軟/硬肉葡萄果實細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、組分及降解酶活性的變化

海龍飛 栗溫新 李志謙 李猛 陳超陽 魏紅麗 鄒東方 何暢 馮建燦 葉霞

摘 要：【目的】探討葡萄果實發(fā)育成熟過程中軟/硬肉果實軟化與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、組分以及降解酶活性之間的關(guān)系?！痉?法】以硬肉品種黎明無核和軟肉品種灰比諾花后35、49、63、77、91 d的果實為試材，對細(xì)胞壁組分及相關(guān)降解酶活性、 細(xì)胞形態(tài)進行分析研究。【結(jié)果】在果實成熟過程中，果實硬度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，成熟時黎明無核果實硬度比 灰比諾高2.8倍；果實硬度與原果膠含量呈顯著正相關(guān)，與纖維素酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)。黎明無核果實硬度與原果膠 和半纖維素含量呈顯著正相關(guān)，灰比諾果實硬度則與纖維素含量呈顯著正相關(guān)。隨著果實成熟軟化，果肉細(xì)胞逐漸表 現(xiàn)大小不均勻、排列不整齊的趨勢；灰比諾果肉細(xì)胞壁在果實轉(zhuǎn)色時開始降解，而黎明無核則基本保持穩(wěn)定。【結(jié)論】葡 萄果實成熟軟化過程中，原果膠和半纖維素快速降解導(dǎo)致果肉細(xì)胞壁破裂是葡萄果實軟化的關(guān)鍵因素；果實細(xì)胞壁組 分降解是由多種酶共同作用的結(jié)果，其中以纖維素酶的作用較為顯著。

關(guān)鍵詞：葡萄；果實軟化；細(xì)胞壁物質(zhì)含量；酶活性；組織結(jié)構(gòu)

中圖分類號：S663.1 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）04-0690-09

葡萄是一種深受大眾喜愛的水果，果肉質(zhì)地柔 軟、多汁，成熟后易落粒和腐爛，嚴(yán)重地影響貨架期 和商品質(zhì)量[1] 。根據(jù)葡萄果肉質(zhì)地差異和耐壓力強 弱，葡萄果肉硬度分為硬、中和軟三種類型，其中軟 肉型的果實極不耐貯藏[2] 。解析軟/硬肉葡萄果實硬 度變化的生理基礎(chǔ)和果實細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化對葡萄采后 貯藏保鮮的影響具有重要意義。

果肉質(zhì)地的軟硬主要與果肉細(xì)胞壁組分變化、 果肉細(xì)胞排列、大小等有關(guān)[3-4] 。果實細(xì)胞壁組分主 要由果膠、纖維素、半纖維素及少量結(jié)構(gòu)蛋白等構(gòu) 成。果實的軟化過程伴隨著這些細(xì)胞壁組分降解和 細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的損壞[4-5] 。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁組分與降解酶活性的變化緊密相關(guān)，歐洲梨、安溪柿、杧果、番 茄、香蕉、大櫻桃、草莓等果實軟化或采后貯藏過程 中，果膠甲酯酶（PME）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果 膠酸裂解酶（PL）等酶活性升高加速了原果膠的降 解，導(dǎo)致果實快速軟化[4，6-10] 。此外，果實質(zhì)地差異與 細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)，黑莓[11] 、藍莓[12] 、山楂[13] 等不同質(zhì)地 的果實，細(xì)胞壁的完整性和鈣含量差異是造成果實 軟化和果肉質(zhì)地差異的主要原因之一。

葡萄果實成熟軟化主要與細(xì)胞壁組分的降解與 重構(gòu)[1，14，15] 、果膠物質(zhì)的解聚[15-16] 、鈣橋的形成[1，14] 等有 關(guān)。軟/硬肉葡萄果實質(zhì)地差異的生理和細(xì)胞學(xué)基 礎(chǔ)尚不清楚，筆者在本研究中以成熟期相近的軟/硬 肉葡萄為材料，系統(tǒng)分析了果實成熟軟化過程中細(xì) 胞壁組分和相關(guān)酶活性的變化，以期為揭示葡萄果 實軟化和質(zhì)地差異的生理基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

