到差異表達(dá)基因分別有5266、4725、4653 個(gè)。其中上調(diào)基因數(shù)分別為1737、1788、1727 個(gè)，下調(diào)基因數(shù)為3529、2937、2926 個(gè)；進(jìn)一步對(duì)這些差異基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)了具有防御反應(yīng)、跨膜運(yùn)輸和一些植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能的基因或者通路。為了明確不同品種葡萄果實(shí)抗病之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行了WGCNA分析，得到7 個(gè)基因模塊，篩選出2 個(gè)與抗病高度相關(guān)的關(guān)鍵的模塊并且通過hub 基因分析明確模塊內(nèi)基因的互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，鑒定出2 個(gè)類黃酮代謝相關(guān)基因、2 個(gè)植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因以及2 個(gè)hub 基因，并且通過熒光定量驗(yàn)證其表達(dá)情況與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致?！窘Y(jié)論】獲得了刺葡萄與美人指響應(yīng)白腐病侵染的差異表達(dá)基因，并顯著富集在防御反應(yīng)、跨膜運(yùn)輸和一些植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路，篩選出6 個(gè)抗病候選基因，包括F35H、EIN和MYB等。

關(guān)鍵詞：葡萄；抗??；轉(zhuǎn)錄組；基因挖掘；WGCNA 分析

中圖分類號(hào)：S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? 文章編號(hào)：1009-9980（2023）04-0653-16

葡萄在我國具有悠久的栽培歷史，因其具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，深受廣大民眾的喜愛。近年來，隨著葡萄栽培面積和產(chǎn)量的持續(xù)增長(zhǎng)，病害造成的損失也逐年增加，其中葡萄白腐病是危害最嚴(yán)重的病害之一。該病是由白腐墊殼孢[Conielladiplodiella （Speg.） Petrk & Sydow.]引起的真菌性病害[1]，19 世紀(jì)在意大利首次報(bào)道，我國最早發(fā)現(xiàn)于1899 年，目前主要發(fā)生在我國東北、華北、西北和華東北部地區(qū)，植株感病后，葉片邊緣出現(xiàn)水漬狀病斑，慢慢侵染到葉片中部，呈現(xiàn)出不太明顯的同心輪紋狀的褐色病斑；葡萄果粒逐漸變褐變軟，發(fā)病后期整個(gè)果穗腐爛，造成大面積減產(chǎn)[2-3]。目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上主要是化學(xué)藥劑防治葡萄白腐病，化學(xué)防治法雖然效果好、見效快，但是長(zhǎng)期用藥，不僅增加成本、降低果實(shí)品質(zhì)，而且還會(huì)存在農(nóng)藥殘留，嚴(yán)重危害環(huán)境及食品安全。

