大鼠睪丸支持細(xì)胞的分離鑒定及低氧對其增殖的影響

蔡朦朦，楊習(xí)曼，張芳，秦琴*

（1.山西醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué) 第五臨床醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001）

0 引言

Enrico Sertoli 在1865 年提出“支持細(xì)胞”（Sertoli cell，SC）的概念［1］。目前已獲得多種永生化的支持細(xì)胞系，但這類細(xì)胞有著表型改變，對激素的反應(yīng)不敏感，免疫特性分化等缺點(diǎn)；相比之下，原代支持細(xì)胞保留原物種的特性，是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域研究的金標(biāo)準(zhǔn)［2］。Cameron 等［3］在20 世紀(jì)90 年代創(chuàng)立了大鼠睪丸原代支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，但有著操作繁瑣，培養(yǎng)溫度過高，支持細(xì)胞純度低等明顯缺陷。在此基礎(chǔ)上，國內(nèi)學(xué)者多采用兩步酶消化法，37 ℃培養(yǎng)獲取大鼠睪丸原代支持細(xì)胞［4-5］，Bernardino 等［6］采用精細(xì)的機(jī)械分離和一系列酶消化提取支持細(xì)胞，該領(lǐng)域國內(nèi)外學(xué)者普遍采用機(jī)械法和酶消化法分離大鼠睪丸支持細(xì)胞，但是都存在酶消化時(shí)間過度、間質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞無法除盡以及細(xì)胞產(chǎn)量低等不足之處。

支持細(xì)胞在精子發(fā)生過程為生殖細(xì)胞提供營養(yǎng)支持、免疫保護(hù)、吞噬清除、血睪屏障功能等，被稱為生精細(xì)胞的“保姆細(xì)胞”［7］。精索靜脈曲張（varicocele，VC）、睪丸扭轉(zhuǎn)、無精子癥、高海拔缺氧等都會引起男性睪丸內(nèi)供氧不足，損害睪丸細(xì)胞的功能、精子的數(shù)量和活力［8］。有報(bào)道在低氧誘導(dǎo)的動物模型中，睪丸內(nèi)發(fā)生極度缺氧，支持細(xì)胞呈現(xiàn)脂滴改變和高度空泡化，與生殖細(xì)胞間隙連接被破壞，出現(xiàn)精子數(shù)量減少的現(xiàn)象［9-10］。Galardo 等［11］為探索缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）是否參與大鼠支持細(xì)胞乳酸產(chǎn)生和促卵泡刺激素（FSH）滋養(yǎng)細(xì)胞功能，Hao 等［12］為研究缺氧對支持細(xì)胞增殖和 occludin 蛋白的表達(dá)，分別用氯化鈷、梯度氧濃度體外刺激大鼠支持細(xì)胞建立了低氧支持細(xì)胞模型。本研究擬通過改良過往分離純化原代支持細(xì)胞的方法，優(yōu)化培養(yǎng)細(xì)節(jié)，以獲取高純度的原代支持細(xì)胞制備低氧支持細(xì)胞模型，模擬各種臨床男性不育癥導(dǎo)致的睪丸內(nèi)的低氧狀態(tài)，闡述男性生精障礙的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

18 d-22 d 的健康Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，由山西省人民醫(yī)院動物中心提供。

1.1.2 主要試劑

DMEM/F12 培養(yǎng)基購自Hyclone 公司，胎牛血清購自美國Gibco 公司；胰酶、DNA 酶、I 型膠原酶、油紅O、伊紅染液購自北京索萊寶公司；鼠抗-Vimentin 抗體購自Santa Cruz 公司；CY3 羊抗小鼠IgG 二抗購自武漢博士德公司，兔抗-HIF-1α 抗體購自北京博奧森公司，兔抗-PCNA 抗體購自美國Proteintech 公司，羊抗兔IgG 二抗購自武漢愛博泰克公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱、三氣培養(yǎng)箱購自德國美墨爾特公司；普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡購置日本尼康公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）電泳儀/電轉(zhuǎn)儀/半干轉(zhuǎn)儀/凝膠成像分析儀器購自美國Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 原代支持細(xì)胞的分離與純化

