健脾降脂顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究*

李成森，周春玲，王曉月，童冰妮，孔令鋒，麥志雄△

（1. 遼寧省檢驗(yàn)檢測認(rèn)證中心·遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測院，遼寧 沈陽 110000； 2. 廣西梧州制藥＜集團(tuán)＞股份有限公司，廣西 梧州 543000）

肥胖可導(dǎo)致高血壓、糖尿病、血脂異常［1-2］等心血管疾病的發(fā)病率上升，從而引起多臟器功能損壞，影響生活質(zhì)量［3］。血脂異常伴有高血壓顯著增加死亡風(fēng)險(xiǎn)［4］，故調(diào)控血脂、有效控制血壓和血糖能控制心血管疾病的發(fā)生。高脂血癥中醫(yī)屬“血瘀”“痰濁”范疇，主要通過抑制外源性脂類和膽酸的吸收，抗氧化、抑制脂類物質(zhì)的合成，減少脂類物質(zhì)在血管內(nèi)皮的沉積而發(fā)揮調(diào)脂作用［5-7］，傳統(tǒng)中藥在高脂血癥的防治中發(fā)揮了重大作用。健脾降脂顆粒由南山楂、澤瀉、丹參、黨參、靈芝、遠(yuǎn)志6 味中藥組方，具有健脾化濁、益氣活血功效，主要用于脾運(yùn)失調(diào)、氣虛、血瘀引起的高脂血癥［8］，癥見眩暈耳鳴、胸悶納呆、心悸氣短等。處方以山楂為君藥，黨參、丹參為臣藥，其中黨參和胃消食，丹參活血祛瘀，可輔助山楂消食健胃、化濁降脂。丹參主要有效成分為水溶性的酚酸類成分，具有顯著改善微循環(huán)、抗內(nèi)皮損傷、抗氧化等藥理活性［9］。健脾降脂顆?，F(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)為《國家食品藥品監(jiān)督管理局 國家藥品標(biāo)準(zhǔn)》WS3- 013（Z -03）-2001（Z），但缺少對(duì)于丹參、遠(yuǎn)志等藥材的專屬性鑒別和特征性成分定量測定方法。參考文獻(xiàn)［10 - 14］和2020 年版《中國藥典（一部）》，本研究中建立了丹參［15］77、遠(yuǎn)志［15］163、黨參［15］293的定性鑒別方法，以及以丹參素鈉為指標(biāo)成分的樣品含量測定方法，為健脾降脂顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），配有G7117C 型二極管陣列檢測器；AS20500 型超聲波清洗機(jī)（天津奧特賽恩斯儀器有限公司，頻率為40 kHz，功率為280 W）；CAMAG - reprostar 3 照相系統(tǒng)（瑞士Camag公司）；Milli-Q 型超純水儀（美國Millipore公司）；CP225D 型電子天平（精度為十萬分之一），CWBSA224S - CW 型電子天平（精度為萬分之一），均購于德國Sartorius公司。

1.2 試藥

遠(yuǎn)志對(duì)照藥材（批號(hào)為120989 - 201908），丹參對(duì)照藥材（批號(hào)為121923-201816），黨參炔苷對(duì)照品（批號(hào)為111732-201908，供鑒別用），丹參素鈉對(duì)照品（批號(hào)為110855 - 201915，純度為97.8%），均購于中國食品藥品檢定研究院；薄層色譜板（青島海洋化工廠，批號(hào)為20201012）；健脾降脂顆粒（遼寧美大康藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為210301，210302，210303，210304，210305，210401，210402，210403，210404，210405；廣西梧州制藥＜集團(tuán)＞有限公司，批號(hào)分別為210801，210802，210803，210804，210805，210806，210807，210808，210809，210810）；試驗(yàn)用陰性樣品由實(shí)驗(yàn)室自制；甲醇（批號(hào)為110855 - 201915），乙腈（批號(hào)為110855-201915），均為色譜純，購于美國天地有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

遠(yuǎn)志：取樣品10 g，研細(xì)，加三氯甲烷50 mL，回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。取遠(yuǎn)志對(duì)照藥材0.5 g，加水25 mL，加熱回流30 min，濾過，取濾液，回收溶劑至干，加三氯甲烷50 mL，回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。按處方工藝制備不含遠(yuǎn)志的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。吸取供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各20 μL、對(duì)照藥材溶液10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 板，顯色劑為石油醚（60～90 ℃）- 丙酮（2∶1，V/V），展開，于紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無干擾。詳見圖1 A。

1-10. 供試品溶液 11-12. 對(duì)照藥材溶液 13. 陰性對(duì)照品溶液（缺遠(yuǎn)志、缺丹參）A. 遠(yuǎn)志 B. 丹參圖1 薄層色譜圖1-10.Test solution 11-12.Reference medicinal solution 13.Negative reference solution（lacking Polygalae Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma）A.Polygalae Radix B.Salviae Miltiorrhizae Radix et RhizomaFig.1 TLC chromatograms

