番茄枯萎病拮抗菌KCKB1的分離、鑒定及生防效果

武亞芬 向丹 梁斌 李琳 黃玉丹 朱曉雪 徐良

摘要：為篩選獲得針對番茄枯萎病的生防菌，從山東壽光設(shè)施大棚內(nèi)番茄根際篩選獲得1株細(xì)菌菌株KCKB1，通過菌落形態(tài)特征觀察以及16S rRNA基因序列分析，菌株KCKB1確認(rèn)為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），并對其開展對峙培養(yǎng)、種屬鑒定、生長特性研究、抑菌譜檢測以及盆栽防效驗(yàn)證。結(jié)果表明，菌株KCKB1能有效抑制番茄枯萎病，盆栽防治效果達(dá)到61.46%；菌株KCKB1可以提高番茄植株葉片內(nèi)抗氧化酶（SOD、CAT）以及抑菌物質(zhì)合成酶（PAL、PPO）的活性，進(jìn)而提高植株抗病性。同時(shí)，菌株KCKB1還具有溶磷、固氮、產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)ACC脫氨酶、產(chǎn)IAA等促生功能，能明顯促進(jìn)番茄植株的生長。此外，菌株KCKB1對鏈格孢菌、甘薯長喙殼菌、灰葡萄孢、煙草疫霉菌、尖孢鐮刀菌甘薯?；?種病原菌均具有良好的的抑菌效果。綜上，枯草芽孢桿菌菌株KCKB1具有良好的生防潛力與廣闊的應(yīng)用前景，為對番茄枯萎病進(jìn)行生物防治提供了菌種資源。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；番茄枯萎??；生物防治；促生長特性

中圖分類號：S436.412.1??文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A??文章編號：1002-1302（2023）09-0131-09

基金項(xiàng)目：山東省重大科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（編號：2021CXGC010801）；青島市科技惠民示范引導(dǎo)專項(xiàng)（編號：21-1-4-ny-13-nsh）。

作者簡介：武亞芬（1998—），女，山東泰安人，碩士研究生，從事根際功能微生物對番茄枯萎病抗病研究。E-mail：3494511371@qq.com。

通信作者：徐?良，博士，副教授，從事植物修復(fù)與資源化研究。E-mail： xuliang@qau.edu.cn。

山東省壽光市是全國著名的菜都，番茄的種植面積占蔬菜總種植面積的1/4左右［1］。但由于近年來番茄的栽培面積不斷擴(kuò)大且連續(xù)栽培年限不斷加長，使壽光設(shè)施栽培條件下種植的番茄受到很多土傳植物病害的危害，其中對番茄影響很大的病害之一為番茄枯萎病。番茄枯萎病是一種維管束疾病，導(dǎo)致這種病害產(chǎn)生的病原菌是尖孢鐮刀菌番茄?；停‵usarium oxysporum f. sp. lycopersici，F(xiàn)ol），番茄的整個(gè)生育期都有可能被該病原菌侵染［2］，嚴(yán)重時(shí)可造成番茄減產(chǎn)65%以上甚至絕收［3］。目前，對番茄枯萎病的防治措施有噴施化學(xué)藥劑［4］，還有以選育抗病品種和改善栽培模式為主的農(nóng)業(yè)防治［5］，以改良土壤理化性質(zhì)、改善土壤pH值等為主的物理防治［6］。目前噴施化學(xué)藥劑仍然是防治番茄枯萎病的主要手段［7］。但長期大量施用化學(xué)農(nóng)藥會帶來植株表面殘留藥劑、使病原菌產(chǎn)生耐藥性、污染耕作土壤等危害人體及生態(tài)環(huán)境的問題［8］。因此，迫切需要開發(fā)綠色無污染、高效可持續(xù)、環(huán)境友好型的防治產(chǎn)品［9］。