于2020年5月至2020年8月，以硬肉品種黎明 無核和軟肉品種灰比諾為試材[2] ，供試葡萄果實取 自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所國家葡萄種質(zhì) 資源圃。分別在葡萄花后21、35、49、63、77、91 d，選 取大小一致、無病蟲害的果實0.5～2.0 kg。每次采樣 后將果實隨機分為兩組，一組用于硬度等生理指標(biāo) 測定，另一組用液氮速凍，置于-80 ℃超低溫冰箱中 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 果實硬度測定 每組樣品分別選取20～30個 葡萄果粒，使用數(shù)顯果實硬度計（艾德堡，GY4）進行 硬度測定，豎直向下勻速緩慢按壓至果實發(fā)生形變， 以峰值均值作為果實硬度，結(jié)果以N表示。

1.2.2 果實細(xì)胞壁物質(zhì)含量的測定 細(xì)胞壁纖維素 和半纖維素含量均使用試劑盒測定（CLL- 1- Y， BXW-1-G，科銘生物，江蘇蘇州）。首先進行細(xì)胞壁 物質(zhì)提取，稱取約0.3 g果實，先后進行勻漿、水浴、 離心、洗滌，獲得粗細(xì)胞壁；然后加入1 mL的DMSO 溶液浸泡15 h去除淀粉，4000g離心10 min，沉淀干 燥后獲得細(xì)胞壁物質(zhì)（CWM）。纖維素和半纖維素 含量的測定方法均參考試劑盒說明書。原果膠和可 溶性果膠含量測定參照曹建康等[17] 的方法進行。

1.2.3 細(xì)胞壁降解酶活性測定 PME活性和PL活 性均使用試劑盒進行測定（PME-2-G，PL-1-G，科銘 生物，江蘇蘇州）。PG活性測定參照曹建康[17] 的方 法進行。纖維素酶（Cx）活性測定參照王鴻飛等[18] 的 方法進行。

1.2.4 果實細(xì)胞解剖結(jié)構(gòu)觀察 將新鮮采集的葡萄果 實用超薄刀片橫切成5 mm厚的薄片，迅速投入FAA 溶液（無水乙醇、水、37%甲醛、冰醋酸體積比10∶7∶2∶1） 進行真空固定，并低速震蕩24 h（4 ℃，50 r·min-1 ）。 依次用50%、70%、85%、95%和100%的乙醇進行逐 級脫水，分別用25%和100%二甲苯透明1次和3次， 最后用25%的石蠟和75%的二甲苯進行滲蠟和石蠟 包埋。

使用石蠟切片機（RM2016，徠卡儀器，上海）連 續(xù)切制厚度為4 μm的切片，挑選完整的切片放置在 載玻片上進行烤片（60 ℃），石蠟烤化后取出常溫保 存?zhèn)溆谩⑹炃衅来畏湃攵妆胶蜔o水乙醇浸 泡2次，使用75%酒精和自來水漂洗干凈；放入甲苯 胺藍染液中染色 2～5 min，用自來水漂洗 2 次后烤 干；放入二甲苯透明10 min后，使用中性樹膠封片。 最后進行顯微鏡鏡檢（Eclipse E100，尼康，日本）和 圖像采集分析（DS-U3，尼康，日本）。 1.2.5 數(shù)據(jù)分析 每組試驗至少 3 次重復(fù)，試驗數(shù) 據(jù)分別采用Excel 2016和SPSS 22.0進行統(tǒng)計和相關(guān) 性分析，并使用Duncan新復(fù)極差法檢驗差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 軟/硬肉葡萄果實硬度變化分析

在葡萄果實的發(fā)育過程中，兩個品種的果實硬 度均表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢（圖1）。黎明無核 和灰比諾果實硬度分別在花后 35 d 和 49 d 出現(xiàn)峰 值，隨后快速軟化，花后 63 d 灰比諾果實開始轉(zhuǎn)色 （圖1）。在果實發(fā)育的各個時期，除花后第49天外， 黎明無核硬度均顯著高于灰比諾；在果實完熟時（花 后91 d），黎明無核的果實硬度比灰比諾的果實硬度 高2.8倍。

