AM真菌聯(lián)合檸檬酸對紫云英生長的協(xié)同效應(yīng)

張抒情 王月 張亞 王立龍 柯麗霞 楊安娜

摘要：為了解AM真菌聯(lián)合檸檬酸對紫云英生長發(fā)育及生理特性的影響，通過接種Funneliformis mosseae和聯(lián)合施加檸檬酸進行紫云英溫室盆栽試驗，測定紫云英幼苗植株形態(tài)、根系發(fā)育、養(yǎng)分吸收、抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)等指標(biāo)。結(jié)果表明，AMF聯(lián)合檸檬酸的組別相較于CK組株高、分枝數(shù)和生物量均顯著增加（P<0.05）。在不同檸檬酸濃度下，接菌后的紫云英比CK組的根冠比和根系活力均顯著提升，4 mmol/L濃度組的根冠比提升了51.9%、2 mmol/L 濃度組的根系活力提升了1.34倍；單獨施加檸檬酸可顯著增加紫云英磷含量和葉綠素含量，接菌之后進一步提升二者的含量，在接菌且檸檬酸濃度為4 mmol/L條件下，磷含量和葉綠素含量較CK組分別增加92.2%、48.2%；AMF聯(lián)合檸檬酸可顯著促進紫云英抗氧化酶活性：在檸檬酸濃度為2 mmol/L條件下的超氧化物歧化酶活性最佳，達378.38 U/g；在檸檬酸濃度為4 mmol/L條件下的過氧化物酶和過氧化氫酶活性最佳，分別達到1 617.50、1 834.89 U/（g·min）；在相同檸檬酸濃度下，聯(lián)合處理組與單施檸檬酸組相比，進一步顯著增加紫云英可溶性糖和可溶性蛋白含量且顯著降低丙二醛含量。綜上，AM真菌聯(lián)合檸檬酸可以通過促進根系發(fā)育和養(yǎng)分吸收，進而提高紫云英幼苗生理代謝水平，對紫云英幼苗生長具有一定協(xié)同作用。

