高溫對(duì)薩米脫甜櫻桃幼苗葉片生理指標(biāo)的影響

張琛 劉輝 郗篤雋 駱慧楓 裴嘉博 黃康康 阮若昕 賴夢(mèng)霞 樊懷福

摘要：【目的】從生理水平分析高溫對(duì)甜櫻桃相關(guān)生理指標(biāo)的影響并篩選代表性指標(biāo)，為下一步甜櫻桃對(duì)高溫響應(yīng)的生理指標(biāo)的篩選和耐熱性評(píng)價(jià)體系的建立提供參考?！痉椒ā恳蕴饳烟宜_米脫為試材，通過(guò)人工模擬高溫和自然高溫環(huán)境，探究植株葉片生理、葉綠素?zé)晒獾戎笜?biāo)變化，并通過(guò)相關(guān)性分析、主成分分析和聚類分析等方法篩選出高溫對(duì)甜櫻桃生理影響的代表性指標(biāo)?！窘Y(jié)果】高溫處理后，人工氣候箱處理A組和自然高溫處理C組的甜櫻桃葉片內(nèi)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbate peroxidase， APX）5 種酶的活性均升高，但人工氣候箱處理B組的甜櫻桃葉片內(nèi)CAT和APX活性下降。A、B、C組脯氨酸含量分別為高溫前的3.07、4.03、2.94 倍，超氧陰離子自由基（superoxide anion，O2 ·-）產(chǎn)生速率分別為高溫前的2.37、2.48、2.25 倍。A、C組中甜櫻桃葉片的可溶性蛋白含量增加，可溶性糖含量顯著下降；而B組中可溶性蛋白含量顯著性下降，為處理前的54.18%，可溶性糖含量增加了1.32%。3 組處理中光系統(tǒng)（photosystem Ⅱ，PSⅡ）最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、潛在光化學(xué)活性（Fv/Fo）、電子傳遞速率（electron transportrate，ETR）、非光化學(xué)淬滅（non-photochemical quenching，NPQ）4個(gè)熒光參數(shù)均出現(xiàn)不同程度下降，PSⅡ反應(yīng)中心受損活性下降。葉肉局部超顯微結(jié)構(gòu)觀察表明，高溫對(duì)甜櫻桃葉綠體、線粒體造成損傷。C組相關(guān)性分析表明，部分酶活性（CAT、APX）與部分熒光參數(shù)（ETR、Fv/Fo）之間、GR活性與多種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量（脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖）之間存在相關(guān)性，可通過(guò)聚類分析將11個(gè)具有相關(guān)性的生理指標(biāo)分為3類。【結(jié)論】高溫處理使甜櫻桃受到氧化損傷，其抗氧化酶系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)均對(duì)脅迫做出響應(yīng)。APX活性、GR活性、ETR 3 個(gè)指標(biāo)可作為本試驗(yàn)中高溫對(duì)薩米脫生理影響的代表性指標(biāo)，為今后甜櫻桃對(duì)高溫響應(yīng)的生理指標(biāo)的篩選和耐熱性評(píng)價(jià)體系的建立提供一定的參考。