丹參：取樣品10 g，研細(xì)，加水10 mL 使溶解，加乙酸乙酯-甲酸（50∶0.1，V/V）50 mL，振搖提取，分取乙酸乙酯液，用水洗滌2次，每次10 mL，取乙酸乙酯液，加硅膠G 1 g，搖勻，濾過，濾液置水浴上濃縮至0.5 mL，作為供試品溶液。取丹參對(duì)照藥材2.5 g，加水30 mL，加熱回流30 min，濾過，取濾液，按供試品溶液制備方法制備對(duì)照藥材溶液。按處方工藝制備不含丹參的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液和陰性對(duì)照品溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 板，展開劑為三氯甲烷- 丙酮- 甲酸（10∶4∶1，V/V/V），展開，噴以5%香草醛硫酸溶液。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無干擾。詳見圖1 B。

黨參：取樣品20 g，研細(xì)，加熱水50 mL，離心，取上清液25 mL，加水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2 次，每次25 mL，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL 容量瓶中，加甲醇定容，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。取黨參炔苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL 含10μg 的溶液，即得對(duì)照品溶液。按處方工藝制備不含黨參的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。設(shè)置色譜條件，色譜柱為Agilent TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-水（20∶80，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm，進(jìn)樣量為20μL。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處有色譜峰出現(xiàn)，且陰性對(duì)照無干擾。詳見圖2。

1. 黨參炔苷A. 對(duì)照品溶液 B. 供試品溶液 C. 陰性對(duì)照品溶液圖2 黨參炔苷定性鑒別高效液相色譜圖1.LobetyolinA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms for the qualitative identification of labetyolin

2.2 丹參素鈉含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：DiamonsilTMC18柱（250 mm × 4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-1%冰醋酸溶液（6∶94，V/V）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：20 μL。理論板數(shù)按丹參素鈉峰計(jì)應(yīng)不低于6 000。

2.2.2 溶液制備

取丹參素鈉對(duì)照品適量，精密稱定，加25%甲醇制成每1 mL 含丹參素鈉10μg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。取裝量差異項(xiàng)下的樣品，研細(xì)，取0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用25%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。按處方工藝制備不含丹參的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各20μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果丹參素鈉和供試品溶液中的其他成分均達(dá)到基線分離，且陰性對(duì)照無干擾。詳見圖3。

1. 丹參素鈉A. 對(duì)照品溶液 B. 供試品溶液 C. 陰性對(duì)照品溶液圖3 丹參素鈉專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖1.Sodium DanshensuA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms of the specificity test of Sodium Danshensu

線性關(guān)系考察：取丹參素鈉對(duì)照品適量，精密稱定，加25%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.542，2.710，10.840，27.100，54.200 μg/ mL 的系列溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以丹參素鈉質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=12.543X+0.498（R2=0.999 9，n= 6）。結(jié)果表明，丹參素鈉質(zhì)量濃度在0.542～54.200μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.2.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定6 次，記錄色譜圖。結(jié)果丹參素鈉峰面積的RSD為0.50%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)210810）適量，精密稱定，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h 時(shí)按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果丹參素鈉峰面積的RSD為1.50%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)210810）適量，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果丹參素鈉的平均含量為0.518 mg/ g，RSD為1.37%（n= 6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)210810）0.25 g，精密稱定，共6 份，分別精密加入2.2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為0.108 4 mg/mL）1 mL，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測定

取遼寧美大康藥業(yè)有限公司和廣西梧州制藥（集團(tuán)）有限公司生產(chǎn)的樣品各10 批，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定3 次，記錄色譜圖，并計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品中丹參素鈉含量測定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.2 Results of the content determination of Sodium Danshensu in samples（mg/g，n=3）

3 討論

曾考察樣品中澤瀉的薄層色譜鑒別，比較2種供試品溶液的制備方法，分別出現(xiàn)陰性干擾和對(duì)照藥材未顯斑點(diǎn)的情況，未來尚需進(jìn)一步研究澤瀉的鑒別方法。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)和反復(fù)試驗(yàn)均未找出較合適的指標(biāo)成分以確定方中南山楂的指標(biāo)性成分槲皮素、山柰酚等黃酮類成分的含量，未來將對(duì)南山楂藥材進(jìn)行研究，以期達(dá)到控制成藥的目的。

曾比較丹參素鈉含量測定的超聲提取和回流提取2種方法，考察20%～70%甲醇的提取溶劑、15～60 min的提取時(shí)間、不同體積的提取溶劑量、色譜柱、流動(dòng)相等。最終，確定了2.2.1項(xiàng)下色譜條件。

本研究中增加了遠(yuǎn)志、丹參、黨參的定性鑒別和丹參藥材中丹參素鈉的含量測定方法，建立的方法簡便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可為健脾降脂顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考。