關(guān)鍵詞：AM真菌；檸檬酸；紫云英；生長發(fā)育

中圖分類號：S182；S541+.304??文獻標(biāo)志碼：A??文章編號：1002-1302（2023）09-0254-07

基金項目：安徽省自然科學(xué)基金（編號：1908085MD104）。

作者簡介：張抒情（1995—），女，河北廊坊人，碩士，主要從事土壤微生物學(xué)研究。E-mail：550890757@qq.com。

通信作者：楊安娜，博士，副教授，主要從事土壤微生物學(xué)研究。E-mail：anyz@163.com。

叢枝菌根真菌（arcusbular mycorrhizal fungui，AMF）是土壤真菌的重要成員。它屬于菌物界球菌門球菌綱，是一類最古老的、專性活體營養(yǎng)共生菌。地球約90%的陸生植物都可與叢枝菌根真菌共生［1-2］。AMF如同在土壤和植物之間形成了一座營養(yǎng)互通的橋梁——碳水化合物與礦質(zhì)養(yǎng)分交換［3］。AMF通過共生在植物根皮層細(xì)胞中獲取植物提供的碳水化合物，作為回報，AMF根外菌絲幫助植物吸收土壤中的礦質(zhì)養(yǎng)分（如氮和磷）輸送到植物根部，從而促進宿主植物的生長［4-5］。在可持續(xù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，利用AMF菌根生物技術(shù)可以改善植物的生長狀況與生態(tài)環(huán)境［6］、提高農(nóng)作物產(chǎn)量［7］等，AMF與植物的互作研究已經(jīng)成為生態(tài)農(nóng)業(yè)研究的熱點且受到廣泛關(guān)注。檸檬酸（citric acid）別稱枸杞酸，學(xué)名3-羧基-3-羧基戊二酸。在農(nóng)業(yè)植物研究方面，檸檬酸作為綠色環(huán)保的低分子量有機酸，在土壤中作為載體增強土壤礦物溶解性和營養(yǎng)元素有效性。使菌根植物能夠吸收非菌根植物無法活化的氮、磷形式從而提高宿主植物的抗逆性和生物量［8-9］。近年來，部分學(xué)者認(rèn)為，檸檬酸能夠通過螯合作用和酸溶解作用促進植物吸收土壤中的有效磷（主要為H2PO-4、HPO2-4和PO3-4）。宋金鳳等認(rèn)為，適宜濃度的檸檬酸能促進暗棕壤中磷的活化，使落葉松和水曲柳幼苗吸收充足的養(yǎng)分，提升植物生長參數(shù)和營養(yǎng)價值［10］。劉路路等認(rèn)為，檸檬酸在土壤中可調(diào)節(jié)有益土壤微生物（如AM真菌和根瘤菌）的群體布局和數(shù)量；可改變重金屬的形態(tài)，提高植物根際土壤環(huán)境；可增加活性有機物質(zhì)，促進玉米作物生長［11］。房福力等認(rèn)為，外源施加檸檬酸可以減少化肥使用量，從而保護生態(tài)環(huán)境，還可以提高農(nóng)作物番茄產(chǎn)量和經(jīng)濟效益［12］。所以探究外源添加檸檬酸對植物礦質(zhì)營養(yǎng)吸收與化肥的作用具有重要意義。紫云英（Astragalus sinics）別稱紅花草、翹搖，是豆科黃芪屬越年生草本植物。紫云英是南方稻區(qū)最主要的覆蓋作物，在長江流域廣泛種植［13］。紫云英在稻田種植后，豐富的土壤微生物類群利于土壤有機質(zhì)的循環(huán)轉(zhuǎn)化，翻壓后還可以促進土壤碳、氮、磷、鉀等元素的釋放。它兼具強大的固氮作用，可以改善土壤理化性狀和肥力，優(yōu)化土壤生態(tài)環(huán)境，使農(nóng)作物的質(zhì)量與經(jīng)濟效益大幅提升［14-15］。紫云英的經(jīng)濟發(fā)展前景廣闊，可以用作蔬菜牧草和蜜源植物，用于研制抗氧化和抗癌保健藥品［16-17］，還可以應(yīng)用于綠肥施田與觀景旅游為一體的系統(tǒng)［18］。因此，傳統(tǒng)覆蓋作物紫云英作為本試驗的宿主具有一定的研究價值，紫云英在根際共生微生物與綠色有機酸的聯(lián)合處理下生理響應(yīng)如何？是否經(jīng)生物-化學(xué)聯(lián)合處理紫云英通過其生理響應(yīng)能夠反映出協(xié)同效應(yīng)？本研究在生物與化學(xué)聯(lián)合應(yīng)用的生態(tài)農(nóng)業(yè)方面具有一定的意義。因此，本研究采用溫室盆栽試驗，設(shè)置AMF和檸檬酸濃度2個環(huán)境處理因素，接種菌種為摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae），探究叢枝菌根真菌聯(lián)合檸檬酸對覆蓋作物紫云英生長及生理指標(biāo)的影響。旨在改善農(nóng)田生態(tài)環(huán)境，為綠色農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗設(shè)計

以紫云英作為宿主植物。土壤基質(zhì)為自然風(fēng)干的土壤、河沙與草炭在121 ℃、0.1 MPa滅菌 2 h，連續(xù)滅菌3次。將滅菌后的土壤、河沙、草炭放入已滅菌的花盆中，按照1 ∶?1 ∶?1比例混合均勻后作為供試基質(zhì)待用。菌劑：供試菌種為摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae），由北京農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所提供。

將紫云英種子浸入 95%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇 5 min，再以 5%（體積分?jǐn)?shù)） NaClO 表面消毒 10 min，無菌水洗滌4～5次，之后將種子栽種至裝有土壤基質(zhì)的花盆中，每盆播撒5～6粒，再用2～3 cm 的土壤基質(zhì)覆蓋。不接種AMF處理組每盆放入土壤基質(zhì)500 g；接種AMF處理組每盆放入土壤基質(zhì)480 g，菌劑土壤20 g。每隔2 d澆水1次，每隔7 d施用 Hoagland 完全培養(yǎng)液。試驗設(shè)0、2、4、6 mmol/L外施檸檬酸水平（以CA0、CA2、CA4、CA6表示），各施CA水平下設(shè)不接種與接種處理組別，（CK、CA2、CA4、CA6和CA0＋AM、CA2＋AM、CA4＋AM、CA6＋AM）共８個處理，每種處理10次重復(fù)。