不同葡萄種質(zhì)對(duì)白腐病的抗性存在差異。歐亞種對(duì)白腐病的抗性較差，東亞種群的葡萄抗病性較強(qiáng)[4]。中國是葡萄屬植物重要的起源地之一，基本包括了所有的東亞種群，野生葡萄種質(zhì)資源豐富[5]，利用野生種質(zhì)資源導(dǎo)入異質(zhì)抗性基因是解決栽培品種抗性基因貧乏的有效途徑。我國的刺葡萄對(duì)包括白腐病在內(nèi)的多種真菌性病害都具有很強(qiáng)的抗性[6-7]，是葡萄白腐病抗性研究的良好材料。因此，解析葡萄抗病機(jī)制、挖掘抗性基因、培育具有較強(qiáng)抗病性的葡萄品種尤為重要。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序已被廣泛用于解析擬南芥、番茄、葡萄和其他植物的抗病機(jī)制；研究結(jié)果能夠提供植物在病原菌侵染下應(yīng)答的信號(hào)通路和相關(guān)基因表達(dá)的信息。陳哲等[8]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)草莓受到炭疽病病原菌侵染后能夠影響類黃酮生物合成和植物激素信號(hào)傳導(dǎo)等通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)水平，并鑒定出了19 個(gè)感病相關(guān)的差異表達(dá)基因。暹羅芽孢桿菌提高了貯藏杧果果實(shí)的抗病性，Jiang 等[9]利用暹羅芽孢桿菌的誘導(dǎo)機(jī)制，建立了杧果果實(shí)樣品在貯藏期間的比較轉(zhuǎn)錄組分析，部分基因（JAZ、BAK1 和PR1）被暹羅芽孢桿菌處理上調(diào)，引發(fā)應(yīng)激反應(yīng)，并誘導(dǎo)酚類抗性物質(zhì)的合成，從而提高杧果果實(shí)的抗病性。其次，一些基因（WRKY22、HSP90、CNGCs、SOD、PAL、4CL、CHS 和HCT）如過氧化物酶體、苯丙素、黃酮類和姜酚生物合成，在杧果果實(shí)中上調(diào)，從而增強(qiáng)系統(tǒng)的抗病能力，刺激免疫反應(yīng)。姜長(zhǎng)岳[10]以毛葡萄丹鳳-2 葉片為材料接種白粉菌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從MYB家族中篩選出抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子VqMYB154，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子VqMYB154 具有正向調(diào)控3 個(gè)芪合酶靶基因表達(dá)以增強(qiáng)植物抗病性的功能。Jiao 等[11]通過轉(zhuǎn)錄組分析中國野生葡萄對(duì)白粉病的抗病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)感病品種湖南一號(hào)下調(diào)基因比例明顯高于山-24，而上調(diào)基因主要與防御反應(yīng)和抗病代謝物的生物合成相關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)12 號(hào)和13 號(hào)染色體上的NLR基因?qū)Π追劬蠲舾?，其中許多基因在易感種質(zhì)的所有感染階段始終下調(diào)。Liu 等[12]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，從河岸葡萄中篩選了與抗病性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子ERF、MYB、WRKY和bHLH，確定了197 個(gè)候選基因，可能參與霜霉病菌引起的防御反應(yīng)，其中有5 個(gè)基因富含亮氨酸重復(fù)序列（LRR）。沈才琦等[13]通過對(duì)感炭疽病歐亞種里扎馬特和抗炭疽病刺葡萄黑珍珠的雜交后代中感炭疽病7-2-6 株系和抗炭疽病7-1-8 株系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)葡萄響應(yīng)膠孢炭疽菌侵染的差異表達(dá)基因，顯著富集在植物與病原體相互作用、類黃酮生物合成和MAPK信號(hào)途徑等3 個(gè)通路，并篩選出8 個(gè)抗病候選基因，包括MLO蛋白及WRKY、ERF轉(zhuǎn)錄因子等。轉(zhuǎn)錄組分析已廣泛用于發(fā)掘植物響應(yīng)病病原菌脅迫的調(diào)控因子，這為研究刺葡萄抗病機(jī)制提供了理論依據(jù)。筆者在本研究中對(duì)白腐病病原菌侵染前后的感病歐亞種美人指和抗病中國野生刺葡萄的果實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，通過轉(zhuǎn)錄組分析已經(jīng)鑒定了幾個(gè)可能在抗葡萄白腐病中起關(guān)鍵作用的基因。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以抗白腐病刺葡萄0941 和感白腐病歐亞種美人指轉(zhuǎn)色期的果實(shí)為試驗(yàn)材料，材料采自于國家葡萄種質(zhì)資源圃（鄭州）。在葡萄果實(shí)的果柄處接種直徑1 cm 的白腐病原菌菌塊，每組接種18 粒葡萄，保濕并置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，同時(shí)在果實(shí)果柄處接種無菌水作為對(duì)照。分別在接菌0 h、24 h、48 h 收集去除感染部分后的果實(shí)，每組均設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（華越洋，貨號(hào)0416-50），參照說明書提取樣品總RNA，置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 文庫構(gòu)建及測(cè)序

總RNA質(zhì)量檢測(cè)合格后，通過深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。對(duì)得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，去除低質(zhì)量的reads 獲得的高質(zhì)量的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，并儲(chǔ)存于格式為fastq 的數(shù)據(jù)文件中。以葡萄基因組12 ×（https：//urgi.versailles.inra.fr/Species/Vitis）為參考基因組進(jìn)行比對(duì)。利用HISAT2 軟件將得到的clean reads 比對(duì)參考基因組進(jìn)行組裝。使用RSEM 軟件計(jì)算基因表達(dá)水平，然后轉(zhuǎn)換成FPKM（每千堿基轉(zhuǎn)錄序列的預(yù)期片段數(shù)/百萬堿基對(duì)測(cè)序）值。使用對(duì)比工具Bowtie2 將clean reads 與參考基因組進(jìn)行比對(duì)以統(tǒng)計(jì)基因比對(duì)率，比對(duì)率都在90%以上。利用組裝的轉(zhuǎn)錄本與GO 數(shù)據(jù)庫、KEGG數(shù)據(jù)庫、NR數(shù)據(jù)庫、Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫、Pfam數(shù)據(jù)庫、COG數(shù)據(jù)庫以及KOG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能注釋。