利用生防菌防治植物病害能減小化學(xué)藥劑對環(huán)境的干擾，更為綠色安全，目前已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)［10］。生防菌通過分泌抑菌物質(zhì)、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性與病原菌競爭生存資源等途徑來實(shí)現(xiàn)對病原菌的抑制［11］。已報(bào)道的番茄枯萎病生防菌主要有Bacillus sp.、Trichoderma sp.等［12］。張亮等利用熒光假單胞菌PEF-5#18防治番茄枯萎病，發(fā)現(xiàn)菌株能明顯降低番茄枯萎病發(fā)病率，增加植株生物量［13］；張蕭蕭等獲得一株ARTP突變枯草芽孢桿菌YJY19-01，發(fā)現(xiàn)該菌株對番茄枯萎病菌抑制作用明顯［14］；郝曉娟等使用銅綠假單胞菌對番茄枯萎病進(jìn)行防治試驗(yàn)，結(jié)果表明，F(xiàn)JAT-36菌株能明顯抑制番茄枯萎病病原菌的生長，并對番茄植株有促生作用［15］；錢曉雍等發(fā)現(xiàn)，3株對番茄枯萎病有優(yōu)良防治效果的非致病鐮刀菌菌株，以施用濃度為 105 CFU/g IF23菌株的防治效果最好［16］。盡管現(xiàn)在已經(jīng)有多種對番茄枯萎病有防治效果的生防菌被開發(fā)出來，但是由于生防菌株根際定殖能力不穩(wěn)定、具有生物防治能力的菌株與被引入地區(qū)土壤中的土著微生物的生存會相互影響，導(dǎo)致生防菌株對病害的田間防治效果不穩(wěn)定、有地域適應(yīng)性及差異性等問題［17］。這就迫切需要開發(fā)生防菌被引入地特有的、與當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境相匹配的拮抗菌，用于本土番茄枯萎病的防治。

為進(jìn)一步開發(fā)適合于山東省本土番茄枯萎病的生防菌資源，本研究從山東省設(shè)施大棚內(nèi)，利用梯度稀釋平板涂布法以及平板對峙法篩選番茄枯萎病土著生防細(xì)菌，并通過細(xì)菌的生長狀態(tài)和特點(diǎn)以及16SrRNA基因序列分析確定其分類地位，對菌株生長特性以及促生功能進(jìn)行檢測，并利用室內(nèi)盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證菌株的防效。旨在為山東省壽光市的本土番茄枯萎病的生物防治提供理論支持，同時(shí)開發(fā)穩(wěn)定的番茄枯萎病生防菌株。

1?材料與方法

1.1?供試材料

1.1.1?供試菌株?番茄枯萎病：病原為尖孢鐮刀菌番茄?；停‵usarium oxysporum f. sp. lycopersici），由筆者所在課題組從山東省壽光市設(shè)施大棚內(nèi)分離保存；番茄灰霉病：病原為灰葡萄孢（B. cinerea），由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院提供；甘薯黑斑?。翰≡瓰楦适黹L喙殼菌（Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘薯研究所提供；甘薯蔓割?。翰≡瓰榧怄哏牭毒适韺；停‵. oxysporum f. sp. batatas），由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供；煙草赤星?。翰≡瓰殒湼矜呔ˋlternaria alternata），煙草黑脛?。翰≡瓰闊煵菀呙咕≒hytophthora parasitica var. nicotianae），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所生物技術(shù)研究中心提供。

1.1.2?供試培養(yǎng)基?LB培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、燕麥培養(yǎng)基用于抑菌譜的測定［18］，Ashby無氮培養(yǎng)基［19］，PKO無機(jī)磷培養(yǎng)基［20］，蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基［21］，CAS培養(yǎng)基［22］，DF鹽培養(yǎng)基［23］，鉀細(xì)菌篩選培養(yǎng)基用于菌株功能檢測［24］。

1.1.3?供試番茄品種?草莓番茄購于山東壽禾種業(yè)有限公司。

1.2?拮抗菌株的分離、純化及保存

采集山東省壽光市設(shè)施大棚番茄根際土壤樣品，每份樣品稱取10 g，加入90 mL無菌水中，恒溫振蕩培養(yǎng)15 min（30 ℃，180 r/min）。利用倍比稀釋法稀釋土壤樣品，稀釋至濃度為10-6，將10-4、10-5、10-6等3個(gè)濃度的土壤稀釋樣品涂布于LB培養(yǎng)基上，稀釋液涂布用量為100 μL，每個(gè)濃度涂布3個(gè)平板，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，平板倒置，培養(yǎng)溫度為30 ℃。將不同類型的單菌落接種至LB培養(yǎng)基平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)，純化3次后，用30%甘油將菌株保存在菌種保藏管中，并放入-80 ℃冰箱，以備下一步篩選。