對解剖室進(jìn)行紫外殺菌后，將SD 雄鼠頸椎脫臼處死，大鼠在體積分?jǐn)?shù)75%酒精中浸泡10 min后取出，無菌器械取出睪丸，置于4 ℃ 預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（prechilled phosphate-buffered saline，PBS）中清洗兩遍去除睪丸表面黏液，剪刀剝離睪丸白膜，用鑷子機(jī)械去除細(xì)胞外基質(zhì)；暴露睪丸實(shí)質(zhì)后，去除其中夾雜的血管雜質(zhì)，PBS 清洗兩次后，用眼科剪將睪丸實(shí)質(zhì)剪碎成約1 mm3的碎塊，加入配置的甘氨酸溶液振蕩混勻，靜置10 min，待組織沉降后移除上清液，加入剩余組織液4 倍體積的體積分?jǐn)?shù)0.25%胰酶（pH 7.4）溶液，37 ℃水浴消化15 min，加入含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基（含有2.5 mmol/LL-谷氨酰胺，15 mmol/L HEPES，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/ml）終止消化，反復(fù)輕輕吹打后，吸取上清液保存，隨后將剩余沉淀加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.022 5%Ⅰ型膠原酶和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.005% DNA 酶的混合液（pH 7.4）在37 ℃水浴消化10 min，終止消化后，反復(fù)吹打成團(tuán)的細(xì)胞，用400 目過濾篩過濾兩次酶消化后的細(xì)胞，將收獲的細(xì)胞用37 ℃預(yù)熱PBS 和培養(yǎng)基先后分別洗滌3 次，每次1000 r/min，離心5 min，結(jié)束后細(xì)胞重懸于完全培養(yǎng)基，以2×106/孔均勻鋪在6 孔板中，置于35 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至2 d 后，用20 mmol/L Tris-HCL（pH 7.4）溶液低滲處理去除精原細(xì)胞，待支持細(xì)胞完全貼壁且生長狀態(tài)達(dá)到最佳，對其進(jìn)行相應(yīng)處理用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 原代支持細(xì)胞的鑒定

1.2.2.1 免疫熒光檢測Vimentin 蛋白

24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中放置用多聚賴氨酸包被的玻片，將提取的原代支持細(xì)胞以4×105/孔接種在培養(yǎng)板中，制作細(xì)胞爬片，經(jīng)過純化培養(yǎng)4 d 后，預(yù)冷PBS 洗滌2 遍，常溫下用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% 多聚甲醛固定細(xì)胞30 min；之后用PBS洗滌3 遍，每次5 min，每個(gè)細(xì)胞爬片加500 μL體積分?jǐn)?shù)0.1% TritonX-100，孵育20 min，PBS洗滌3 遍后，繼續(xù)加入體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫溶液孵育10 min；換用TBST 洗滌3 次后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% 牛血清白蛋白（5%BSA）封閉細(xì)胞1 h，隨后加入含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% BSA 的PBS 稀釋的鼠抗-Vimentin 抗體（1∶100），4 ℃過夜后，細(xì)胞用PBS 洗滌三遍，滴加CY3 羊抗小鼠IgG 二抗，室溫下在搖床上孵育1 h，PBS 洗滌3 次后，加入DAPI 染核15 min，PBS 洗滌后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)Vimentin 蛋白表達(dá)并拍照。

1.2.2.2 HE染色

原代支持細(xì)胞培養(yǎng)至4 d，質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗滌3 次，每次2 min，蘇木素染細(xì)胞核10 min，蒸餾水洗3 次每次5 min，鹽酸酒精分化數(shù)秒后，自來水洗返藍(lán)，加入伊紅染液染色5 min 后，自來水洗后，進(jìn)行梯度酒精脫水，二甲苯洗滌2 次，每次2 min，最后用中性樹膠封片。