2.2 果實細(xì)胞壁物質(zhì)含量變化

在葡萄果實成熟軟化過程中，兩個品種的原果 膠含量總體呈下降趨勢，且灰比諾的原果膠含量均 顯著高于黎明無核原果膠含量（圖2-A）。在黎明無 核葡萄成熟過程中，果實的原果膠含量在花后35 d 最高，然后迅速下降，但花后49～91 d含量變化差異 不顯著；而 WSP 含量與原果膠的變化趨勢相反， WSP含量在花后35～77 d無顯著差異，而在花后91 d顯著高于其他時期（圖2-A，B）。灰比諾的原果膠含 量在果實成熟過程中一直呈下降趨勢，而WSP含量 在各個時期均無顯著差異（圖2-B）。

對葡萄果實發(fā)育中半纖維素和纖維素含量分析 結(jié)果顯示，半纖維素含量變化較為顯著（圖2-C）。黎 明無核和灰比諾的半纖維素含量均在花后35～49 d快 速下降，如灰比諾的半纖維素含量從花后 35 d 的 57.32 mg·g-1 下降到花后49 d的15.37 mg·g-1 ，降低了 73%。同時，在花后35～49 d灰比諾半纖維素含量顯 著高于黎明無核的含量。在果實發(fā)育的63～91 d，兩 個品種的半纖維素含量均維持較低水平且無顯著差 異（圖2-C）。兩個品種的纖維素含量分析的結(jié)果表 明，在黎明無核果實成熟過程中，纖維素含量無顯著 變化，而灰比諾纖維素含量總體呈下降趨勢（圖2-D）。

2.3 細(xì)胞壁降解酶活性變化

多聚半乳糖醛酸酶（PG）能將果膠主鏈水解為 單個半乳糖醛酸分子以降解果膠，實現(xiàn)果實的軟 化。在果實生長發(fā)育過程中，黎明無核果實 PG 酶 活性在花后 35～77 d 無顯著變化，在果實完熟時迅 速上升，達到最高。灰比諾果實 PG 酶活性呈先升 高后降低的趨勢，峰值出現(xiàn)在花后77 d（圖3-A）。 果膠甲酯酶（PME）主要催化甲基化的果膠甲酯 轉(zhuǎn)化為果膠酸，去甲基后由多聚半乳糖醛酸酶（PG） 降解果膠主鏈。在生長發(fā)育過程中，兩個品種PME 活性變化均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在花后49 d 時 PME 活性最低。黎明無核的 PME 活性在花后 35～63 d均顯著高于灰比諾，在果實發(fā)育的77～91 d， 兩個品種PME酶活性無顯著差異（圖3-B）。 PL 活性在兩個品種中也表現(xiàn)出不同的趨勢。 在黎明無核果實中，PL活性呈現(xiàn)先降低再升高的趨 勢，在花后77 d達到最低。在灰比諾果實中，PL活 性無顯著變化（圖3-C）。

纖維素酶（Cx）降解細(xì)胞壁中的纖維素，使細(xì)胞 壁結(jié)構(gòu)松弛，導(dǎo)致果實軟化。在葡萄生長發(fā)育過程 中，兩個葡萄品種 Cx 酶活性均呈逐漸上升的趨勢 （圖3-D）。在花后35～63 d，黎明無核Cx活性均顯著 高于灰比諾，而在花后77～91 d，兩品種Cx活性無顯 著差異（圖3-D）。

2.4 生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

在黎明無核果實發(fā)育過程中，果實硬度的變化與原果膠和半纖維素含量呈顯著正相關(guān)，與Cx活性 呈顯著負(fù)相關(guān)；同時WSP含量與PG活性呈顯著正 相關(guān)，原果膠和半纖維素含量與Cx活性均呈極顯著 負(fù)相關(guān)（表 1）?；冶戎Z果實在發(fā)育過程中，硬度與 纖維素含量呈顯著正相關(guān)，與Cx活性呈負(fù)相關(guān)；此 外纖維素含量與Cx活性和PME活性均呈顯著負(fù)相關(guān)，原果膠含量與Cx活性呈負(fù)相關(guān)（表1）。