關(guān)鍵詞：甜櫻桃；高溫；生理響應(yīng)；葉綠素?zé)晒?/p>

中圖分類號(hào)：S662.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）04-0712-12

溫度是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中重要的環(huán)境因子之一。近年來(lái)，人類活動(dòng)排放的CO2等氣體增加了溫室氣體濃度，全球溫室效應(yīng)致使氣溫逐年上升。據(jù)聯(lián)合國(guó)政府間氣候變化專門委員會(huì)（IntergovernmentalPanel on Climate Change，IPCC）報(bào)告顯示，全球平均氣溫每10 a（年）將上升0.3 ℃[1]。2021 年IPCC第一工作組最新評(píng)估報(bào)告指出，通過(guò)對(duì)未來(lái)20年的平均溫度變化預(yù)計(jì)，全球溫度升高將達(dá)到或超過(guò)1.5 ℃。高溫已逐漸成為嚴(yán)重危害植物生長(zhǎng)發(fā)育的非生物脅迫因子之一，抑制了植物的生理代謝[2]。植物熱脅迫應(yīng)對(duì)機(jī)制一直是研究關(guān)注的熱點(diǎn)，也是后期耐熱品種篩選的基礎(chǔ)。在生理水平上，植物活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除系統(tǒng)相關(guān)酶活性、光合特性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化等被廣泛研究；在分子水平上，與熱應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的熱休克轉(zhuǎn)錄因子（heat shock transcription factors，HSFs）和熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）、Ca+介導(dǎo)的信號(hào)通路亦受到高度關(guān)注[3-4]。高溫處理使葡萄葉片的過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等抗氧化酶活性升高[5]，凈光合速率Pn顯著降低[6]。連續(xù)高溫顯著降低光系統(tǒng)（photosystemⅡ，PSⅡ）反應(yīng)中心活性，PSⅡ正常功能受阻[5，7]，同時(shí)，超顯微結(jié)構(gòu)觀察表明葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[8]。單粒質(zhì)量及可滴定酸、花色苷含量均顯著降低，導(dǎo)致果實(shí)品質(zhì)下降[7]。在草莓[9]、香梨[10]、越橘[11]等果樹樹種上均有類似報(bào)道。自噬相關(guān)基因MdATG18a 可通過(guò)保護(hù)葉綠體、維持高水平光合作用、清除ROS 等方面增強(qiáng)蘋果的耐熱性[12]，MYB、ERF 等基因家族在物質(zhì)合成與代謝、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)方面的基礎(chǔ)耐熱性研究中起著關(guān)鍵作用[13-14]。甜櫻桃（Pruns avium L.）在我國(guó)集中栽培于渤海灣地區(qū)，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，同時(shí)南方春季升溫早，因此逐漸受以采摘游為主的南方果園青睞。浙江省夏季溫度較高，7—9 月期間40 ℃以上極端高溫天氣年均4.1 d [15]。本課題組結(jié)合杭州市氣象統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，連續(xù)多年對(duì)杭州市夏天（6—8 月）高溫天數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，2016—2020 年連續(xù)5 a 夏天30 ℃以上高溫天氣在55 d 以上，35 ℃以上高溫天氣在25 d以上，其中2016—2018 年連續(xù)3 a 夏天35 ℃以上高溫天氣均在35 d 以上。對(duì)于適應(yīng)于北方冷涼氣候的甜櫻桃而言，杭州地區(qū)夏季溫度過(guò)高，而高溫與雙雌蕊的發(fā)生密切相關(guān)[16]，會(huì)影響翌年坐果率[17]。由此可見(jiàn)，高溫是制約甜櫻桃在南方地區(qū)發(fā)展的因子之一，篩選耐高溫的品種是南方地區(qū)甜櫻桃引種適栽的研究目標(biāo)之一，也是后期耐高溫品種創(chuàng)制的基礎(chǔ)。目前，關(guān)于高溫脅迫對(duì)甜櫻桃生理生化、光合作用影響的研究較少。孟祥麗[18]以早大果為接穗，對(duì)5種不同砧木組成的砧穗組合進(jìn)行高溫處理，指出45 ℃處理對(duì)PSⅡ中心造成破壞，并通過(guò)生理和形態(tài)學(xué)指標(biāo)分析對(duì)5 種砧穗組合的耐熱性進(jìn)行排序。孟聰睿[19]通過(guò)模擬高溫測(cè)定了櫻桃組培苗葉片滲透物質(zhì)及抗氧化酶含量。吳曄[20]為探尋試管苗熱處理脫毒法的溫度條件，對(duì)10 個(gè)櫻桃砧木組培試管苗進(jìn)行耐熱性差異觀測(cè)。

吉塞拉（Gisela）系列是目前南方地區(qū)甜櫻桃栽培中最常用的砧木，為矮化/半矮化砧，具有親和性較好、適應(yīng)性強(qiáng)、抗病、提前結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，但關(guān)于品種在吉塞拉砧木上的耐熱性表現(xiàn)尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題組通過(guò)多年引種進(jìn)行適應(yīng)性栽培，篩選出適合于杭州地區(qū)的甜櫻桃品種薩米脫（Summit）。該品種在本地多年適栽后，具有相對(duì)穩(wěn)定的產(chǎn)量，但在夏季溫度較高的年份有一定比例的雙雌蕊率[17]。筆者在本研究中以此為切入點(diǎn)，以甜櫻桃薩米脫為接穗、吉塞拉作為砧木的嫁接苗為試材，通過(guò)模擬高溫或自然環(huán)境，探究其植株在不同的高溫處理下葉片生理、葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)的變化，以期從生理水平分析甜櫻桃對(duì)高溫的響應(yīng)機(jī)制，為下一步甜櫻桃耐熱性評(píng)價(jià)體系建立提供參考，也為今后南方地區(qū)甜櫻桃耐高溫品種（系）的篩選及育種、耐高溫栽培技術(shù)研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2019 年在浙江農(nóng)林大學(xué)官塘基地避雨大棚內(nèi)進(jìn)行。試材為1 年生薩米脫盆栽嫁接苗，砧木為吉塞拉6 號(hào)。