1.2.2.3 油紅O染色

原代支持細(xì)胞培養(yǎng)至 4 d，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定，4 ℃預(yù)冷的 PBS 洗滌后，油紅O 染液在 37 ℃下染色 30 min，用 體積分?jǐn)?shù)60%異丙醇分色至背景無色，PBS 洗3 次，蘇木素染核10 min，自來水藍(lán)化 10 min，蒸餾水洗后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%甘油封片。

1.2.3 制備低氧支持細(xì)胞模型

1.2.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

隨機(jī)將處于生長對數(shù)期的原代SC 分為3 組，常氧組（對照組，N組）、低氧24 h組、低氧48 h組；N組細(xì)胞分別在體積分?jǐn)?shù)21% O2、35 ℃二氧化碳箱繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，低氧24 h 組、低氧48 h 組在1%O2、35 ℃的三氣培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h和48 h。

1.2.3.2 免疫熒光檢測支持細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的表達(dá)

3 組SC 經(jīng)固定、抑制內(nèi)源性過氧化物、破膜、封閉處理后，加入含1% BSA 兔抗-HIF-1α抗體（1∶100），4 ℃孵育過夜后，加入488-羊抗兔IgG 二抗，孵育1 h 后，洗滌，加入DAPI 染核，封片，熒光顯微鏡下觀察每組細(xì)胞爬片HIF-1α 的表達(dá)情況，不同批次的SC 重復(fù)3 次以上實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.3 western blot測定HIF-1α、PCNA蛋白

將培養(yǎng)好SC 加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液（100∶1），冰上裂解20 min，12 000 r/min、離心15 min 提取SC 內(nèi)蛋白；進(jìn)行SDS-PAGE電泳，每孔上樣量為50 μg，60 V～80 V 條件下蛋白條帶泳至電泳槽底部，將凝膠中的目的蛋白和內(nèi)參蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入兔抗-HIF-1α抗體（1∶1000）、兔抗-PCNA 抗體（1∶2000）、HRP 標(biāo)記的β-actin 抗 體（1∶5000），4 ℃孵育過夜。TBST 洗滌后，加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 多克隆抗體（1∶8000），室溫孵育1 h，TBST 再次洗滌3 次。用凝膠成像分析儀進(jìn)行條帶顯影和拍照，Image J 軟件分析條帶灰度值。計(jì)算HIF-1α、PCNA 的平均光密度比值：HIF-1α、PCNA（目的蛋白）光密度值/β-actin（內(nèi)參蛋白）光密度值。分析3 組蛋白表達(dá)差異性，不同批次的SC 重復(fù)3 次以上的實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0 處理數(shù)據(jù)。各組蛋白表達(dá)灰度值以xˉ±S表示，單因素方差分析及LSD 用于組間比較，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 原代支持細(xì)胞的形態(tài)和特征鑒定

2.1.1 大鼠睪丸原代支持細(xì)胞的形態(tài)和生長特點(diǎn)

初步提取的支持細(xì)胞是體積較小的圓點(diǎn)，呈現(xiàn)較強(qiáng)的折光性，培養(yǎng)2 d 后支持細(xì)胞呈梭形，伸出一個(gè)或多個(gè)突觸，幾乎完全貼壁，經(jīng)Tris-HCl 低滲處理后可除去漂浮的生精細(xì)胞，培養(yǎng)至第3-4 d，胞體變大呈橢圓形，胞核明顯，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)圓形發(fā)亮的脂滴，細(xì)胞間互相連接呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；細(xì)胞培養(yǎng)至一周時(shí)，整個(gè)胞體拉伸變長變大，細(xì)胞間連接成單層片狀，此后細(xì)胞生長速度變慢；傳代后支持細(xì)胞幾乎停止增殖，生長緩慢，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)不佳，支持細(xì)胞的體外生長周期為2 周左右（圖1）。

