地西他濱對(duì)AML1-ETO 陽性急性髓系白血病細(xì)胞中PD-L2 分子表達(dá)的影響

李夢(mèng)月，邵楊柳，李雨晴，王莉莉，高曉寧

1 解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心血液病醫(yī)學(xué)部，北京 100071；2 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；3 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心血液科，北京 100853

t(8；21)(q22；q22)染色體易位是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)最常見的細(xì)胞遺傳學(xué)異常之一，AML-ETO(A/E)是t(8；21)染色體易位所產(chǎn)生的一種異常融合基因，已被發(fā)現(xiàn)與AML 中特異性DNA 甲基化模式相關(guān)[1]，介導(dǎo)相關(guān)靶基因沉默。程序性細(xì)胞死亡蛋白-1(programmed cell death protein 1，PD-1)是一種主要在活化T 細(xì)胞中表達(dá)的免疫抑制受體。程序性細(xì)胞死亡蛋白-配體2(programmed cell death-ligand 2，PD-L2)作為PD-1 的配體，與之結(jié)合后活化免疫檢查點(diǎn)信號(hào)通路，對(duì)抗T 細(xì)胞受體提供的激活信號(hào)，發(fā)揮免疫抑制作用[2]，導(dǎo)致T 細(xì)胞耗竭和免疫逃逸，促進(jìn)AML 難治/復(fù)發(fā)[3]。

DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑地西他濱(decitabine，DAC)作為一種DNA 去甲基化藥物(hypomethylating agent，HMA)，已被應(yīng)用于治療AML 及骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)[4-5]。目前已有多個(gè)HMA 聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療AML 的臨床研究[6-7]。我們根據(jù)前期生物信息學(xué)分析推測(cè)，PD-L2 基因啟動(dòng)子區(qū)富含CG 位點(diǎn)，故其表達(dá)可能受DNA 甲基化調(diào)控。本研究分析了A/E陽性AML 細(xì)胞系中，PD-L2 啟動(dòng)子甲基化水平及DAC 處理對(duì)其表達(dá)的影響；并比較了沉默或表達(dá)A/E 的細(xì)胞系中，DAC 處理對(duì)PD-L2 mRNA 表達(dá)影響的差異，初步探索A/E 陽性AML 細(xì)胞中DNA 甲基化對(duì)PD-L2 表達(dá)的調(diào)控作用，為未來將HMA 與PD-1 抑制劑聯(lián)合用于復(fù)發(fā)難治t(8；21)AML 的治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 材料、試劑與儀器 RPMI Medium 1640 細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco)，100 × 青霉素-鏈霉素溶液(Biosharp：BL505A)，胎牛血清(Gibco)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO；Solarbio：DB 371)，DAC(5-氮雜-2’-脫氧胞苷；Merck：A3656)，ZnSO4溶液(儲(chǔ)存濃度：100 mmol/L)，快速逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海奕杉生物科技公司：RT001)，TRIzol?Reagent (Ambion：15596026)，通用型 KAPA SYBR?FAST qPCR (Roche)，Wizard? Genomic DNA Purification Kit (Promega：A1120)，GoTaq?Green Master Mix (Promega：M7122)，EpiTect?Bisulfite Kits (Qiagen：59104)，(BM) Gelred 核酸染料(10 000 ×)、6 × DNA Loading Buffer、50 bp Ladder DNA Marker(北京博邁德基因技術(shù)有限公司)。細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermofisher)，GeneQuant pro紫外/可見光分光光度計(jì)(Biochrom)，PCR 擴(kuò)增儀(Applied Biosystems：96 Well Thermal Cycler)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(Stratagene：3000P)，電泳儀(北京六一生物科技有限公司：DYY-6C型)，全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司：Tanon 1600)。