1.3 差異表達(dá)基因篩選和富集分析

比對(duì)品種間基因的表達(dá)情況，篩選差異表達(dá)的部分進(jìn)一步富集分析。使用DESeq2 軟件進(jìn)行差異基因的篩選，將|log2FoldChange|≥2、p≤0.05 的基因作為顯著的差異表達(dá)基因，對(duì)篩選出的差異基因進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路分析，以獲得差異表達(dá)基因的主要生物學(xué)功能及主要生化代謝途徑。

1.4 WGCNA分析通過WGCNA分析進(jìn)一步探究差異表達(dá)基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，旨在鑒定相關(guān)基因模塊及模塊內(nèi)的hub 基因。對(duì)每個(gè)基因模塊進(jìn)行評(píng)估，檢驗(yàn)每個(gè)模塊中基因的相關(guān)性，利用Cytoscape 3.8.0 計(jì)算每個(gè)基因的相關(guān)性，鑒定每個(gè)模塊內(nèi)的hub 基因。通過計(jì)算每個(gè)模塊的特征基因值，檢驗(yàn)各個(gè)基因白腐病之間的相關(guān)性。此外，為了進(jìn)一步探究模塊中基因的功能，利用R包（ClusterProfiler）進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

為驗(yàn)證RNA-seq 測(cè)序檢測(cè)到DEGs，本研究基于分析挑取9 個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR 分析。使用Primer3plus 在線網(wǎng)站（https：//www.primer3plus.com/index.html）設(shè)計(jì)引物，并由上海生工生物公司進(jìn)行合成，引物具體信息見表1。然后用Fasting-King RT Kit（With gDNA）反轉(zhuǎn)錄試劑盒（天根）將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。每個(gè)樣本3 個(gè)重復(fù)，使用FastStart Essential DNA Green Master 試劑盒按照其說明在ABI-7300 系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR 分析，反應(yīng)程序：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。以VvEF1-α 為內(nèi)參基因[14]，用2- ΔΔCT 公式計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量分析

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，一共得到798.77 百萬條高質(zhì)量的過濾序列，共產(chǎn)生119.82 Gb過濾堿基，每個(gè)樣本的Q30 均大于92%，清潔讀數(shù)率都在96%以上。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果與葡萄參考基因組的比對(duì)率高，測(cè)序質(zhì)量好，可用于后續(xù)分析（表2）。對(duì)各組重復(fù)之間進(jìn)行相關(guān)性分析，每組樣品之間的相關(guān)系數(shù)均高于0.8（圖1），以確保試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

2.2 差異表達(dá)基因篩選

篩選|log2FoldChange|≥2、p≤0.05 的基因作為顯著差異表達(dá)基因，在0 h、24 h、48 h 抗病品種刺葡萄（Vd）和感病品種美人指（Vv）之間的差異表達(dá)基因分別有5266、4725、4653 個(gè)（圖2-A）。其中上調(diào)基因數(shù)分別為1737、1788、1727 個(gè)，下調(diào)基因數(shù)分別為3529、2937、2926 個(gè)。在抗病品種和感病品種之間的差異表達(dá)基因均是下調(diào)基因數(shù)目遠(yuǎn)大于上調(diào)基因數(shù)目，且24 h 和48 h 較0 h 下調(diào)基因數(shù)目大幅減少，3 個(gè)時(shí)期對(duì)比組共有差異表達(dá)基因有2684 個(gè)（圖2-B）。

2.3 GO、KEGG功能注釋及富集分析

將篩選出來的所有時(shí)期的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果分為3 類，分別為生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能。結(jié)果僅展示出富集程度最為顯著的前20 條的代謝途徑（圖3）。在膜、細(xì)胞、細(xì)胞部分等組分中具有較高程度的富集，在生物學(xué)過程中防御反應(yīng)、跨膜運(yùn)輸、代謝過程、細(xì)胞過程等具有較高程度的富集，在分子功能中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性和催化活性等具有較高程度的富集，結(jié)果表明這些功能在刺葡萄、美人指與白腐病的防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。