圖1 原代支持細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察（a）剛提取的原代支持細(xì)胞；（b）培養(yǎng)2 d的原代支持細(xì)胞；（c）培養(yǎng)3 d的原代支持細(xì)胞；（d）培養(yǎng)4 d的原代支持細(xì)胞；（e）培養(yǎng)7 d的原代支持細(xì)胞；（f）第一代支持細(xì)胞（Bar=100 μm）Fig.1 Culture and morphological observation of primary Sertoli cells(a) Freshly extracted primary Sertoli cells; (b) Primary Sertoli cells cultured for 2 days; (c) Primary Sertoli cells cultured for 3 days;(d) Primary Sertoli cells cultured for 4 days; (e) Primary Sertoli cells cultured for 7 days;(f) Sertoli cells of the first generation (Bar=100 μm)

2.1.2 支持細(xì)胞內(nèi)Vimentin蛋白的表達(dá)

Vimentin 是支持細(xì)胞的特異性結(jié)構(gòu)標(biāo)志［13］，熒光顯微鏡下細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)發(fā)出明亮的紅色熒光，紅色熒光幾乎布滿整個(gè)胞質(zhì)，包裹著圓形或橢圓型的胞核，表示細(xì)胞內(nèi)含有Vimentin 蛋白與Vimentin 抗體發(fā)生了特異性結(jié)合，即紅色熒光的細(xì)胞為SC；非特異性DAPI 染色的胞核發(fā)出藍(lán)色熒光，代表了全部細(xì)胞總數(shù)；鏡下隨機(jī)選取15 個(gè)不同視野下的支持細(xì)胞，每個(gè)視野下隨機(jī)計(jì)數(shù)200 個(gè)細(xì)胞，SC 的純度= Vimentin 陽性細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%，支持細(xì)胞純度約為99.43%（圖2）。

圖2 Vimentin免疫熒光鑒定睪丸原代支持細(xì)胞（a）細(xì)胞質(zhì)中Vimentin陽性表達(dá)；（b）細(xì)胞核DAPI染色；（c）a與b疊加圖片（Bar=50 μm）Fig.2 Vimentin immunofluorescence identification of primary Sertoli cells in testis(a) Vimentin positive expression in the cytoplasm; (b) DAPI staining of the nucleus;(c) superimposed pictures of a and b (Bar=50 μm)

2.1.3 HE染色和油紅O染色的支持細(xì)胞

HE 染色下的SC 細(xì)胞整個(gè)胞體呈梭形或不規(guī)則狀，有一個(gè)或多個(gè)粗大突起，胞質(zhì)豐富呈淡紅色；油紅O 染色下的SC，胞體不規(guī)則，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大小不一的紅色圓形脂滴，胞核呈現(xiàn)圓形或橢圓形淡紫色（圖3）。

圖3 原代支持細(xì)胞的HE染色、油紅O染色（a）HE染色，“↑”所指為原代支持細(xì)胞（200×）；（b）油紅O染色，“↑”所指為原代支持細(xì)胞中的紅色脂滴（Bar=20 μm）Fig.3 HE staining and oil red O staining of primary Sertoli cells(a) "↑" points at primary Sertoli cells (200×); (b) "↑" points at the red lipid droplets in the primary Sertoli cells (Bar=20 μm)

2.2 低氧對支持細(xì)胞生長和增殖的影響

2.2.1 體積分?jǐn)?shù)1%O2培養(yǎng)的支持細(xì)胞生長狀態(tài)

低氧培養(yǎng)的SC 胞質(zhì)內(nèi)顆粒物質(zhì)增多、胞體回縮、間隙增大、SC 有明顯的空泡、生長狀態(tài)不佳，隨著缺氧時(shí)間的延長，SC 死亡明顯增多（圖4）。