1.3?拮抗細(xì)菌的篩選

1.3.1?供試菌株的培養(yǎng)?用PDA培養(yǎng)基以及燕麥培養(yǎng)基活化培養(yǎng)上述6種不同的病原菌，分離出的不同細(xì)菌菌株用LB液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，使不同供試細(xì)菌最終濃度統(tǒng)一為1×107 CFU/mL，進(jìn)行番茄枯萎病生防菌株的篩選。

1.3.2?拮抗菌的篩選?采用平板對峙培養(yǎng)法［25］。在PDA固體培養(yǎng)基平板中央接種長勢均勻的直徑為0.5 cm的菌餅，在距病原菌菌餅2.5 cm的對稱4點(diǎn)處，分別接種不同的供試細(xì)菌菌株，以只接種病原菌的平板作為對照，培養(yǎng)7 d，挑取具有抑菌效果的菌株進(jìn)行復(fù)篩。將致病菌菌餅接種于PDA培養(yǎng)基平板的正中間，在距病原菌菌餅2.5 cm的對稱4點(diǎn)處，接種初篩獲得的拮抗菌菌株，每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù)，以PDA培養(yǎng)基上只接種病原菌作為對照，在溫度為28 ℃的恒溫條件下，倒置培養(yǎng)7 d，用十字交叉法測量對照組致病菌的直徑（D）、處理組致病菌菌落直徑（d）以及抑菌帶寬度，計(jì)算抑菌率。

抑菌率=（D-d）/D×100%；

抑菌帶寬度：細(xì)菌菌落邊緣和病原菌菌絲邊緣之間的距離。

1.4?拮抗菌株KCKB1的鑒定

1.4.1?菌株形態(tài)?采用3區(qū)劃線法，將菌株KCKB1接種至LB培養(yǎng)基中，置于30 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察其菌落顏色和生長狀態(tài)及特點(diǎn)；之后對菌株KCKB1進(jìn)行革蘭氏染色，方法參考《常見細(xì)菌鑒定手冊》［26］、《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》［27］。

1.4.2?菌株KCKB1多基因系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建?KCKB1菌株16S rRNA基因片段的擴(kuò)增使用細(xì)菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系參考細(xì)菌菌種鑒定PCR試劑盒（B532063-0050）說明書。引物合成和基因測序均由上海派森諾生物科技有限公司完成。利用菌株KCKB1的16S rRNA序列及在NCBI網(wǎng)站下載的相關(guān)參考菌株的基因序列，用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5?菌株KCKB1抑菌作用測定

采用對峙培養(yǎng)法對KCKB1菌株的抑菌作用進(jìn)行檢測，選用甘薯黑斑病、甘薯蔓割病、煙草赤星病、煙草黑脛病、番茄灰霉病進(jìn)行抑菌作用測定，具體操作步驟同“1.3.2”節(jié)。

1.6?菌株KCKB1生長速率測定

將在LB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)好的KCKB1菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣1次，測定600 nm波長下菌液的吸光度（D600 nm），以取樣時(shí)間為橫軸，吸光度（D600 nm）為縱軸，繪制生長曲線。

1.7?菌株生物學(xué)特性測定

溫度對KCKB1菌株生長的影響：在LB液體培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)好的KCKB1菌株，分別在22、25、28、31、34、37、40、43 ℃，180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h時(shí)，測定D600 nm，以培養(yǎng)溫度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制曲線圖。

pH值對KCKB1菌株生長的影響：在LB液體培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)好的KCKB1菌株，分別在pH值為4、5、6、7、8、9、10、11、12，30 ℃，180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h時(shí)，測定菌液D600 nm，以pH值為橫坐標(biāo)，D600 nm為縱坐標(biāo)，繪制曲線圖。

NaCl濃度對KCKB1菌株生長的影響：在LB液體培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)好的KCKB1菌株，LB液體培養(yǎng)基的NaCl濃度分別為0、5、10、25、50、100 g/L，30 ℃，180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h時(shí)，測定D600 nm，以NaCl濃度為橫坐標(biāo)，D600 nm為縱坐標(biāo)繪制曲線圖。