對(duì)刺葡萄和美人指之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析，取富集最為顯著的前20個(gè)通路進(jìn)行分析（圖4）。通過KEGG分析，表明上調(diào)差異基因主要富集在類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成、苯丙烷生物合成、芪類和二芳基庚烷類及姜酚生物合成、α-亞麻酸代謝、亞油酸代謝等代謝途徑中，而下調(diào)差異基因主要富集在植物與病原菌的相互作用、類黃酮生物合成、苯丙烷生物合成、植物激素信號(hào)和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、ABC運(yùn)輸、苯丙氨酸代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、二萜生物合成、DNA復(fù)制等通路中。

2.4 刺葡萄抗白腐病的相關(guān)差異表達(dá)基因

刺葡萄和美人指接種白腐病病原菌0 h、24 h、48 h 后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，從KEGG富集的通路中選擇白腐病病原菌誘導(dǎo)后表達(dá)差異較大的基因，作為重要的差異表達(dá)基因。差異表達(dá)基因主要來自次生代謝和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)兩個(gè)通路。

葡萄果實(shí)接種白腐病病原菌后，與苯丙烷、類黃酮、黃酮和黃酮醇生物合成等次生代謝途徑的相關(guān)基因在24 h 和48 h 均受到誘導(dǎo)而產(chǎn)生表達(dá)差異。圖5展示了0 h、24 h和48 h中苯丙烷、類黃酮、黃酮和黃酮醇生物合成途徑相關(guān)的差異表達(dá)基因（differentiallyexpressed genes，DEGs）及其轉(zhuǎn)錄水平。其中苯丙氨酸解氨酶PAL（Vitvi00g01431、Vitvi16g01503）、四香豆酸酯CoA 連接酶4CL（Vitvi16g00139）、查耳酮合成酶CHS（Vitvi16g00990、Vitvi16g01480）、莽草酸/奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶HCT（Vitvi11g00735）、黃酮醇合酶FLS（Vitvi08g01575）這7個(gè)基因在受到白腐病原菌誘導(dǎo)48 h 后，在抗病品種刺葡萄中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于感病品種美人指。芪合酶STS（Vitvi16g01465、Vitvi16g01466）的表達(dá)量在受到病原菌誘導(dǎo)后，在刺葡萄和美人指中均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且美人指中的表達(dá)量高于刺葡萄。

白腐病病原菌侵染葡萄果實(shí)時(shí)，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸、油菜素甾醇、茉莉酸和水楊酸等重要防御相關(guān)的信號(hào)通路均發(fā)生富集，82 個(gè)差異表達(dá)基因顯著富集于植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（圖6），39 個(gè)DEGs（TCH4，4個(gè)；AUXIAA，1 個(gè)；CH3，2 個(gè)；TF，1 個(gè)；JAZ，2 個(gè)；SAUR，16 個(gè)；PR1，2 個(gè)；MYC2，1 個(gè)；ETR；2 個(gè)；TIR，1 個(gè)）在刺葡萄中的表達(dá)水平明顯高于美人指。其中，水楊酸信號(hào)途徑下游基因PR1（Vitvi03g00860）和茉莉酸信號(hào)途徑下游基因MYC2（Vitvi02g00231）在刺葡萄接菌處理后表達(dá)上調(diào)，且PR1（Vitvi03g00860）在接菌48 h 表達(dá)水平很高，最高上調(diào)1000 倍（0.27＜FPKM＜1100），MYC2（Vitvi02g00231）在接菌0 h 和24 h 表達(dá)水平無明顯變化，但在48 h 上調(diào)10 倍（0＜FPKM＜13）；茉莉酸信號(hào)途徑下游基因JAZ（Vitvi01g02293）在刺葡萄接菌24 h 下調(diào)表達(dá)3 倍，而后上調(diào)100 倍；乙烯信號(hào)途徑上游基因ETR（Vitvi05g00684）在刺葡萄和美人指接菌后都上調(diào)。