1.2 采樣處理方法

試驗(yàn)中高溫處理分別采用人工氣候箱、田間自然高溫2種方式，設(shè)為A、B、C共3組。其中，A、B組均使用人工氣候箱模擬高溫，C組為田間自然高溫。A、B組試驗(yàn)于2019 年8 月25 日至2019 年8 月26 日進(jìn)行。A組：試材為植株盆栽苗。隨機(jī)挑取生長(zhǎng)一致且健壯的盆栽苗6 盆，分別置于25、45 ℃的人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行處理12 h，濕度70%，光照度12 000 lx，處理后隨機(jī)采集無(wú)病害成熟葉片，10 枚葉片為一組，3 次重復(fù)；B組：試材為植株盆栽苗離體葉片。摘取無(wú)病害成熟葉片用濕棉球包裹葉柄，基部覆以保鮮膜以保持葉柄水分，分別置于25、45 ℃的人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行處理12 h，濕度70%，光照度12 000 lx，10枚葉片為一組，3次重復(fù)；C組：于2019年8月25日至2019年8月30日期間利用大棚內(nèi)自然高溫進(jìn)行處理。試材為植株盆栽苗。將盆栽苗移入塑料大棚內(nèi)，使用WS-TH23PRO溫濕度記錄儀記錄大棚內(nèi)的溫濕度（圖1）。分別于移入0、3（高溫后）、5 d（恢復(fù)期）時(shí)隨機(jī)采集無(wú)病害成熟葉片，10 片為一組，3 次重復(fù)。以上樣品采集后洗凈表面浮土灰塵等，液氮冷凍后置于-80℃冰箱中保存，用于生理指標(biāo)測(cè)定。將3 組處理（7 種狀態(tài)）分別標(biāo)記為：A-25 ℃（T1）、A-45 ℃（T2）、B-25 ℃（T3）、B-45 ℃（T4）、C-0 d（T5）、C-3 d（T6）、C-5 d（T7）。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

生理指標(biāo)測(cè)定方法：可溶性糖含量采用蒽酮法測(cè)定，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法測(cè)定，脯氨酸含量采用茚三酮法測(cè)定，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定，SOD活性采用愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定，POD 活性采用氮藍(lán)唑（NBT）法測(cè)定，CAT活性采用紫外吸收法測(cè)定，抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性根據(jù)劉冬峰[10]的方法測(cè)定，谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）活性參考張騰國(guó)等[21]的方法測(cè)定，O2 ·-生成速率參照孟祥麗[18]的方法測(cè)定。采用德國(guó)Walz 公司PAM-2500 便攜式葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定初始熒光（Fo）、最大光化學(xué)效率（Fm）、PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、非光化學(xué)淬滅系數(shù)（non- photochemicalquenching，NPQ）、表觀電子傳遞速率（electrontransport rate，ETR）。每個(gè)參數(shù)設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。透射電鏡觀察方法：取A組25、45 ℃植株中部的功能葉片，于其主脈兩側(cè)部分用刀片切成1 mm×1 mm小方塊放入2 mL離心管中，使用Alfa Aesar電鏡固定液固定，并用真空泵抽氣直至沉底，室溫放置2 h后轉(zhuǎn)入4 ℃儲(chǔ)存。使用PBS緩沖液漂洗3次后用1%鋨酸室溫固定5 h。再次使用PBS緩沖液漂洗3次后用乙醇梯度脫水。使用丙酮和包埋劑滲透隨后包埋。Leica UC60 超薄切片機(jī)切片，采用鈾鉛雙染色，在日立HT7650 型透射電鏡下觀察拍照。采用Excel 2019 和DPS 18.10 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析和Duncan 法比較差異顯著水平（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫對(duì)甜櫻桃葉片抗氧化系統(tǒng)酶活性的影響