1.8?菌株KCKB1的促生長活性檢測。

1.8.1?菌株溶磷能力檢測［15-16］? 在無機(jī)磷培養(yǎng)基、蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基中分別接種KCKB1菌株，30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落周圍有無透明圈產(chǎn)生，若有，對其直徑（D）和菌落直徑（d）進(jìn)行測量，通過二者比值（D/d）大小判斷KCKB1菌株的溶磷能力。

1.8.2?菌株解鉀能力檢測［19］?將菌株KCKB1接種至鉀細(xì)菌篩選培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)5～7 d，若有，對其直徑（D）和菌落直徑（d）進(jìn)行測量，通過二者比值（D/d）測量透明圈直徑和菌落直徑的比值（D/d），比值代表菌株KCKB1的解鉀能力。

1.8.3?菌株固氮能力的檢測［14］?將菌株KCKB1接種于Ashby無氮培養(yǎng)基上，以接種在LB培養(yǎng)基上為對照，若KCKB1菌株能在Ashby無氮培養(yǎng)基上正常生長，則菌株具有固氮能力。

1.8.4?菌株分泌鐵載體能力的檢測?參考榮良燕等的方法［28］，采用CAS平板檢測法，對KCKB1菌株是否具有分泌鐵載體的能力進(jìn)行檢驗(yàn)。KCKB1菌株劃線接種在LB 培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng) 24 h 后，在CAS固體檢測平板上接種KCKB1菌株，接種所用的工具為無菌牙簽。放于30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5～7 d。設(shè)置3個(gè)重復(fù)，觀察菌落周圍是否會產(chǎn)生黃色或橙色暈圈，即噬鐵圈，并測定暈圈的直徑（D）與菌落的直徑（d）即為噬鐵指數(shù)，表示噬鐵能力的大小。

1.8.5?菌株分泌IAA能力的檢測?產(chǎn)生長激素（IAA）能力檢測參考Glick等的方法［29］。將活化后的菌株接種到含 5 mmol/L 色氨酸的LB液體培養(yǎng)基中，在30 ℃，180 r/min 條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h，取2 mL培養(yǎng)液，以10 000 r/min的速度離心15 min，每1 mL上清液加2 mL Salkowski試劑（10.8 mol/L H2SO4含 4.5 g FeCl3），室溫暗處顯色30 min后，于530 nm處測吸光度。以空白培養(yǎng)基作對照，并以純IAA對應(yīng)的吸光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IAA產(chǎn)量（μg/mL）。

1.8.6?菌株ACC脫氨酶活性檢測?參考Glick的方法，在5 mL無氮液體培養(yǎng)基中接種KCKB1菌株，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)1 d［29］；吸取上述培養(yǎng)液0.1 mL并在5 mL DF培養(yǎng)基中接種，之后振蕩培養(yǎng)1 d；將上述培養(yǎng)液0.1 mL接種至5 mL ADF培養(yǎng)基中振蕩2 d；重復(fù)轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)能夠在ADF培養(yǎng)基中正常生長的菌株，能夠僅靠氨基環(huán)丙烷羧酸提供的氮源生長的菌株為ACC（1-氨基環(huán)丙基-1-羧酸）脫氨酶陽性菌株。

1.9?菌株KCKB1對番茄枯萎病盆栽防效測定

1.9.1?試驗(yàn)概況?試驗(yàn)于2019年在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)人工氣候室進(jìn)行。采用灌根法接種拮抗菌以及病原菌進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。利用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基培養(yǎng)番茄枯萎病病原菌，于28 ℃、以180 r/min的速度恒溫振蕩培養(yǎng)2 d后，過濾、棄濾渣收集濾液備用（1×106個(gè)/mL）；將KCKB1菌株接種于液體LB培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)24 h后收集菌液（1×107 CFU/mL）備用。挑選長勢一致的2葉1心健康番茄幼苗，移栽至花盆中（直徑10.0 cm，高 8.3 cm），每盆1株。共設(shè)置4個(gè)處理：CK（清水對照）；KW（只接種番茄枯萎病病原菌）；KCKB1（只接種拮抗菌株KCKB1）；KW+KCKB1（拮抗菌菌株KCKB1和病原菌同時(shí)存在）每個(gè)處理30盆。移栽后定植3 d，用灌根法接種菌株KCKB1菌液50 mL，接種3 d后同樣以灌根法接種病原菌孢子懸液 30 mL。接種病原菌30 d觀察番茄植株感染番茄枯萎病的情況。