溫室試驗于2022年6月1日在安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物恒溫氣候室進行。待植株生長20 d后，6月21日開始施加外源檸檬酸溶液：在CA2、CA4、CA6接菌與不接菌組植物根際施加 100 mL 相應(yīng)濃度梯度的檸檬酸溶液，CK和CA0＋AM組施加等量的蒸餾水。期間每隔2 d澆1次檸檬酸溶液，為期10 d的外源處理。待植株生長到 72 d 收獲，將收獲的紫云英幼苗用蒸餾水清洗干凈，先利用液氮速凍處理然后置于-80 ℃冰箱存放，以便用于生長發(fā)育與生理生化指標(biāo)的測定。

1.2?測定項目與方法

1.2.1?根系發(fā)育測定?根冠比：將根及地上部鮮樣置于恒溫箱內(nèi)，105 ℃下殺青30 min，70 ℃下烘干至恒質(zhì)量，稱量根系和地上部干質(zhì)量，計算根冠比。根系活力：采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法測定根系活力［19］。

1.2.2?葉片養(yǎng)分測定?磷含量測定：采用鉬藍法［19］測定植株中磷元素含量。葉綠素含量測定：采用丙酮提取法［19］提取植物葉片中的葉綠體色素。

1.2.3?抗氧化系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)測定?酶活性與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)測定方法參照《植物生理學(xué)實驗》［19］。采用氮藍四唑法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，愈創(chuàng)木酚氧化法測定過氧化物酶（POD）活性，紫外吸收法測定過氧化氫酶（CAT）活性，采用苯酚法測定可溶性糖含量，采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量。

1.2.4?丙二醛含量測定?采用硫代巴比妥酸法［19］測定丙二醛（MDA）的含量。

1.3?數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有指標(biāo)均重復(fù)測定3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。采用Microsoft Excel 2016對數(shù)據(jù)進行匯總、整理與計算，SPSS 20.0軟件進行顯著性分析、單因素方差分析和多重檢驗；采用Graphpad軟件進行相關(guān)圖表制作。

2?結(jié)果與分析

2.1?AMF聯(lián)合不同濃度檸檬酸對幼苗生長及菌根侵染影響

通過雙因素交互分析，發(fā)現(xiàn)AMF與檸檬酸聯(lián)合處理均能夠顯著影響紫云英的株高、分枝數(shù)（P<0.05）。在單施檸檬酸的情況下，各濃度與CK組相比，除單施檸檬酸CA2組地上部鮮質(zhì)量差異不顯著（P>0.05）外，其余組別對植株的生物量均具有顯著促進作用（P<0.05）。在接菌與聯(lián)合處理下，與CK組相比，CA0+AM、CA2+AM、CA4+AM、CA6+AM的地上部鮮質(zhì)量分別提高 21.7%、39.5%、67.8%、27.6%，地上部干質(zhì)量分別提高20.0%、61.0%、76.5%、59.1%。CA4+AM組的地下部鮮質(zhì)量和地下部干質(zhì)量提高效果最佳，與CK組相比分別提高1.09、1.76倍（表1）。

由圖1可知，同時接種AMF和添加外源檸檬酸處理下的紫云英生長狀況整體要優(yōu)于CK處理，單獨接菌組也優(yōu)于CK組。且在同一檸檬酸濃度下，聯(lián)合處理組比單施檸檬酸組促進紫云英生長發(fā)育的效果更優(yōu)。

AM菌根共生體是AMF與宿主植物之間親和力的象征，從接種AMF的紫云英幼苗根系中可以看到，菌絲進入根部皮層細(xì)胞后在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間延伸和生長發(fā)育；在細(xì)胞中形成連續(xù)分枝的叢枝結(jié)構(gòu)，行使真菌與植物間的營養(yǎng)交換功能；在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間形成泡囊結(jié)構(gòu)，泡囊是AMF的營養(yǎng)儲存器官（圖2）。接種摩西斗管囊霉可以較好地侵染紫云英幼苗根系，與植物有良好的營養(yǎng)共生關(guān)系。