由圖2 可知，高溫后A組葉片內(nèi)5 種酶活性均升高。其中，SOD、POD活性升幅較大，其值較高溫前分別升高了46.14%、131.63%。B組葉片內(nèi)SOD、POD、GR活性均升高，但CAT、APX活性下降，其值分別較高溫前下降了43.00%、27.83%。C組變化趨勢(shì)與A組相同，高溫后甜櫻桃葉片內(nèi)5 種酶活性均升高。其中，CAT、APX、GR活性在高溫后顯著升高，分別為高溫前活性的1.91、2.36、1.41 倍。當(dāng)溫度降低植株進(jìn)入恢復(fù)期，除POD活性仍升高外，其余4 種酶活性顯著降低。此時(shí)，CAT、APX活性仍顯著高于處理前的水平，SOD、GR活性則低于處理前的水平。

2.2 高溫對(duì)甜櫻桃葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和O2 ·-產(chǎn)生速率的影響

圖3 表明，高溫后A組甜櫻桃葉片內(nèi)MDA、脯氨酸含量及O2 ·-產(chǎn)生速率均升高。其中，脯氨酸含量、O2 ·-產(chǎn)生速率升高幅度較大，A、B組脯氨酸含量分別為高溫前的3.07、4.03 倍，O2 ·-產(chǎn)生速率分別為高溫前的2.37、2.48 倍?？扇苄缘鞍缀涂扇苄蕴呛孔兓煌?，A組甜櫻桃葉片的可溶性蛋白含量增加，而B組的含量下降，為處理前的54.18%；高溫后A組甜櫻桃葉片的可溶性糖含量降低，而B組的增加了1.32%。

C組各個(gè)指標(biāo)的變化趨勢(shì)與A組相同。高溫后甜櫻桃葉片內(nèi)MDA、可溶性蛋白含量少量增加，脯氨酸含量、O2 ·-產(chǎn)生速率則顯著升高，脯氨酸含量為高溫前的2.94 倍，O2 ·-產(chǎn)生速率為高溫前的2.25 倍，而可溶性糖含量降低了21.39%。當(dāng)溫度降低植株進(jìn)入恢復(fù)期，甜櫻桃葉片內(nèi)MDA、脯氨酸含量及O2 ·-產(chǎn)生速率仍呈升高趨勢(shì)，此時(shí)MDA、脯氨酸含量、O2·-產(chǎn)生速率為高溫前的1.08、10.63、6.36倍?；謴?fù)期葉片內(nèi)可溶性蛋白含量回降，顯著低于高溫前的水平，同時(shí)可溶性糖含量回升，高于高溫前的水平。

2.3 高溫對(duì)甜櫻桃葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

由圖4 可知，3 組甜櫻桃在高溫處理后，F(xiàn)v/Fm、Fv/Fo、ETR、NPQ 4 個(gè)參數(shù)值均呈現(xiàn)不同程度的下降。A組Fv/Fo下降幅度較大，其值比高溫前降低了37.00%；B組Fv/Fo、NPQ下降幅度較大，其值分別比高溫前降低了22.34%、32.04%；C 組Fv/Fo、ETR、NPQ 3 個(gè)參數(shù)值顯著降低，分別比高溫前降低了7.62%、40.90%、17.42%。恢復(fù)期內(nèi)，甜櫻桃葉片NPQ仍呈下降趨勢(shì)，而Fv/Fm、Fv/Fo、ETR 3 個(gè)參數(shù)值有所回升但仍低于處理前的水平。