2 細(xì)胞來源與培養(yǎng) A/E 陽性AML 細(xì)胞系Kasumi-1，穩(wěn)定沉默A/E 的細(xì)胞系SKNO-1-siA/E及其空載體對(duì)照SKNO-1-PGK(A/E 陽性)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A/E 表達(dá)載體的U937A/E 及其空載體對(duì)照U937-MT 細(xì)胞系均由解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心血液科實(shí)驗(yàn)室凍存。U937A/E 細(xì)胞系常規(guī)培養(yǎng)下僅有微量A/E 蛋白表達(dá)，經(jīng)100 μmol/L 的ZnSO4處理后可使A/E 過表達(dá)[8]。細(xì)胞復(fù)蘇后懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液(含100 U/mL 青霉素和100 mg/L 鏈霉素，pH 值調(diào)至7.2～ 7.4)中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)孵育，每2～ 3 d換液，分瓶傳代繼續(xù)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3 細(xì)胞加藥處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Kasumi-1 或SKNO-1-PGK 或SKNO-1-siA/E 細(xì)胞3 × 106個(gè)置于培養(yǎng)皿，培養(yǎng)液終體積10 mL，共取4皿。分別向4 皿Kasumi-1 細(xì)胞中加入終濃度為0 μmol/L(對(duì)照組，采用終濃度為0.1% DMSO)、0.25 μmol/L、1.0 μmol/L 和2.5 μmol/L 的DAC，使4 皿細(xì)胞樣品中DAC 藥物濃度依次遞增。將加藥處理后的細(xì)胞混勻后置于培養(yǎng)箱內(nèi)，每孵育24 h 收集細(xì)胞重新?lián)Q液并加藥，至72 h 后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)硫化修飾后測(cè)序(bisulfite sequencing，BSP)和逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR)實(shí)驗(yàn)。U937-MT、U937A/E、U937A/E +ZnSO4細(xì)胞系只設(shè)置對(duì)照組與2.5 μmol/L DAC 處理組，余步驟同前。U937A/E+ZnSO4細(xì)胞系中ZnSO4濃度為100 μmol/L，每孵育24 h 收集細(xì)胞重新?lián)Q液加入ZnSO4及藥物。

4 DNA 提取、BSP 檢測(cè)甲基化水平 收集適量處理后的Kasumi-1、SKNO-1-PGK 細(xì)胞，按Wizard?Genomic DNA Purification Kit 說明書提取總DNA，用紫外分光光度計(jì)以DNA260/280的比值進(jìn)行DNA樣品的純度判定與濃度測(cè)定。DNA 純度和濃度合格者利用EpiTect?Bisulfite Kits 進(jìn)行DNA 的亞硫酸氫鹽處理及純化回收。利用DNA 模板、PD-L2 BSP 引物、GoTaq?Green Master Mix 進(jìn)行BSP 反應(yīng)，反應(yīng)體系為25 μL，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性2 min；然后95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)，最終72℃延伸5 min。采用MethPrimer 軟件(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer2)對(duì)PD-L2 基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及上游2 000 bp 的序列進(jìn)行CpG 位點(diǎn)分析，并設(shè)計(jì)BSP 引物，所用引物如下，PD-L2 BSP 上游引物：5'-AGAGAATGGTAATTTTTAAGGAAAT-3'；PD-L2 BSP 下游引物：5'-AACCTAAATAATCAAT CCTTCTCCTAC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度400 bp，引物由北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以鑒定、分離DNA，交由北京博邁德基因技術(shù)有限公司進(jìn)行TA 克隆與產(chǎn)物測(cè)序(每種細(xì)胞系各篩選20 個(gè)菌落進(jìn)行測(cè)序)，以進(jìn)行DNA 甲基化分析。

5 總RNA 提取及RT-qPCR檢測(cè)mRNA表達(dá)收集處理后的Kasumi-1、SKNO-1-PGK、SKNO-1-siA/E、U937-MT、U937A/E、U937A/E+ZnSO4細(xì)胞，Trizol 一步法提取細(xì)胞總RNA。用紫外分光光度計(jì)以RNA260/280的比值進(jìn)行RNA 樣品的純度判定與濃度測(cè)定。RNA 純度和濃度合格者使用RNA 快速逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA，KAPA SYBR?FAST qPCR 試劑盒完成RT-qPCR 檢測(cè)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系為20 μL，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性20 s；然后95℃變性3 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)，最終72℃延伸15 min。引物由北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成，所用引物如下，GAPDH 上游引物：5'-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3'，GAPDH 下游引物：5'-GGTGGAATCATATTGGAACA-3'。PDL2 上游引物：5'-ATTGCAGCTTCACCAGATAGC-3'，PD-L2 下游引物：5'-AAAGTTGCATTCCAGG GTCAC-3'。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)熔解曲線判斷擴(kuò)增產(chǎn)物，記錄各組Ct值，目的基因相對(duì)表達(dá)量應(yīng)用2-△△Ct公式計(jì)算，△△Ct=(Ct 處理組目的基因 -Ct處理組內(nèi)參基因) -(Ct 對(duì)照組目的基因 -Ct 對(duì)照組內(nèi)參基因)，比較mRNA 的相對(duì)表達(dá)含量。每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