2.2?AMF聯(lián)合不同濃度外源檸檬酸對幼苗根系發(fā)育影響

植物根系是植物重要的營養(yǎng)吸收器官，根的發(fā)育和活力水平對地上部的生長發(fā)育和植株產(chǎn)量有重要影響，根系的生長指標(biāo)主要包括根長、根冠比、根系活力等。由圖3可知，與CK組相比，除單獨接菌組與單施檸檬酸的CA2和CA6組根冠比差異不顯著（P>0.05），其余組別根長、根冠比和根系活力均具有顯著促進作用（P<0.05）。在相同檸檬酸濃度下，聯(lián)合處理組的根系發(fā)育指標(biāo)均優(yōu)于單施檸檬酸組。聯(lián)合處理組與CK組相比，CA2+AM、CA4+AM、CA6+AM組根冠比分別增加36.5%、51.9%、25.0%；聯(lián)合處理組中幼苗根系活力也具有顯著促進作用，與CK組相比，CA2+AM組根系活力達到0.411 mg/（g·h）。2 mmol/L和4 mmol/L濃度的檸檬酸聯(lián)合接種AMF處理可以有效促進根系發(fā)育，而較高濃度（6 mmol/L）檸檬酸促進作用減弱，也間接抑制了AMF對幼苗根系發(fā)育的促進作用（圖3）。

2.3?AMF聯(lián)合不同濃度外源檸檬酸對幼苗營養(yǎng)合成的影響

植物磷含量和葉綠素含量是評價植物營養(yǎng)狀況與光合作用強弱的重要指標(biāo)。在單施檸檬酸的情況下，與CK組相比，各濃度組別的磷含量和葉綠素含量均具有顯著促進作用（P<0.05），各濃度組別的磷含量分別增加20.4%、69.1%、57.6%；葉綠素分別增加13.1%、28.1%、15.3%。在相同檸檬酸濃度下，聯(lián)合處理與單施檸檬酸組相比進一步顯著增加了幼苗的磷含量和葉綠素含量，且4 mmol/L濃度的檸檬酸聯(lián)合接種AMF處理組較CK組的促進作用最明顯，其磷含量達30.11 mg/g，葉綠素含量達23.21 mg/g（圖4）。

2.4?AMF聯(lián)合不同濃度外源檸檬酸對幼苗抗氧化系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

SOD、POD和CAT作為抗氧化酶共同保衛(wèi)植物細(xì)胞的完整性，維持活性氧的相對平衡。與CK組相比，除單接菌組的SOD活性與CA6組的POD活性差異不顯著（P>0.05），其他各組別的SOD、POD、CAT活性均具有顯著促進作用（P<0.05）。在相同檸檬酸濃度下，聯(lián)合處理與單施檸檬酸組相比，除6 mmol/L組的SOD活性與CAT活性差異不顯著，2 mmol/L和4 mmol/L組的3種抗氧化酶活性和6 mmol/L組的POD活性均有顯著提升。聯(lián)合處理組與CK組相比，3個濃度組別的SOD活性分別提高45.8%、41.0%、11.1%；聯(lián)合處理下的POD活性和CAT活性與CK組相比也具有顯著促進作用（P<0.05），3個濃度組別的POD活性分別提高86.6%、117.1%、80.5.%；3個濃度組別的CAT酶活性分別提高125.3%、198.7%、42.1%（圖5）。

可溶性糖與可溶性蛋白是植物細(xì)胞中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量多少與植物細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)能力強弱呈正相關(guān)。在單施檸檬酸的情況下，與CK組相比，各濃度組別的可溶性糖與可溶性蛋白含量均具有顯著促進作用（P<0.05）。在相同檸檬酸濃度下，聯(lián)合處理組的可溶性糖和可溶性蛋白含量均顯著高于單施檸檬酸組。聯(lián)合處理組與CK組相比，各濃度組別的可溶性糖含量分別提高98.0%、172.3%、129.3%，其中CA4+AM組含量達 12.03 mg/g；各濃度組別的可溶性蛋白含量分別提高189.2%、190.0%、50.1%，其中CA4+AM組可溶性蛋白含量達64.52 mg/g（圖5）。