2.4 高溫對(duì)甜櫻桃葉片葉肉細(xì)胞局部超顯微結(jié)構(gòu)的影響

由圖5 可見(jiàn)，高溫前細(xì)胞內(nèi)胞間隙較小，葉綠體呈長(zhǎng)橢圓形，緊貼于細(xì)胞壁，基粒排列整齊有序，可見(jiàn)到有少量嗜鋨顆粒分布。線粒體近圓形，多分布于2 個(gè)葉綠體之間，含有豐富的嵴。高溫后，葉綠體腫脹，部分形態(tài)扭曲呈不規(guī)則狀，逐漸向細(xì)胞中央靠攏，整個(gè)細(xì)胞中散布有淀粉粒和大量細(xì)胞碎片組成的團(tuán)塊（圖5-b）。葉綠體內(nèi)有體積較大的淀粉粒，受其擠壓類囊體片層出現(xiàn)扭曲，基質(zhì)片層明顯松散，結(jié)構(gòu)趨于紊亂。嗜鋨顆粒增大、積累并相互聚集（圖5-d）。線粒體嵴開始變得模糊，可見(jiàn)到明顯結(jié)晶（圖5-f）。

2.5 甜櫻桃生理指標(biāo)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)相關(guān)性分析

對(duì)C 組中14 個(gè)生理指標(biāo)相關(guān)性分析可知，在p＜0.01 差異水平下，多個(gè)指標(biāo)之間存在極顯著相關(guān)關(guān)系（圖6）。APX活性與CAT活性表現(xiàn)出極顯著正相關(guān)，與熒光參數(shù)ETR（r=-0.807）、Fv/Fo （r=-0.922）呈極顯著負(fù)相關(guān)，且與CAT 活性相關(guān)性極強(qiáng)（r=0.951）；CAT 活性與熒光參數(shù)ETR（r=-0.862）、Fv/Fo（r=-0.906）呈極顯著負(fù)相關(guān)；GR 活性與可溶性蛋白含量（r=0.909）呈極顯著正相關(guān)，與可溶性含量（r=-0.822）呈極顯著負(fù)相關(guān)；O2 ·-產(chǎn)生速率與脯氨酸含量（r=0.988）呈極顯著正相關(guān)且相關(guān)性極強(qiáng)，與可溶性蛋白含量（r=-0.844）呈極顯著負(fù)相關(guān)；脯氨酸含量與可溶性蛋白（r=-0.874）含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；ETR 與NPQ（r=0.832）、Fv/Fo （r=0.924）呈極顯著正相關(guān)。SOD 活性與GR 活性呈顯著正相關(guān)（r=0.716，p＜0.05），GR活性與O2 ·-產(chǎn)生速率（r=-0.758，p＜0.05）、脯氨酸含量呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.783，p＜0.05），O2 ·-產(chǎn)生速率與NPQ（r=-0.763，p＜0.05）呈顯著負(fù)相關(guān)，脯氨酸含量與NPQ（r=-0.777，p＜0.05）呈顯著負(fù)相關(guān)，可溶性蛋白含量與可溶性糖含量（r=-0.700，p＜0.05）呈顯著負(fù)相關(guān)。綜合可知，在田間試驗(yàn)中，甜櫻桃葉片中部分酶活性（CAT、APX）與部分熒光參數(shù)（ETR、Fv/Fo）之間、GR活性與多種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖）含量存在相關(guān)關(guān)系，而POD活性、MDA含量、Fv/Fm與其他指標(biāo)間并無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系。

對(duì)甜櫻桃高溫處理檢測(cè)的11 個(gè)具有相關(guān)性的生理指標(biāo)采用主成分分析法進(jìn)行因子分析。提取特征值＞1 的因子，結(jié)果表明，前2 個(gè)因子為主因子，其包含的信息量累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)89.881%（表1）。因子1的方差貢獻(xiàn)率為45.929%，選擇特征向量值較大的變量作為代表性變量為APX、SOD、GR 酶活性，定義為酶活參數(shù)因子。因子2 的方差貢獻(xiàn)率為43.952%，選擇特征向量值較大的變量作為代表性變量為ETR、NPQ，定義為熒光參數(shù)因子。

11 個(gè)具有相關(guān)性的生理指標(biāo)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換后，采用可變類平均法進(jìn)行聚類分析（圖7）。將11 個(gè)生理指標(biāo)聚為3 類：第1 類包括APX、CAT 活性，為酶活指標(biāo)；第2 類為GR活性，為酶活指標(biāo)；第3 類包括SOD活性、O2 ·-產(chǎn)生速率、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、ETR、NPQ、Fv/Fo，為混合指標(biāo)。結(jié)合相關(guān)性分析，APX活性與CAT活性呈極顯著正相關(guān)，與ETR、NPQ、Fv/Fo呈極顯著負(fù)相關(guān)，由此可見(jiàn)APX活性、GR活性、ETR可作為本試驗(yàn)中高溫對(duì)薩米脫生理影響較為代表性的指標(biāo)，可為今后甜櫻桃對(duì)高溫響應(yīng)的生理指標(biāo)篩選提供一定的參考。