6 生物信息學(xué)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用JASPAR 數(shù)據(jù)庫(http://jaspar.genereg.net)預(yù)測(cè)PD-L2 基因啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。本研究所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組間量的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間差異比較使用多組計(jì)量資料的秩和檢驗(yàn)(K-W檢驗(yàn))，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。影響性分析采用直線回歸分析，以決定系數(shù)r2表示，r2越接近1，引入相關(guān)的效果越好。采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行作圖。

結(jié)果

1 A/E 陽性AML 細(xì)胞系PD-L2 DNA 啟動(dòng)子區(qū)特異性位點(diǎn)的甲基化水平及DAC 處理后的水平變化 生物信息學(xué)分析顯示，在PD-L2 基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp 及5’端非翻譯區(qū)可預(yù)測(cè)到7 個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子AML1 結(jié)合位點(diǎn)，啟動(dòng)子序列分析后顯示PD-L2 啟動(dòng)子區(qū)富含CG 位點(diǎn)(圖1)，故PD-L2 基因表達(dá)可能分別受A/E 和DNA 甲基化調(diào)控。為明確PD-L2 基因啟動(dòng)子區(qū)是否受DNA甲基化調(diào)控，采用BSP 檢測(cè)對(duì)照組(0.1% DMSO)及2.5 μmol/L DAC 處理的Kasumi-1 和SKNO-1-PGK 細(xì)胞系中PD-L2 DNA 啟動(dòng)子區(qū)特異性位點(diǎn)的甲基化水平，測(cè)序結(jié)果顯示，PD-L2 DNA 啟動(dòng)子區(qū)呈高甲基化水平(Kasumi-1 和SKNO-1-PGK 分別為94.3%、88.6%)，DAC 處理后DNA 甲基化水平下降(Kasumi-1 和SKNO-1-PGK 分別為90.7%、83.6%)，見圖2。

圖1 JASPAR 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)PD-L2 基因啟動(dòng)子區(qū)存在潛在轉(zhuǎn)錄因子AML1 結(jié)合位點(diǎn)(A)；啟動(dòng)子序列分析顯示PD-L2 基因啟動(dòng)子區(qū)富含CG 位點(diǎn)(B)Fig.1 JASPAR database predicts the presence of potential transcription factor AML1 binding sites in PD-L2 gene (A);Promoter sequence analysis shows that the promoter region of PD-L2 gene is enriched with CG sites (B)

圖2 A/E 陽性AML 細(xì)胞系PD-L2 DNA 啟動(dòng)子區(qū)特異性位點(diǎn)的甲基化水平及DAC 處理后的水平變化(黑圈和空圈分別代表甲基化和非甲基化CpG 二核苷酸)(A)；DAC 處理前后PD-L2 BSP 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖(B)；DAC 處理前后PD-L2 DNA 啟動(dòng)子區(qū)基因組測(cè)序序列圖(C)Fig.2 Methylation level of PD-L2 DNA promoter region specific sites in A/E positive AML cell lines and changes in the level after decitabine treatment (A);Agarose gel electrophoresis of PD-L2 BSP amplification products before and after decitabine treatment (B);Sequencing of PD-L2 DNA promoter region genome before and after decitabine treatment (C)

2 DAC 對(duì)A/E 陽性AML 細(xì)胞系PD-L2 mRNA表達(dá)的影響 RT-qPCR 檢測(cè)對(duì)照組(0.1% DMSO)及2.5 μmol/L DAC 處理后細(xì)胞系中PD-L2 mRNA水平。結(jié)果顯示，2.5 μmol/L 濃度組PD-L2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平(Kasumi-1：4.75 ± 1.13；SKNO-1-PGK：3.52 ± 0.87；SKNO-1-siA/E：4.78 ± 0.54；U937-MT：3.09 ± 0.85；U937A/E：29.18 ± 23.90；U937A/E+ZnSO4：1.31 ± 0.22)顯著高于對(duì)照組(Kasumi-1：1，P=0.007，t=6.623；SKNO-1-PGK：1，P=0.010，t=5.791；SKNO-1-siA/E：1，P＜0.001，t=15.656；U937-MT：1，P=0.051，t=4.256；U937A/E：1，P=0.034，t=2.888；U937A/E+ZnSO4：1，P=0.037，t=3.087)。見圖3。