圖4 低氧培養(yǎng)24 h、48 h的原代支持細(xì)胞（a）低氧培養(yǎng)24 h的原代支持細(xì)胞；（b）低氧培養(yǎng)48 h的支持細(xì)胞；“↑”所指為支持細(xì)胞內(nèi)的空泡（Bar=50 μm）Fig.4 Primary Sertoli cells cultured in hypoxia for 24 h and 48 h(a) Primary Sertoli cells under 24-hour hypoxia;(b) Primary Sertoli cells under 48 h hypoxia; "↑" refers to vacuoles in Sertoli cells (Bar=50 μm)

2.2.2 低氧下原代支持細(xì)胞HIF-1α 和PCNA 的表達(dá)

免疫熒光結(jié)果顯示，常氧時(shí) HIF-1α 在SC胞質(zhì)中表達(dá)。低氧處理24 h 后，部分HIF-1α進(jìn)入細(xì)胞核，48 h 大量HIF-1α 進(jìn)入細(xì)胞核（圖5）。western blot 的結(jié)果顯示，與常氧組相比，低氧24 h 組［（1.30±0.17）vs（0.54±0.17），P＜0.05）］和低氧48 h 組［（1.09±0.17）vs（0.54±0.17），P＜0.05）］的HIF-1α 表達(dá)水平顯著升高；PCNA 蛋白在低氧24 h 組［（0.47±0.08vs0.75±0.08，P＜0.05）］和低氧48 h 組［（0.23±0.08）vs（0.75±0.08），P＜0.05）］隨著低氧時(shí)間的延長而顯著性降低，而低氧24 h組和低氧48 h 組，HIF-1α、PCNA 表達(dá)量均無顯著性差異（P＞0.05）（圖6）。

圖6 低氧對支持細(xì)胞HIF-1α和PCNA蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effects of hypoxia on the expression of HIF-1α and PCNA proteins in primary Sertoli cells

3 討論

國內(nèi)外學(xué)者常用胰酶和膠原酶兩步法結(jié)合39 ℃或37 ℃的熱應(yīng)激原理誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡法分離純化大鼠睪丸SC［14-15］，但仍存在實(shí)驗(yàn)時(shí)間長、損傷支持細(xì)胞等缺點(diǎn)。在以往研究基礎(chǔ)上，我們總結(jié)了提高SC 提取效率的關(guān)鍵點(diǎn)：（1）動物選擇：出生18-22 d 處于青春前期大鼠，此期大鼠睪丸支持細(xì)胞豐富且增殖力較強(qiáng)，生精細(xì)胞數(shù)量相比于成熟期少，污染率低，睪丸還未下沉到陰囊部位，支持細(xì)胞更容易分離純化［6］。（2）消化過程：生精小管被剪碎后加入甘氨酸溶液隨重力下沉，能夠更好地釋放消除睪丸間質(zhì)細(xì)胞；胰酶消化后保留上清液，目的是防止分離的SC 二次消化過度，提高了SC 產(chǎn)量；二次酶消化過程中，在I 型膠原酶中加入了DNA 酶，相比于大多數(shù)學(xué)者使用單一的IV 型膠原酶，二次消化酶混合液濃度較低，對細(xì)胞的損傷小，同時(shí)加快了第一步酶消化形成的黏液團(tuán)狀生精小管分解成單個(gè)支持細(xì)胞的速率，提高了消化效率。（3）培養(yǎng)溫度：人類睪丸內(nèi)精子發(fā)生的最適溫度要低于體溫的2 ℃～8 ℃［16］，如果睪丸溫度長期過高，可能引起睪丸內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致少、弱精子癥等男性不育癥［17-18］。培養(yǎng)溫度過高會損傷支持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，我們將分離的SC 培養(yǎng)在35 ℃培養(yǎng)箱中，利用支持細(xì)胞貼壁迅速特性，定時(shí)低滲處理后換液可有效去除生精細(xì)胞。（4）特征鑒定：波形纖維蛋白（Vimentin，一種III 型中間纖維），是支持細(xì)胞骨架的主要蛋白成分，影響精子發(fā)生［19］。在對支持細(xì)胞的鑒定中，通過檢測Vimentin 表達(dá)、HE 染色、油紅 O 染色共同對支持細(xì)胞進(jìn)行鑒定及純度測定［20-21］，分離出的支持細(xì)胞純度較高。表明我們成功分離培養(yǎng)出高純度的大鼠睪丸SC，為后續(xù)的體外實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