1.9.2?盆栽防效評價(jià)指標(biāo)?統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)、發(fā)病率、菌株KCKB1的生物防治效果以及番茄植株葉片內(nèi)抗氧化酶［超氧化物歧化酶（SOD）［30］、過氧化氫酶（CAT）［31］、過氧化物酶（POD）［32］］和抑菌物質(zhì)合成酶［多酚氧化酶（PPO）［33］、苯丙氨酸解氨酶（PAL）［34］］5種防御酶活性。

番茄枯萎病病情分級標(biāo)準(zhǔn)參考周東興等統(tǒng)計(jì)番茄枯萎病病情指數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)［35］：

病情指數(shù)=∑（不同級別病情的植株數(shù)×病情代表級數(shù)）/（病情調(diào)查植株的總數(shù)×最高代表級數(shù)）；

發(fā)病率=發(fā)病植株數(shù)/調(diào)查總植株數(shù)×100%；

防治效果=（對照病情指數(shù)-調(diào)查處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%。

1.10?數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析，用LSD法進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn)，用MEGA 7.0采用鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2?結(jié)果與分析

2.1?拮抗菌的分離與篩選

從壽光設(shè)施大棚土壤中共分離純化獲得31株細(xì)菌，經(jīng)過初篩獲得8株具有抑菌效果的菌株。復(fù)篩結(jié)果表明：KCKB1菌株的抑菌效果最好（表1、圖1），抑菌率為75.10%，高于其他菌株，因此選用此菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2?番茄枯萎病拮抗菌株KCKB1的鑒定

2.2.1?菌株KCKB1形態(tài)學(xué)特征?在LB固體培養(yǎng)基上接種KCKB1菌株，培養(yǎng)1 d之后觀察菌株KCKB1菌落的生長狀態(tài)及特點(diǎn)。菌落的顏色為不透明的污白色，形狀不規(guī)則，菌落表面不光滑、不平整，桿狀菌體，菌株KCKB1為革蘭氏陽性菌（圖2）。

2.2.2?分子生物學(xué)鑒定?以KCKB1菌株的基因組DNA為模板，使用16S rRNA 通用基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序，得到1 469 bp的序列，在GenBank數(shù)據(jù)庫中提交并比對所得基因序列，結(jié)果顯示，該菌為芽孢桿菌屬細(xì)菌，其與B. subtilis KC142124有99%的同源性基因序列，系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）顯示，與菌株KCKB1同一分支的為枯草芽孢桿菌屬。因此依據(jù)16S rRNA基因序列的分析結(jié)果，結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征，將其判定為枯草芽孢桿菌（B. subtilis）。

2.3?菌株KCKB1對病原菌的抑菌作用測定

菌株KCKB1不僅對番茄枯萎病病原菌有很好的抑菌效果，還對另外 5種病原菌都具有良好的抑菌效果，抑菌率均高于60%，其中對煙草赤星病的抑菌效果最好，抑菌率達(dá)到74.89%（表2、圖4）。

2.4?菌株生長特性研究

利用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株KCKB1，在生長的0～6 h處于平緩期，9～30 h處于對數(shù)生長期，30 h 以后開始生長緩慢，直到40 h都處于穩(wěn)定期，40 h以后開始進(jìn)入衰亡期。37 ℃為KCKB1菌株最適宜生長的溫度，最適和KCKB1菌株生長的pH值為pH值=7、氯化鈉濃度為10 g/L（圖5）。

2.5?番茄枯萎病拮抗菌KCKB1的促生長特性

對菌株KCKB1溶解有機(jī)磷及無機(jī)磷、解鉀、固氮、分泌鐵載體、IAA、ACC脫氨酶能力進(jìn)行檢測，評價(jià)它的促生長特性，結(jié)果（表3、圖6）表明，菌株KCKB1具有溶解無機(jī)磷、固氮、分泌鐵載體、生長素（IAA）以及ACC脫氨酶的能力，其中溶解無機(jī)磷的能力較強(qiáng)（溶磷指數(shù)達(dá)到2.88），但是其產(chǎn)IAA的能力較弱（1.57 μg/mL）。