2.5 果實細(xì)胞形態(tài)變化

對葡萄果實硬度發(fā)生顯著變化的四個時期的果 肉細(xì)胞進行了顯微結(jié)構(gòu)觀察，結(jié)果顯示在果實發(fā)育 過程中，兩個品種的果肉細(xì)胞的大小和排列均發(fā)生 了巨大的變化（圖4）。在幼果期（21 d），黎明無核和 灰比諾果肉細(xì)胞大小均勻、排列緊密整齊，二者在細(xì) 胞結(jié)構(gòu)和排列上無明顯變化（圖4-A1，B1）。隨著果實的發(fā)育和膨大（35～49 d），兩個品種的果肉細(xì)胞明 顯變大，但細(xì)胞大小不均勻、排列較松散（圖4-A2， A3，B2，B3）；其中灰比諾在花后49 d呈現(xiàn)果皮和果 肉細(xì)胞結(jié)合不緊密（圖 4-B3）。在果實開始軟化和 著色時（63 d），兩個品種的細(xì)胞排列和大小均雜亂 無章，尤其灰比諾果肉細(xì)胞的細(xì)胞壁邊界模糊，開始 出現(xiàn)大量降解現(xiàn)象；相比較而言，黎明無核的細(xì)胞壁 基本保持完整，未出現(xiàn)細(xì)胞壁降解現(xiàn)象（圖4-A4）。

3 討 論

3.1 原果膠、纖維素及半纖維素的降解導(dǎo)致葡萄果 實軟化

纖維素是果實細(xì)胞壁的骨架，半纖維素與纖維 素形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，共同維持細(xì)胞骨架的穩(wěn)定。在蘋 果和梨果實成熟過程中，纖維素含量與秦冠的硬度 變化呈顯著相關(guān)，而半纖維素含量與富士蘋果和庫 爾勒香梨硬度呈極顯著相關(guān)[22-23] 。在櫻桃果實中，纖 維素降解速率不同是導(dǎo)致質(zhì)地差異的主要因素之 一[10] 。巨峰葡萄果實軟化過程中，果膠和半纖維素的 降解、半纖維素和纖維素含量的降低是前期軟化的 主要原因之一[16] 。硬肉紅地球和軟肉玫瑰香的成熟 軟化與原果膠和可溶性果膠含量密切相關(guān)[15] 。不溶 性的原果膠降解為可溶性的果膠和果膠酸，引起胞 間層溶解和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致果實軟化[19-20] 。在 大櫻桃的果實成熟軟過程中，硬度高、耐貯藏品種可 溶性果膠含量低，軟化速度慢，而硬度低，不耐貯藏 的品種可溶性果膠含量高，軟化速度快[10] 。在桃果實 成熟過程中共價緊密結(jié)合型果膠轉(zhuǎn)變?yōu)殡x子可溶性 果膠，軟溶質(zhì)品種下降速率明顯高于硬溶質(zhì)品種，細(xì) 胞壁多糖的降解速度亦存在明顯差異[21] 。本研究結(jié)果 顯示，在細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)物質(zhì)中，原果膠、半纖維素和 纖維素含量均與軟/硬肉葡萄果實軟化有關(guān)，尤其是原 果膠和半纖維素含量在兩個品種中差異較顯著，這進 一步表明了葡萄果實的軟化與原果膠和半纖維素降 解均有關(guān)系，是細(xì)胞壁組分解聚綜合作用的結(jié)果。