圖3 DAC 對(duì)A/E 陽性AML 細(xì)胞系PD-L2 mRNA 表達(dá)的影響Fig.3 Effect of decitabine on PD-L2 mRNA expression in A/E positive AML cell lines

3 沉默或過表達(dá)A/E 后DAC 對(duì)A/E 陽性AML細(xì)胞系PD-L2 mRNA 表達(dá)的影響 RT-qPCR 檢測(cè)SKNO-1-PGK 和 SKNO-1-siA/E 細(xì)胞系 PD-L2 mRNA 表達(dá)量，結(jié)果顯示，后者在沉默A/E 后細(xì)胞PD-L2 mRNA 表達(dá)水平上升(SKNO-1-siA/E 細(xì)胞系PD-L2 mRNA 表達(dá)量較SKNO-1-PGK 升高129.1%)，見圖4A。RT-qPCR 檢測(cè)U937-MT 和U937A/E 細(xì)胞系PD-L2 mRNA 表達(dá)量，結(jié)果顯示，后者在表達(dá)A/E 后細(xì)胞PD-L2 mRNA 表達(dá)水平降低(U937A/E 細(xì)胞系PD-L2 mRNA 表達(dá)量較U937-MT 下降60.9%)，見圖4B。RT-qPCR 檢測(cè)對(duì)照組(0.1% DMSO)及2.5 μmol/L DAC 處理后的兩對(duì)A/E 沉默(SKNO-1-PGK，SKNO-1-siA/E)/誘導(dǎo)細(xì)胞系(U937A/E，U937A/E+ZnSO4)的PD-L2 mRNA 水平，結(jié)果顯示，2.5 μmol/L DAC 處理后，SKNO-1-siA/E 細(xì)胞中PD-L2 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平上升幅度高于SKNO-1-PGK 細(xì)胞(SKNO-1-siA/E 與SKNO-1-PGK 相比上升35.80%)，U937A/E+ZnSO4細(xì)胞中則顯著低于U937A/E 細(xì)胞(U937A/E+ZnSO4與U937A/E 相比下降95.51%)，即A/E 沉默/低表達(dá)細(xì)胞中PD-L2 mRNA 的表達(dá)水平高于同組A/E陽性/過表達(dá)細(xì)胞(處理組SKNO-1-siA/Evs處理組SKNO-1-PGK，P=0.031；處理組U937A/E +ZnSO4vs處理組U937A/E，P=0.036)，見圖5。

圖4 沉默(A)或表達(dá)(B)A/E 后細(xì)胞PD-L2 mRNA 表達(dá)水平的變化(PD-L2 mRNA 表達(dá)量=2-△△Ct)Fig.4 Changes in expression level of PD-L2 mRNA after silencing(A) or expression (B) of A/E (PD-L2 mRNA expression=2-△△Ct)

圖5 沉默(A)或過表(B)A/E 后DAC 對(duì)A/E 陽性AML 細(xì)胞系PD-L2 mRNA 表達(dá)的影響Fig.5 Effect of DAC on PD-L2 mRNA expression in A/E-positive AML cell lines after silencing (A) or overexpression (B) of A/E

4 不同濃度DAC 對(duì)A/E 陽性AML 細(xì)胞系PDL2 mRNA 表達(dá)的劑量影響 RT-qPCR 檢測(cè)對(duì)照組(0.1% DMSO)及不同濃度(0.25 μmol/L、1.0 μmol/L和2.5 μmol/L) DAC 處理后的A/E 陽性AML 細(xì)胞系Kasumi-1、SKNO-1-PGK 中PD-L2 mRNA 水平。RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，在Kasumi-1、SKNO-1-PGK 細(xì)胞系中PD-L2 mRNA 的表達(dá)水平隨DAC濃度增加而升高(Kasumi-1：r2=0.992；SKNO-1-PGK：r2=0.963；SKNO-1-siA/E：r2=0.991)，呈劑量依賴性，見圖6。由于各獨(dú)立樣本未滿足方差分析條件，采用多組計(jì)量資料秩和檢驗(yàn)(K-W 檢驗(yàn))，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Kasumi-1：P=0.002，χ2=14.328；SKNO-1-PGK：P=0.002，χ2=14.328；SKNO-1-siA/E：P=0.001，χ2=17.561)。