2.6?菌株KCKB1對番茄枯萎病的盆栽防效以及對番茄生長的影響

2.6.1?菌株KCKB1對番茄枯萎病的盆栽防治效果?在溫室盆栽條件下，檢測菌株KCKB1對番茄枯萎病防效，結(jié)果（表4）表明，接種菌株KCKB1后能夠顯著降低番茄枯萎病的病情指數(shù)以及發(fā)病率，菌株KCKB1對于番茄枯萎病具有一定的防治效果，防效為61.46%。此外，番茄植株受到番茄枯萎病脅迫下，番茄植株體內(nèi)的SOD、CAT、POD、PPO以及PAL活性分別是清水對照的3.54、1.05、3.21、1.68、1.19倍，接種菌株KCKB1后，番茄體內(nèi)SOD、CAT、POD、PPO、PAL活性較枯萎病處理分別提高18.91%、45.26%、18.11%、14.81%、4.42%（表5）。結(jié)果表明，番茄枯萎病可以誘導(dǎo)番茄植株體內(nèi)的抗逆酶活性提高，加入菌株KCKB1可以進(jìn)一步誘導(dǎo)番茄植株體內(nèi)抗逆酶活性提高，增強(qiáng)植株的抗病性。

2.6.2?菌株KCKB1對番茄植株生長狀況的影響?為評價(jià)菌株KCKB1對番茄生長的影響，分別測定番茄植株的株高、莖粗、地上部生物量、地下部生物量。試驗(yàn)結(jié)果表明，在正常生長條件下，菌株KCKB1處理后番茄植株的莖粗、地下鮮質(zhì)量、地上干質(zhì)量、地下干質(zhì)量分別增加36.05%、138.20%、9.21%、29.41%；在有番茄枯萎病脅迫下，KCKB1菌株處理后，番茄植株的莖粗和地下鮮質(zhì)量、地下干質(zhì)量分別增加29.42%、79.78%、36.96%。以上結(jié)果表明，菌株KCKB1對番茄植株有明顯的促生作用，主要表現(xiàn)在促進(jìn)番茄植株根系生長方面（表6）。

3?結(jié)論與討論

生防菌的使用存在防效地域差異性的問題［36］。此外，外源生防菌株是否能適應(yīng)被引入地的環(huán)境，成功定殖、增殖是生防菌株發(fā)揮生防效果的關(guān)鍵，這也是制約生防菌大范圍推廣使用的重要因素［37］。因此，篩選適合當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境的土著生防菌株就變得尤為重要。本研究從山東省壽光市設(shè)施大棚番茄根際，篩選獲得番茄枯萎病生防菌株KCKB1，經(jīng)菌株KCKB1的生長狀態(tài)和特點(diǎn)觀察以及16S rRNA基因序列分析，KCKB1菌株被鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。該菌株可以顯著降低番茄植株枯萎病病情指數(shù)以及發(fā)病率，盆栽防效為61.46%，這是對利用山東壽光土著生防菌防治設(shè)施番茄枯萎病的首次報(bào)道。已有研究表明，山東壽光設(shè)施番茄土壤，隨著使用年限的增加，已出現(xiàn)明顯的酸化與鹽漬化現(xiàn)象［38］，而本研究篩選獲得的菌株KCKB1具有較強(qiáng)的耐酸堿和耐鹽能力（適宜生長的pH值范圍為4～10，可以在鹽濃度為10 g/L的環(huán)境中生長），能夠適應(yīng)山東壽光設(shè)施番茄生長的條件。