2.5 接菌處理后轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)模式

DEGs 中轉(zhuǎn)錄因子有344 個(gè)，屬于39 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，主要包含40 個(gè)AP2/ERF、66 個(gè)MYB、22 個(gè)WRKY、35 個(gè)bHLH、24 個(gè)NAC、16 個(gè)LBD、16 個(gè)C2H2、11 個(gè)HD-ZIP 等（圖7）。在接菌處理后，其中10 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在美人指中的表達(dá)量明顯高于刺葡萄，例如AP2/ERF（Vitvi05g01073）在接菌24 h 美人指中的表達(dá)量是刺葡萄的60 倍，在接菌48 h 美人指的表達(dá)量是刺葡萄的35 倍。16 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在刺葡萄中的表達(dá)量顯著高于美人指，例如參與植物苯丙烷類次生代謝途徑的MYB（Vitvi02g01019）在接菌24 h 刺葡萄中的表達(dá)量是美人指的100 倍，在接菌48 h 刺葡萄的表達(dá)量是美人指的40 倍。8 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在受到白腐病原菌的誘導(dǎo)后的刺葡萄和美人指中表達(dá)模式相反，例如響應(yīng)激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的AP2/ERF（Vitvi16g01438）在接菌24 h 刺葡萄中表達(dá)上調(diào)12倍，而在美人指中下調(diào)表達(dá)10 倍；在接菌48 h 刺葡萄中表達(dá)下調(diào)表達(dá)10 倍，而美人指上調(diào)3 倍。

2.6 WGCNA分析鑒定刺葡萄抗病的關(guān)鍵基因

經(jīng)過濾FPKM＜1 的基因，4085 個(gè)差異基因用于構(gòu)建加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。通過計(jì)算18 個(gè)樣本表達(dá)水平的相關(guān)系數(shù)聚類分析，樣本間聚類良好，未出現(xiàn)離群樣本。根據(jù)差異基因的FPKM 值進(jìn)行相關(guān)度分析并聚類，相關(guān)度較高的基因被分配到同一個(gè)模塊中，圖中聚類樹的不同分支代表不同的基因共表達(dá)模塊，不同顏色代表不同的模塊，共劃分為7 個(gè)模塊，并繪制基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)熱圖（圖8）。根據(jù)基因表達(dá)模塊的趨勢(shì)與抗病性狀的相關(guān)性分析，以皮爾遜相關(guān)系數(shù)（r＞0.5）和顯著性p 值的大小（p＜0.05）為篩選條件MEyellow、MEblack、MEgreen模塊與抗病性狀呈顯著正相關(guān)，其中MEblack模塊在Vd0h、Vd24h、Vd48h 與抗病性狀呈顯著正相關(guān)，MEyellow 模塊在Vd48h 與抗病性狀呈顯著正相關(guān)。對(duì)這兩個(gè)抗病相關(guān)模塊中的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析，其富集的通路主要集中在類黃酮生物合成、MAPK信號(hào)途徑、苯丙烷生物合成、植物相互作用（圖9）。

選取Meyellow、MEblack 模塊內(nèi)連通度最高的前150 個(gè)基因作為模塊的hub 基因，其中候選轉(zhuǎn)錄因子共有13 個(gè)，并通過WGCNA 預(yù)測(cè)與它們可能存在互作關(guān)系的DEGs，利用Cytoscape 軟件進(jìn)行可視化分析（圖10）。在MEblcak 模塊中有4 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（MYB，2 個(gè)；EIN 和TCP，各1 個(gè)）與植物防御反應(yīng)有關(guān)，其中與MYB4-Like（Vitvi17g00232）相關(guān)DEGs 的數(shù)量最多，共有104 個(gè)；這些基因主要與植物的代謝反應(yīng)有關(guān)，如苯丙氨酸生物合成、色氨酸代謝、糖酵解、泛素介導(dǎo)的蛋白水解等。在MEyellow 模塊中有9 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（MYB，3 個(gè)；ERF，3 個(gè)；bHLH，2 個(gè)；bZIP，1 個(gè)）與植物防御反應(yīng)有關(guān)，其中MYB1R1（Vitvi04g00076）有相關(guān)性的DEGs 數(shù)量為134 個(gè)，這些基因的功能注釋發(fā)現(xiàn)與多種植物激素有關(guān)，如生長(zhǎng)素、乙烯、水楊酸和茉莉酸，還和氧化還原反應(yīng)、類黃酮生物合成等有關(guān)。