圖6 A/E 陽性AML細(xì)胞系Kasumi-1 (A)、SKNO-1-PGK (B)、SKNO-1-siA/E (C) PD-L2 mRNA 的RT-qPCR 熔解曲線圖及不同濃度DAC 對(duì)各細(xì)胞系PD-L2 mRNA 表達(dá)的影響(各細(xì)胞系的各組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)Fig.6 RT-qPCR dissociation curve of PD-L2 mRNA and effect of different concentrations of decitabine on PD-L2 mRNA expression in A/E positive AML cell lines: Kasumi-1 (A),SKNO-1-PGK (B),SKNO-1-siA/E (C) (The differences between the groups of different cell lines were statistically significant)

討論

t(8；21) AML 是一種具有基因及表觀遺傳學(xué)改變的克隆性疾病，占新診斷AML 病例的7%～12%[9-10]，其生物異質(zhì)性對(duì)預(yù)后判斷和治療選擇至關(guān)重要[11]。t(8；21) AML 屬于預(yù)后相對(duì)較好類型，與過去相比，超過80%的患者在強(qiáng)化化療后獲得完全緩解，但仍有約40%達(dá)到完全緩解的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)的中位時(shí)間為2.5年[12-13]，一旦復(fù)發(fā)，則預(yù)后很差[14-15]。研究顯示，單獨(dú)應(yīng)用HMA 治療復(fù)發(fā)/難治AML 患者的平均應(yīng)答率不足20%[16-17]，且耐藥情況比較普遍[5,18]。因此，開發(fā)新的HMA 聯(lián)合用藥方案，提高應(yīng)答率和降低耐藥性具有重要臨床意義。HMA 通過使DNA 去甲基化，重新激活被DNA 甲基化沉默的抑癌基因，是其發(fā)揮作用的關(guān)鍵機(jī)制[19-20]。研究顯示，白血病患者經(jīng)HMA 治療后，白血病細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)分子PD-1、PD-L1、PD-L2 和CTLA4 基因表達(dá)增加，PD-L2 上調(diào)者生存期短[21]。已知免疫檢查點(diǎn)抑制劑，如PD-1 抑制劑，可以通過結(jié)合免疫檢查點(diǎn)分子而抑制PD-1/PD-L1/2 信號(hào)通路活化，進(jìn)而激活細(xì)胞毒性T 細(xì)胞，起到殺傷白血病細(xì)胞的作用[22]。上述機(jī)制為將HMA 與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合應(yīng)用于白血病的治療奠定了理論基礎(chǔ)。免疫逃逸是AML 難治復(fù)發(fā)的重要分子機(jī)制，免疫檢查點(diǎn)PD-1 與其配體PD-L1/2 相互作用，顯著抑制T 細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生[23]，使腫瘤向T 細(xì)胞發(fā)出負(fù)性信號(hào)，誘導(dǎo)T 細(xì)胞耗竭[24-26]，促進(jìn)免疫逃逸。近年來，盡管已有將HMA 與PD-1 抑制劑聯(lián)合用于難治復(fù)發(fā)AML 治療的臨床研究[6]，但應(yīng)答率僅為30%左右。如果我們能夠預(yù)測(cè)哪一類患者更可能會(huì)獲益于這種治療，將有助于指導(dǎo)個(gè)體化治療。