番茄枯萎病病菌生長和侵染番茄的溫度為5～35 ℃，在25～28 ℃時(shí)發(fā)病最為嚴(yán)重［39-40］。本研究篩選獲得的菌株KCKB1適宜生長的溫度范圍為 22～40 ℃，這與番茄枯萎病的發(fā)病溫度一致，適用于番茄枯萎病的防治。此外菌株KCKB1除了對番茄枯萎病有較好的拮抗作用外，還對番茄灰霉病、甘薯黑斑病、甘薯蔓割病、煙草黑脛病、煙草赤星病均具有較好的抑菌效果。其中，對煙草赤星病的抑菌率最高，達(dá)到74.89%；對甘薯黑斑病和甘薯蔓割病的抑菌率分別達(dá)到67.93%和67.17%，本研究也是首次發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對這2種病原菌有較好的抑菌效果。這為后續(xù)利用生物手段防治這些病原菌引起的病害提供了較好的菌種資源。

誘導(dǎo)植株產(chǎn)生系統(tǒng)抗性（ISR）是生防菌防治植物病害的機(jī)制之一，其中誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性產(chǎn)生的重要機(jī)制包括與抗病反應(yīng)相關(guān)的防御酶活性提高［41］。植物體內(nèi)與抵抗病原菌侵染有關(guān)的重要的防御酶有SOD、CAT、PAL、PPO、POD［42］。本研究中，番茄植株受到枯萎病侵染后，植株體內(nèi)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶的活性均較清水對照處理有所提高；使用菌株KCKB1處理后，番茄植株體內(nèi)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶、過氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶活性進(jìn)一步提高，分別較單接病原菌處理的植株提高了18.91%、45.26%、18.11%、14.81%、4.42%，以上結(jié)果表明菌株KCKB1可以誘導(dǎo)番茄植株防御酶活性增高，增強(qiáng)植株的抗病能力。因此，誘導(dǎo)系統(tǒng)產(chǎn)生抗病性可能是菌株KCKB1抑制番茄枯萎病的重要機(jī)制。此外，一些土壤微生物具有溶解土壤中難以被植株直接利用的磷、鉀、產(chǎn)生鐵載體以及固氮的能力［43］；可以產(chǎn)生ACC脫氨酶［44］抑制乙烯的合成和排放，有利于減緩植株衰老；還可以產(chǎn)生IAA，促進(jìn)植株生長，這些促生特性也是拮抗菌的生防機(jī)制之一［45］。在本研究中，無論是否接種番茄枯萎病，菌株KCKB1均表現(xiàn)出了明顯的促生作用，這可能與菌株KCKB1具有較高的溶磷（溶解無機(jī)磷指數(shù)可達(dá)2.88）、固氮、分泌鐵載體、生長素以及ACC脫氨酶的能力緊密相關(guān)。

綜上所述，枯草芽孢桿菌KCKB1可以誘導(dǎo)番茄植株防御酶活性提高，能明顯改善番茄枯萎病的發(fā)病情況，降低病情指數(shù)和發(fā)病率，對番茄枯萎病有較好的抑制效果，還具有較廣的抑菌譜，同時(shí)還具有溶解有機(jī)磷及無機(jī)磷、固氮、分泌嗜鐵素、ACC脫氨酶以及生長素等促生特性，對番茄植株生長有明顯的促進(jìn)作用，表現(xiàn)出了良好的生防潛力，應(yīng)用前景非常廣闊。

從番茄根際篩選獲得1株番茄枯萎病拮抗菌KCKB1，經(jīng)鑒定，菌株為Bacillus subtilis，菌株最適宜生長條件為溫度37 ℃，pH值7，鹽分濃度10 g/L。菌株KCKB1能有效抑制番茄枯萎病，顯著降低番茄枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)，盆栽防治效果為61.46%；菌株KCKB1可以提高番茄植株葉片內(nèi)SOD、CAT、PAL以及PPO的活性，進(jìn)而提高植株抗病性。同時(shí)，菌株KCKB1還具有溶解有機(jī)磷和無機(jī)磷、固氮、分泌鐵載體、ACC脫氨酶、生長素等促生功能，能明顯促進(jìn)番茄植株的生長。此外，菌株KCKB1具有廣譜抑菌作用，除了尖孢鐮刀菌番茄?；停闗CKB1還對灰葡萄孢、甘薯長喙殼菌、尖孢鐮刀菌甘薯?；?、鏈格孢菌和煙草疫霉菌5種病原菌具有良好的的抑菌效果，其中對煙草赤星病的抑菌率最高，達(dá)到74.89%。

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