2.6 高溫對(duì)甜櫻桃生理影響代表性指標(biāo)選擇

將聚類分析后篩選出的3 個(gè)指標(biāo)作為高溫對(duì)甜櫻桃生理影響較為代表性的指標(biāo)，采用K-均值法迭代計(jì)算對(duì)試驗(yàn)中進(jìn)行的3 組處理（7 種不同狀態(tài)）的甜櫻桃進(jìn)行動(dòng)態(tài)聚類。表2 結(jié)果表明，7 種不同狀態(tài)的甜櫻桃被分為3 類：第1 類包含處理T4，其對(duì)高溫響應(yīng)特征為高水平GR活性、低水平APX活性；第2 類包含處理T1、T2、T3、T5，對(duì)高溫響應(yīng)特征為高ETR指數(shù)、低水平GR活性；第3 類包含處理T6、T7，對(duì)高溫響應(yīng)特征為高水平APX 活性、低ETR 指數(shù)。結(jié)合甜櫻桃生理指標(biāo)熱圖（圖8）可知，T4 組各生理指標(biāo)值與其他處理有明顯差異，單獨(dú)為一類；T1、T3、T5 均代表各處理在高溫脅迫前的生理狀態(tài)，T2 各指標(biāo)與這三組數(shù)據(jù)相近，同屬于一類；T6、T7 為田間處理在高溫脅迫后的生理狀態(tài)，歸屬為一類。由此可知，聚類結(jié)果與7 種不同狀態(tài)下甜櫻桃生理指標(biāo)熱圖（圖8）分析結(jié)果相對(duì)應(yīng)，上述篩選的APX 活性、GR 活性、ETR 3 個(gè)指標(biāo)可作為本試驗(yàn)中高溫對(duì)薩米脫生理影響較為代表性的指標(biāo)，可為今后甜櫻桃對(duì)高溫響應(yīng)的生理指標(biāo)篩選提供一定的參考。

3 討論

極端高溫天氣頻發(fā)給植物生長(zhǎng)帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，植物對(duì)高溫的生理響應(yīng)及其分子機(jī)制的研究是耐高溫品種選育的基礎(chǔ)。正常情況下，植物體內(nèi)ROS保持在平衡狀態(tài)，高溫脅迫導(dǎo)致ROS 大量積累，對(duì)膜質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸高分子造成損傷[2]。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，植物已具備對(duì)各種非生物脅迫的適應(yīng)機(jī)制，包括ROS清除機(jī)制、滲透物質(zhì)調(diào)節(jié)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、信號(hào)級(jí)聯(lián)和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)[22]。ROS清除機(jī)制分為酶促和非酶促防御系統(tǒng)。SOD、POD、CAT、APX、GR均是酶促防御系統(tǒng)中的重要成員。SOD是植物體內(nèi)唯一能夠清除O2·-的酶，可有效減輕脅迫對(duì)膜系統(tǒng)的傷害，是抵御氧化脅迫的第一道防線。SOD催化光系統(tǒng)Ⅰ （photosystem Ⅰ ，PSⅠ） 中產(chǎn)生的O2 ·- 轉(zhuǎn)化為H2O2，其后在CAT 或其他還原劑參與下被APX、POD等轉(zhuǎn)化為H2O。夏黑葡萄在35、45 ℃高溫處理后POD、CAT 活性快速升高[5]。油桃在高溫環(huán)境下SOD活性緩慢升高，CAT 活性先升高后下降[23]。高溫干旱處理下，香梨葉片中SOD、CAT 活性升高，POD活性先升高隨后下降[24]。但是，高溫對(duì)北高叢越橘SOD活性影響并不大，只對(duì)POD、CAT 活性有改變[11]。本試驗(yàn)中，經(jīng)歷田間高溫后C組甜櫻桃葉片中SOD、POD、CAT活性均升高，人工高溫處理后A組葉片中3種酶活性亦升高，而B組葉片中CAT活性顯著降低，這很可能與試驗(yàn)材料的選擇有關(guān)。B組試驗(yàn)材料為離體葉片，相對(duì)A、C組材料其代謝強(qiáng)度降低。通常認(rèn)為，CAT活性與植物抗逆性及植物代謝強(qiáng)度密切相關(guān)[25]。APX 活性也有同樣的變化趨勢(shì)。APX和GR是抗環(huán)血酸-谷胱甘肽（ASA-GSH）循環(huán)中的限速酶，該循環(huán)在清除H2O2、調(diào)控細(xì)胞H2O2水平上有重要作用。在葉綠體中，GR平衡ROS 濃度，防止膜脂過(guò)氧化以保護(hù)類囊體膜系統(tǒng)維持有效的光合作用[26]。因此，GR活性通常被認(rèn)為是機(jī)體內(nèi)抗氧化狀態(tài)的重要標(biāo)志[21]。高溫處理下，杜鵑葉片的APX、GR活性隨脅迫程度加深先升高后降低[27]，野扇花APX活性也呈現(xiàn)同樣變化[28]。本試驗(yàn)中，高溫使A、C 2組中甜櫻桃葉片的APX、GR酶活性均升高，但B組葉片中APX活性降低。結(jié)合相關(guān)性分析可知，APX活性與CAT活性之間存在極顯著正相關(guān)，故B組中CAT和APX活性的變化呈現(xiàn)相同趨勢(shì)。