HIF-1α 是目前發(fā)現(xiàn)在缺氧狀態(tài)下可發(fā)揮活性的核轉(zhuǎn)錄因子，是HIF-1 的活性亞基。缺氧時(shí)，HIF-1α 蛋白降解受阻，表達(dá)位置從胞漿轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與HIF-1β 結(jié)合成為有活性的HIF-1，激活下游基因［22］。據(jù)報(bào)道，睪丸缺氧是VC 導(dǎo)致男性不育的可能機(jī)制，HIF-1α 在VC 大鼠模型睪丸內(nèi)高表達(dá)，激活下游細(xì)胞凋亡相關(guān)信號通路如Caspase-3/Bcl-2/Bax 的表達(dá)，促進(jìn)了睪丸細(xì)胞的凋亡［23］。SC 在青春期停止增殖，最終數(shù)量決定了生精細(xì)胞的生精能力和成熟期睪丸大小，維持睪丸正常生精［7］。文獻(xiàn)表明各種因素誘導(dǎo)下的大鼠睪丸內(nèi)極度缺氧，造成與精子發(fā)生密切的支持細(xì)胞數(shù)量減少、功能和結(jié)構(gòu)的損壞，導(dǎo)致生精障礙［24］。PCNA 是細(xì)胞增殖的陽性標(biāo)記物，在哺乳動物DNA 復(fù)制與修復(fù)，細(xì)胞增殖分化周期進(jìn)程中起重要作用［25］。大量研究表明，細(xì)胞增殖與氧氣濃度密切相關(guān)，重度缺氧會造成細(xì)胞內(nèi)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)紊亂，抑制細(xì)胞增殖［26］，HIF-1α 可以通過擾亂細(xì)胞周期過程抑制細(xì)胞增殖［27］。本研究發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)的SC 內(nèi)出現(xiàn)大量的空泡，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，HIF-1α 在嚴(yán)重缺氧環(huán)境中大量移位至SC 胞核中，PCNA 蛋白在低氧支持細(xì)胞中表達(dá)顯著降低。表明嚴(yán)重低氧可能通過激活HIF-1α 轉(zhuǎn)錄活性啟動或促進(jìn)細(xì)胞凋亡、自噬信號以及直接擾亂細(xì)胞周期，進(jìn)而影響大鼠睪丸內(nèi)SC 的增殖能力。

4 結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)觀察到原代SC 培養(yǎng)至3-4 d 時(shí)，形態(tài)較為典型，適合各種形態(tài)學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)；培養(yǎng)至3-7 d 階段，增殖能力強(qiáng)，生長速度快，純度較高；而傳代后的SC 生長狀態(tài)欠佳。免疫熒光法鑒定支持細(xì)胞內(nèi)Vimentin 蛋白表達(dá)、HE染色觀察到支持細(xì)胞形態(tài)，油紅O 染色呈現(xiàn)了支持細(xì)胞內(nèi)脂滴，共同快速準(zhǔn)確地鑒定出支持細(xì)胞及其純度，是有效鑒定睪丸支持細(xì)胞的手段。在實(shí)驗(yàn)中利用第一代處于生長對數(shù)期的支持細(xì)胞，成功建立了體外低氧支持細(xì)胞模型，并且觀察到低氧對SC 增殖的抑制，因此低氧誘導(dǎo)原代SC 作為研究低氧致男性不育機(jī)制的體外細(xì)胞模型可能較為合適。