通過KEGG富集分析、轉(zhuǎn)錄因子家族分析以及WGCNA中與抗病性相關(guān)聯(lián)的模塊，結(jié)合基因注釋，篩選出6 個(gè)與抗病相關(guān)的候選基因，分別是Vitvi01g02263（FAOMT）、Vitvi06g01183（F35H）、Vitvi06g01036（EIN3）、Vitvi04g00076（MYB1R1）、Vitvi17g00232（MYB4）和Vitvi07g02070（ERF098）。

2.7 DEGs的RT-qPCR

為了驗(yàn)證RNA-Seq 數(shù)據(jù)的可靠性，從DEGs 中選擇9 個(gè)基因，包括2 個(gè)類黃酮代謝相關(guān)的DEGs、2個(gè)植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的DEGs、2 個(gè)共表達(dá)模塊篩選到的關(guān)鍵基因和3 個(gè)隨機(jī)挑選的DEGs，通過RT-qPCR方法分析了這些基因在刺葡萄和美人指受白腐病病原菌侵染后的表達(dá)量變化，熒光定量顯示以上基因在接種病菌前后的相對(duì)表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，這說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是可靠的（圖11）。其中FAOMT、F35H、EIN3、MYB4 的表達(dá)量在所有時(shí)期中刺葡萄均明顯高于美人指；MYB1R1、ERF098 在接菌48 h 后，在刺葡萄中的表達(dá)量較其他時(shí)期和美人指中的均有顯著提升。

3 討論

本研究中，利用RNA-Seq 技術(shù)對(duì)接種白腐病原菌后不同時(shí)間點(diǎn)的抗病和感病葡萄葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，在0 h、24 h 和48 h 三個(gè)時(shí)期兩者之間分別篩得差異基因5266、4725和4653 個(gè)。當(dāng)白腐病病原菌侵染葡萄果實(shí)后，多個(gè)代謝通路的基因表達(dá)發(fā)生改變，其中次生代謝物可能積極參與葡萄抗病反應(yīng)。苯丙烷代謝物對(duì)植物的發(fā)育和生存至關(guān)重要，苯丙烷代謝物的生物合成和多樣性可通過加氧酶、氧化還原酶、連接酶和轉(zhuǎn)移酶等一系列酶來實(shí)現(xiàn)，這些酶通過?；?、甲基化、糖基化和羥基化對(duì)代謝物的基本骨架進(jìn)行化學(xué)修飾[15]。苯丙氨酸由莽草酸途徑產(chǎn)生，苯丙類化合物是類黃酮、異黃酮和孜然芹素等多種酚類化合物的前體，研究發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸在植物體內(nèi)積累，能顯著降低植物對(duì)病原菌的敏感性[16]。苯丙氨酸解氨酶（PAL）是苯丙烷代謝途徑中的關(guān)鍵酶，能夠?qū)⒈奖彼徂D(zhuǎn)為肉桂酸，是催化苯丙烷類次級(jí)代謝的第一步反應(yīng)，起到樞紐的作用[17]。PAL參與花色苷、植物保護(hù)素、酚類代謝等物質(zhì)的合成，該基因在大多數(shù)植物中是以多基因家族存在，PAL基因家族成員調(diào)控的代謝途徑也各有差異。有研究表明，植物中PAL活性降低時(shí)，抵抗外界干擾的能力下降[18]。肉桂酸4-羥基化酶（C4H）為通用的苯丙氨酸途徑限速酶，參與苯丙烷代謝途徑第二步催化反應(yīng)，起到承上啟下的作用。該酶能提高自身的活性，來抵抗外界的環(huán)境脅迫。C4H將反式肉桂酸催化為β-香豆酸，通過4-香豆酰輔酶A連接酶轉(zhuǎn)化為香豆酞輔酶A，為下游類黃酮、木質(zhì)素等次級(jí)代謝途徑提供前體物質(zhì)[19]。PAL催化苯丙烷代謝合成途徑中的第一步反應(yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)與C4H催化生成4-香豆酸。PAL 與C4H這兩個(gè)酶通常情況下均以協(xié)同的方式進(jìn)行表達(dá)，來控制黃酮物質(zhì)的合成，但通常情況下，C4H的活性比PAL的活性低很多[20]。在本試驗(yàn)中PAL（Vitvi16g01503）、4CL（Vitvi16g00139）基因在受到病原菌誘導(dǎo)48 h 后，其在抗病品種刺葡萄中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于美人指。在植物體內(nèi)PAL 作為苯丙烷類代謝定速酶，與植物的抗病性有重要關(guān)系。已報(bào)道在金針菇感染異型葡枝霉菌之后PAL活性明顯增強(qiáng)[21]，β-1，3-葡寡糖10 倍誘抗劑處理后的葡萄葉片苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性增強(qiáng)，說明處理之后提高了體內(nèi)防御酶和抗病相關(guān)蛋白活性，進(jìn)而誘導(dǎo)植株產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性[22]，以上結(jié)果表明PAL與植物的抗病性呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。