3.2 葡萄細(xì)胞壁降解酶活性分析

與果實細(xì)胞壁組分降解中最為關(guān)鍵的水解酶是 PME、PG和PL等，它們協(xié)同作用于果膠的降解，Cx 和木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶（XTH）分別參與纖維素 和半纖維素的水解。在蘋果早熟品種（系）中，PME 酶活性呈先上升后下降又上升的趨勢[24] 。在甜櫻桃 生長發(fā)育過程中，PME與美早和紅燈硬度呈顯著負(fù) 相關(guān)，而軟肉品種佳紅 PME 活性幾乎沒有變化[10] 。 在葡萄果實發(fā)育中，硬肉NN107的PME活性比軟肉 的Thompson Seedless高，且在果實完熟前活性無顯 著變化[1] 。本研究的結(jié)果同樣顯示在果實轉(zhuǎn)色前， 硬肉品種黎明無核的PME活性均比軟肉品種灰比 諾高，預(yù)示 PME 活性變化可能不是造成軟/硬肉葡 萄果實質(zhì)地差別的主要原因。

PG 將去酯化的果膠分子降解為半乳糖醛酸， PL通過β-消除方式隨機斷裂多聚半乳糖醛酸來降 解細(xì)胞壁。PG活性在芒果和柿子的成熟軟化過程 中呈上升趨勢，在獼猴桃和蘋果呈先上升后下降趨 勢[25- 27] ，在櫻桃中，PG 可能是硬度變化的次要原 因[10] 。在香蕉成熟過程中，PL酶活性的高峰與呼吸 躍變高峰相一致，躍變之后，PL酶活性逐漸降低[6] 。 沉默表達番茄 SlPL 基因顯著降低果實可溶性果膠 含量、提高硬度，由此認(rèn)為PL是番茄果實軟化的關(guān) 鍵因子之一[9] 。本研究結(jié)果顯示，在葡萄果實的成 熟軟化過程中，兩個品種的PG和PL活性變化差異 不顯著，且與果實硬度的相關(guān)性不顯著，這表明葡萄 果實中果膠降解可能是PME、PG、PL等降解酶綜合 作用的結(jié)果。

木葡聚糖轉(zhuǎn)移酶和纖維素酶分別是半纖維素與 纖維素降解的關(guān)鍵酶，在果實的軟化過程中起著重 要的作用。在柿果實成熟和軟化過程中，木葡聚糖 轉(zhuǎn)移酶關(guān)鍵基因DkXTH8 的表達量最高，過表達DkXTH8 基因?qū)е铝朔鸭?xì)胞致密性變差、果實軟 化加速[28] 。在大櫻桃軟化過程，Cx活性并沒有影響 到果實硬度[10] 。但在本實驗中發(fā)現(xiàn)，軟硬肉葡萄品 種的Cx活性均與果實的硬度呈顯著相關(guān)，這表明纖 維素酶活性變化可能是引起葡萄果實軟化的重要因 素之一。

3.3 果肉細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性影響了果實硬度的 變化

隨著果實成熟軟化，原果膠降解，側(cè)鏈中性糖損 失，細(xì)胞壁發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的變化，最終導(dǎo)致細(xì)胞的破 裂[4，29-31] 。在番茄果實成熟過程中，抑制細(xì)胞壁多糖 解聚，保持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整，可抑制成熟軟化進 程[32] 。果膠結(jié)構(gòu)完整的櫻桃具有較高果實硬度[33] 。 耐壓力強的紅地球、秋紅、秋黑果肉細(xì)胞大且分布均 勻、緊密，而易軟化的巨峰果肉細(xì)胞大小不均勻、松 散[3] ；同時，硬肉品種NN107的細(xì)胞壁解聚率較低， 也是不易軟化的重要原因[1] 。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)果實開始軟化和著色時（63 d），硬肉品種黎明無核 的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)保持完整，而軟肉品種灰比諾已經(jīng)部 分降解；同時發(fā)現(xiàn)灰比諾轉(zhuǎn)色前半纖維素含量急劇 下降，這表明果肉細(xì)胞壁組分降解速度和維持細(xì)胞 壁完整性是影響葡萄果肉質(zhì)地的重要因素。

4 結(jié) 論

在葡萄果實成熟軟化過程中，原果膠和半纖維 素快速降解，導(dǎo)致了果肉細(xì)胞壁的破裂是葡萄果實 軟化的關(guān)鍵因素；果實細(xì)胞壁組分的降解是由多種 酶共同作用的結(jié)果，其中以纖維素酶的作用較為顯 著。

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