膜脂過氧化水平可以由丙二醛（MDA）含量的高低表示，因為MDA是膜脂過氧化產(chǎn)物之一。在單施檸檬酸的情況下，與CK組相比，各濃度組別MDA含量均顯著降低（P<0.05）。在相同檸檬酸濃度下，聯(lián)合處理組的丙二醛含量均顯著低于單施檸檬酸組。接菌后各處理組的MDA含量隨著施加檸檬酸的濃度遞增進一步降低。其中CA4+AM和CA6+AM組差異不大，二者MDA含量分別為0.37、0.34 μmol/g（圖5）。

3?討論

3.1?AMF聯(lián)合不同濃度檸檬酸對紫云英幼苗生長發(fā)育和養(yǎng)分吸收的影響

AM真菌與自然界的大多數(shù)植物均可良好共生［20-23］，大多數(shù)植物生長過程中對外源有機酸相對敏感［24-26］，本試驗結(jié)果進一步證實了前人的研究結(jié)論。本研究在紫云英苗期生長發(fā)育過程中，單施外源檸檬酸可以提高生物量和促進根部發(fā)育，且中等檸檬酸濃度對紫云英的根部發(fā)育促進作用最強，較低或過高濃度檸檬酸起到的促進作用會相對較弱，說明外源檸檬酸會影響植物的生長發(fā)育，并存在適宜濃度的閾值，這與王鴻燕等對馬藺的研究結(jié)果［27］、陳佳等對栝樓的研究結(jié)果［28］一致。AMF與檸檬酸聯(lián)合處理下，更加顯著促進植株根部發(fā)育和養(yǎng)分吸收，可能是AM真菌調(diào)節(jié)土壤水分梯度和根際環(huán)境來改變紫云英的根構(gòu)型和細(xì)胞壁伸長，促進其生長發(fā)育［29］，進而促進檸檬酸的利用，同時適當(dāng)濃度的檸檬酸可以改善植物根部生長發(fā)育與細(xì)胞環(huán)境，還可以促進AMF與根部的共生發(fā)育與營養(yǎng)水平的提升。因此，接種AMF與適宜濃度的檸檬酸有助于塑造良好的根系結(jié)構(gòu)，提高根系活力，促進根系吸收磷元素和礦質(zhì)營養(yǎng)，促進植物進行光合作用，從而增加其葉綠素含量。

3.2?AMF聯(lián)合不同濃度檸檬酸對紫云英幼苗抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

植物生長過程中不可避免地受到各種逆境脅迫，植物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對體內(nèi)清除活性氧自由基及維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用［30］。本研究單施外源檸檬酸可以提高紫云英幼苗抗氧化酶活性并增加可溶性糖和可溶性蛋白的含量。但高濃度檸檬酸促進作用會相對減弱，可能是由于過高濃度檸檬酸會與土壤中的金屬離子產(chǎn)生過度螯合作用對植物逐漸產(chǎn)生不利影響［31］；同一檸檬酸濃度下，單施檸檬酸低于AMF與檸檬酸聯(lián)合處理，二者聯(lián)合使用更加顯著提高植株抗氧化酶系統(tǒng)活性并增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。Klinsukon等認(rèn)為，AMF的定殖可以提高桉樹幼苗的耐鹽能力［32］；李嬌嬌在不同干旱條件下，發(fā)現(xiàn)2種AMF（Funneliformis mosseae和Glomus etunicatum）均可以不同程度地提高梨樹幼苗滲透調(diào)節(jié)及抗氧化能力，調(diào)節(jié)植物內(nèi)源激素平衡［33］；Cesaro 等也發(fā)現(xiàn)AM菌根共生體會促進番茄根系有益分泌物和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的增加［34］。本研究結(jié)果對上述研究成果也進行了驗證，可見接種AMF與適宜的檸檬酸濃度具有一定協(xié)同作用，有助于植物抗氧化系統(tǒng)的完善和營養(yǎng)價值的提升。

4?結(jié)論

綜上，AMF聯(lián)合適宜濃度檸檬酸可在一定程度上促進覆蓋作物紫云英的生長發(fā)育并提高其生理生化指標(biāo)。因此，AMF與該綠色有機酸聯(lián)合可以考慮作為一種新興生態(tài)環(huán)保菌劑施用于紫云英生長時期的農(nóng)田中，待其翻壓后間接影響農(nóng)作物生長和產(chǎn)量，充分呼應(yīng)生態(tài)農(nóng)業(yè)的理念，也響應(yīng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與環(huán)境保護同步發(fā)展的號召。

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