類黃酮代謝途徑是苯丙烷代謝途徑通過查爾酮合成酶（CHS）延伸的另一個(gè)重要分支，類黃酮代謝途徑廣泛存在于各種植物體內(nèi)，類黃酮化合物是類黃酮代謝途徑中產(chǎn)生的大量次生代謝物質(zhì)，大自然中類黃酮化合物一般分為六大類：黃酮、黃酮醇、黃烷酮、黃烷醇、花色素、異黃酮[23]。在植物中，葉片和花等器官的類黃酮化合物含量比較高，類黃酮化合物作為次生代謝物質(zhì)在植物中可以作為植物和微生物之間的關(guān)鍵信號(hào)物質(zhì)發(fā)揮植物防御素的功能，在植物中有很強(qiáng)的抗病抑菌作用。CHS 可以通過催化形成不同的類黃酮化合物來提高植物的抗病能力，也可通過改變植保素、黃酮素、抗氧化酶SOD和POD 等的積累以及防御酶的活性來提高防御能力[24-27]。研究表明，在番茄和蘋果中過表達(dá)CHS 能夠增強(qiáng)對(duì)病原菌等環(huán)境脅迫的抗性[28-29]。抗枯萎病的棉花品種中CHS表達(dá)量明顯上調(diào)后，類黃酮的含量提高從而增強(qiáng)其對(duì)枯萎病的抗性[30]。此外，郭澤西[31]已經(jīng)證明抗性品種中查爾酮合成酶基因CHSI的表達(dá)量比感病品種高，過表達(dá)CHSl能夠提高感病葡萄品種對(duì)灰霉病和霜霉病的抗性。在本研究中發(fā)現(xiàn)接種白腐病病原菌誘導(dǎo)48 h 后，在抗病品種刺葡萄中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于感病品種美人指，這與前人的研究一致。同時(shí)筆者通過加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)候選基因：F35H和FAOMT，均是類黃酮代謝途徑中的關(guān)鍵基因，且FAOMT是F35H的下游基因[32]，二者在刺葡萄中的表達(dá)量均明顯高于美人指。類黃酮代謝通路由結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因共同控制，調(diào)節(jié)基因包括MYB、bHLH 等轉(zhuǎn)錄因子[33]，此前發(fā)現(xiàn)MYB4 能夠控制肉桂酸4-羥化酶（C4H）的負(fù)表達(dá)。筆者發(fā)現(xiàn)類黃酮代謝途徑中的關(guān)鍵基因和轉(zhuǎn)錄因子在抗病品種刺葡萄和感病品種美人指中表現(xiàn)出明顯的差異，因此，在刺葡萄響應(yīng)白腐病病原菌侵染時(shí)，類黃酮物質(zhì)可能起到重要作用。

此外，EIN3 和ERF098 是模塊中篩選出刺葡萄響應(yīng)白腐病侵染的關(guān)鍵基因，轉(zhuǎn)錄因子EIN3 是乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的調(diào)控因子，可激活乙烯反應(yīng)因子（ERF）[34]。本研究中乙烯信號(hào)途徑下游基因EIN3的表達(dá)水平在處理不同時(shí)間點(diǎn)中刺葡萄均高于美人指，而EIN3 下游基因ERF098 在48 h 抗病品種刺葡萄中的表達(dá)量明顯高于其他時(shí)間和感病品種美人指，而在刺葡萄中48 h 的表達(dá)量明顯上升這可能與反應(yīng)時(shí)間有關(guān)。由此可知，乙烯可能在刺葡萄抗白腐病反應(yīng)的激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮了重要作用。

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