MDA含量和O2 ·-產(chǎn)生速率是衡量膜脂過(guò)氧化、植物氧化脅迫程度的重要指標(biāo)。高溫脅迫下，油桃MDA含量則呈微增-減少-增加趨勢(shì)[23]。本試驗(yàn)中，高溫使得3 組甜櫻桃葉片MDA含量升高，O2 ·-產(chǎn)生速率較處理前顯著升高，這與前人在櫻桃中的研究結(jié)果相同[18-19]。在C組中，即使后期溫度下降，葉片內(nèi)MDA含量和O2 ·-產(chǎn)生速率仍呈升高趨勢(shì)，表明高溫對(duì)甜櫻桃造成損傷，膜脂過(guò)氧化程度較高。在正常狀態(tài)下，葉綠體中O2 ·-產(chǎn)生速率約為240 μmol·s-1，但在逆境條件下速率為240～720 μmol · s-1[10]。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，甜櫻桃正常狀態(tài)下葉片中O2 ·-產(chǎn)生速率＜100 μmol · s- 1，但高溫脅迫后速率升高至100～300 μmol · s- 1。除抗氧化酶系統(tǒng)外，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖等）通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透平衡來(lái)抵制外界脅迫對(duì)植物造成的傷害[2]。研究表明，耐熱性強(qiáng)的品種脯氨酸含量更高，在高溫干旱處理下，香梨葉片中可溶性蛋白含量下降，可溶性糖含量逐漸增加[24]。本試驗(yàn)C組中，高溫使甜櫻桃葉片內(nèi)可溶性糖含量降低，可溶性蛋白含量升高。A組葉片內(nèi)同樣指標(biāo)亦呈相同變化，但B組葉片中則呈相反趨勢(shì)，這很可能與葉片離體后源庫(kù)關(guān)系改變有關(guān)。

葉綠體是植物細(xì)胞中對(duì)熱脅迫較敏感的細(xì)胞器。研究表明，高溫脅迫會(huì)使葉綠體性狀趨于圓形并向細(xì)胞中央轉(zhuǎn)移，被膜出現(xiàn)不同程度的斷裂，類囊體片層松散并隨機(jī)分布著大量嗜鋨顆粒。嗜鋨顆粒的大小和數(shù)量通常與膜脂過(guò)氧化程度密切相關(guān)[8]，顆粒體積變大并積累預(yù)示細(xì)胞老化和解體。光合作用的一部分同化產(chǎn)物以淀粉形式在植物體內(nèi)積累。高溫脅迫下植物韌皮部胼胝體增多導(dǎo)致維管束堵塞，從而影響同化產(chǎn)物在韌皮部的運(yùn)輸，淀粉粒逐漸積累[29]。本試驗(yàn)中，高溫后甜櫻桃葉綠體和線粒體受到不同程度損傷，表現(xiàn)為葉綠體外形膨脹變圓、類囊體片層扭曲、基質(zhì)片層明顯松散、結(jié)構(gòu)趨于紊亂、淀粉粒及嗜鋨顆粒增大并積累和線粒體嵴開始變得模糊等。葡萄、越橘在高溫脅迫后葉綠體中出現(xiàn)大量巨型淀粉粒及大量嗜鋨顆粒[8，11]，與本試驗(yàn)中研究結(jié)果一致。