通過BSP 分析，我們證實(shí)了在A/E 陽性AML細(xì)胞系中，PD-L2 DNA 啟動(dòng)子區(qū)的確呈DNA 高甲基化分布，DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑DAC 可使其去甲基化，提示A/E 陽性AML 細(xì)胞中PD-L2基因的表達(dá)很可能受DNA 甲基化調(diào)控。為進(jìn)一步證實(shí)DAC 對(duì)A/E 陽性AML 細(xì)胞PD-L2 分子表達(dá)的影響，我們檢測(cè)了DAC 處理前后PD-L2 基因mRNA 表達(dá)變化，證實(shí)去甲基化處理可使細(xì)胞PD-L2 基因mRNA 表達(dá)呈濃度依賴性增加，提示A/E 陽性細(xì)胞中PD-L2 基因的表達(dá)受DNA 甲基化調(diào)控。已報(bào)道的研究和本項(xiàng)目組的研究結(jié)果均顯示，A/E 融合蛋白中的AML1 結(jié)構(gòu)域可與野生型轉(zhuǎn)錄因子AML1 競(jìng)爭(zhēng)靶基因上相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)[27]，而ETO 通過其鋅指結(jié)構(gòu)域募集轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，進(jìn)而促進(jìn)DNA 甲基化和組蛋白去乙?；瑢?dǎo)致靶基因表達(dá)沉默[28-32]。已報(bào)道的臨床研究顯示，DAC 治療使AML 細(xì)胞PD-L2 基因表達(dá)增加，與DAC 濃度呈正相關(guān)，DAC 治療可使MDS/AML 患者PD-L2 mRNA 表達(dá)增加，且PD-L2 表達(dá)上調(diào)者的總體生存率低于PD-L2 表達(dá)不上調(diào)者，PD-L2的高表達(dá)與AML 患者總體生存不佳相關(guān)[21,33]。這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，提示去甲基化藥物誘導(dǎo)的A/E 陽性AML 中PD-L2 的上調(diào)參與了AML 的發(fā)展，并可能與AML 患者的HMA 治療抵抗相關(guān)。

為進(jìn)一步分析A/E 陽性AML 中PD-L2 與DNA 基化調(diào)控的關(guān)系，我們進(jìn)一步對(duì)比了沉默或過表達(dá)A/E 的細(xì)胞系對(duì)DAC 誘導(dǎo)PD-L2 mRNA表達(dá)作用的差異，我們發(fā)現(xiàn)沉默A/E 的SKNO-1-siA/E 細(xì)胞中PD-L2 mRNA 表達(dá)水平更高，過表達(dá)A/E 的U937A/E 細(xì)胞中PD-L2 mRNA 表達(dá)水平較低，提示A/E 可能介導(dǎo)了PD-L2 的DNA 甲基化沉默。此外，對(duì)于A/E 表達(dá)水平不同的細(xì)胞，DAC 處理后其PD-L2 mRNA 的表達(dá)水平變化也有所差異，表現(xiàn)在雖然DAC 可誘導(dǎo)多個(gè)A/E 陽性AML 細(xì)胞系PD-L2 表達(dá)上調(diào)，但A/E 陰性/低表達(dá)細(xì)胞PD-L2 mRNA 表達(dá)水平上升幅度顯著高于同組A/E 陽性/過表達(dá)細(xì)胞，加之PD-L2 基因存在可能的AML1 結(jié)合位點(diǎn)，提示A/E 可能通過募集轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物參與介導(dǎo)了PD-L2 基因的DNA 甲基化沉默。文獻(xiàn)報(bào)道，t(8；21)染色體重排的存在和A/E 融合基因的產(chǎn)生，在白血病中存在預(yù)測(cè)不同患者結(jié)局的特定DNA 甲基化譜[1]，其潛在機(jī)制涉及A/E 與DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶和某些轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，以抑制目標(biāo)腫瘤抑制基因[8]。

綜上，我們的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了先前的推測(cè)，即A/E 陽性AML 細(xì)胞中PD-L2 基因的表達(dá)受DNA甲基化調(diào)控，這為下一步研究A/E 融合蛋白對(duì)PD-L2 表達(dá)的直接或間接調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。闡明A/E 與PD-L2 基因之間的表達(dá)調(diào)控關(guān)系可為未來將HMA 和PD-1 抑制劑聯(lián)合用于t(8；21)AML 的治療提供理論依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)李夢(mèng)月：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)者和實(shí)驗(yàn)研究執(zhí)行人，完成數(shù)據(jù)分析，論文初稿的寫作與修改；邵楊柳：提供實(shí)驗(yàn)技術(shù)督導(dǎo)，參與實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析；李雨晴：在實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備及數(shù)據(jù)核對(duì)方面給予幫助；王莉莉：提供實(shí)驗(yàn)環(huán)境及實(shí)驗(yàn)設(shè)備；高曉寧：項(xiàng)目的構(gòu)思者及負(fù)責(zé)人，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析、論文審閱。全體作者閱讀并同意最終版論文。

利益沖突所有作者聲明沒有利益沖突。

數(shù)據(jù)共享聲明本研究中生物信息學(xué)資料來源于公共數(shù)據(jù)庫(http://jaspar.genereg.net)，其余支持研究結(jié)果的數(shù)據(jù)可由相應(yīng)的作者在合理要求下聯(lián)系通信作者獲得。