PSⅠ和PSⅡ反應(yīng)中心是ROS產(chǎn)生的主要位點(diǎn)，脅迫條件下PSⅠ比PSⅡ穩(wěn)定，PSⅡ?qū)Ω邷孛舾衃30]。葉綠素?zé)晒饪煽焖贌o(wú)損收集PSⅡ性能相關(guān)數(shù)據(jù)，是對(duì)類囊體膜功能變化情況的定量檢測(cè)。Fv/Fm、Fv/Fo是鑒定植物是否遭受高溫脅迫的重要熒光參數(shù)，其中最大光化學(xué)量子產(chǎn)率Fv/Fm，是植物PSⅡ系統(tǒng)初始光能轉(zhuǎn)換效率的標(biāo)志指標(biāo)，通常認(rèn)為該值與植物的耐熱性具有良好一致性[31]，是耐熱性鑒定的重要指標(biāo)。高溫脅迫下快白菜Fv/Fm降低[32]，同樣的變化在草莓、葡萄、越橘[7，9，11，31]等多個(gè)樹種上都有報(bào)道。葉綠體結(jié)構(gòu)和光合性能密切相關(guān)。本試驗(yàn)中，高溫處理使葉綠體結(jié)構(gòu)受損，F(xiàn)v/Fm、Fv/Fo、ETR、NPQ 均出現(xiàn)不同程度下降，表明高溫抑制了甜櫻桃光能轉(zhuǎn)化效率，PSⅡ反應(yīng)中心活性下降，同化力（NADPH、ATP）形成受阻，對(duì)碳固定同化造成了影響，熱耗散的能量降低。PSⅡ的最大效率與積累的ROS之間存在線性關(guān)系[33]，這在本試驗(yàn)中相關(guān)性分析中也被證實(shí)。

主成分分析是考察多個(gè)變量間相關(guān)性的常用多元統(tǒng)計(jì)方法之一，在植物抗逆性鑒定與評(píng)價(jià)研究中廣泛應(yīng)用[31，34]。田間栽培是果樹引種適應(yīng)性栽培過(guò)程中各種性狀考察的主要場(chǎng)所，在田間具有優(yōu)良性狀和較高抗性的品種才具備推廣的價(jià)值。本研究對(duì)C組各個(gè)指標(biāo)，通過(guò)主成分分析將具有相關(guān)性關(guān)系的生理指標(biāo)降維及系統(tǒng)聚類分析，篩選出3 個(gè)指標(biāo)作為高溫對(duì)甜櫻桃生理影響的代表性指標(biāo)。利用篩選出的3 個(gè)代表性指標(biāo)將試驗(yàn)中3 組處理7 種狀態(tài)進(jìn)行動(dòng)態(tài)聚類分析，分類結(jié)果與實(shí)際測(cè)得各狀態(tài)間指標(biāo)差異情況吻合。由此可知，上述篩選的APX活性、GR活性、ETR 3 個(gè)指標(biāo)可作為本試驗(yàn)中高溫對(duì)薩米脫生理影響的代表性指標(biāo)，為今后甜櫻桃對(duì)高溫響應(yīng)的生理指標(biāo)篩選提供一定的參考。

4 結(jié)論

高溫處理使甜櫻桃受到氧化損傷，葉綠體、線粒體結(jié)構(gòu)受損，抗氧化酶系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)均對(duì)脅迫做出響應(yīng)，以維持抗氧化酶系統(tǒng)的穩(wěn)定，降低膜透性損害。APX活性、GR活性、ETR 3 個(gè)指標(biāo)可作為高溫對(duì)薩米脫生理影響的代表性指標(biāo)，為今后甜櫻桃對(duì)高溫響應(yīng)的生理指標(biāo)篩選提供一定的參考。參考文獻(xiàn)References：

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