UPLC-MS/MS法檢測(cè)乳制品中3種內(nèi)源性雌激素及其代謝產(chǎn)物的含量

樊亞光 朱盈蕊 榮劍鋒 李琦 李杜娟

摘 要：本文采用UPLC-MS/MS法建立了一種同時(shí)檢驗(yàn)乳制品中3種內(nèi)源性雌激素及其代謝產(chǎn)物含量的方法。結(jié)果表明，3種內(nèi)源性雌激素及其衍生物在5～500 ng·mL-1線性良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均≥0.990，檢出限為0.5～1.0 ng·mL-1，定量限為1.5～3.0 ng·mL-1。該方法簡(jiǎn)單、便捷、快速，適合乳制品中內(nèi)源性雌激素及其代謝物含量的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）；雌激素；乳制品

Determination of Three Endogenous Estrogens and Their Metabolites in Dairy Products by UPLC-MS/MS

FAN Yaguang， ZHU Yingrui， RONG Jianfeng， LI Qi， LI Dujuan

（Zhengzhou Food and Drug Inspection Institute， Zhengzhou 450000， China）

Abstract： A UPLC-MS/MS method was developed for the simultaneous determination of three endogenous estrogens and their metabolites in dairy products. The results showed that the linearity of the three endogenous estrogens and their derivatives was good in the range of 5～500 ng·mL-1. The correlation coefficient （R2） ≥ 0.990， the detection limit was 0.5～1.0 ng·mL-1， and the quantitative limit? was 1.5～3.0 ng·mL-1. The method is simple， convenient and rapid， and is suitable for the determination of endogenous estrogens and their metabolites in dairy products.

Keywords： ultra performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）; estrogen; dairy products

類(lèi)固醇類(lèi)激素在生理學(xué)中起著多種生物反應(yīng)的調(diào)節(jié)器作用，包括細(xì)胞代謝、炎癥、免疫功能、壓力管理、發(fā)育和生理學(xué)等。類(lèi)固醇激素又稱(chēng)為甾體激素，是由腎上腺皮質(zhì)、卵巢和睪丸中的膽固醇通過(guò)代謝途徑合成的，類(lèi)固醇激素的產(chǎn)生或代謝異常是內(nèi)分泌疾病發(fā)生的原因，甾體激素失調(diào)會(huì)造成女性月經(jīng)失調(diào)、青春期提前、乳房提前發(fā)育等異常現(xiàn)象；也會(huì)造成男性精子質(zhì)量下降等異常情況[1]。雌激素可造成機(jī)體免疫失調(diào)等病理反應(yīng)[2]。雌激素活性物質(zhì)主要分為內(nèi)源性雌激素和外源性雌激素，內(nèi)源性雌激素主要是人體和動(dòng)物體自身分泌的激素，如雌醇、雌酮、雌二醇等[3]。

當(dāng)前，動(dòng)物源性食品中雌激素的檢測(cè)方法主要包括液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、免疫分析法等[4-5]。但是因?yàn)榍绑w和代謝物結(jié)構(gòu)相似，且在生物樣品中濃度較低，很難同時(shí)確定多種雌激素，對(duì)日常檢測(cè)造成了不便[6]。常用的免疫分析法具有基質(zhì)干擾，與結(jié)構(gòu)相似的代謝物交叉激活的準(zhǔn)確性不足，靈敏度不高，檢測(cè)范圍有限[7]等缺點(diǎn)?；谫|(zhì)譜的色譜方法，如GC-MS/MS和LC-MS/MS，被認(rèn)為是目前主流的檢測(cè)方法，但氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法需要衍生化步驟，使雌激素在氣相中揮發(fā)或增加電離性質(zhì)，但衍生步驟、非特異性質(zhì)譜裂解和結(jié)合雌激素的可能水解會(huì)損害樣品的通量和準(zhǔn)確性，阻礙其在實(shí)際應(yīng)用中的實(shí)用性[8-9]。為了檢測(cè)復(fù)雜樣品中的低水平雌激素，進(jìn)行UPLC-MS/MS檢測(cè)前的樣品制備至關(guān)重要。如今檢測(cè)已經(jīng)可以采用多種樣品制備技術(shù)，現(xiàn)有方法分析一次只能評(píng)估一種或兩種類(lèi)固醇激素，而同時(shí)測(cè)量多種類(lèi)固醇可節(jié)省極大的物料成本及時(shí)間成本。現(xiàn)有方法多采用正負(fù)離子相結(jié)合的方式，而本文開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證了液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜的新方法，只采用正離子模式，無(wú)需任何衍生步驟，使用0.1%甲酸水和0.1%甲酸甲醇溶液作為流動(dòng)相，通過(guò)Oasis PRiME HLB Cartridge固相萃取柱純化樣品，深入研究了內(nèi)源性雌激素的檢測(cè)，通過(guò)不同前處理方法之間的比較，可以一次定量分析包括雌激素、孕激素、雄性激素等3種內(nèi)源性激素及其衍生物。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑

甲酸（電子純，美國(guó)fisher公司）；乙腈（色譜純，美國(guó)fisher公司）；乙酸（色譜純，美國(guó)fisher公司）；雌酮（Estrone、E1）、雌二醇（Estradiol、E2）、雌三醇（Estriol，E3），純度均大于97%，購(gòu)自TRC-CANADA公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。3種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息見(jiàn)表1。

1.1.2 儀器

Waters?Xevo TQ-S微串聯(lián)質(zhì)譜儀配電噴霧電離（ESI）源，Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

使用十萬(wàn)分之一天平準(zhǔn)確稱(chēng)取3種雌激素及其衍生物各10 mg，分別加入到3個(gè)10 mL的棕色容量瓶中，使用適量甲醇溶解，再進(jìn)行定容，搖勻，配成1.0 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液，-18 ℃避光存放。使用移液槍分別吸取3種雌激素各0.1 mL，使用70%甲醇水定容至10 mL容量瓶中，配制成10 mg·L-1的中間液，使用時(shí)根據(jù)需要配制成5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1和500 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。所有中間液避光存放在-18 ℃冰箱中。

1.2.2 樣品前處理

使用含0.1%甲酸的酸化乙腈對(duì)樣品進(jìn)行提取，與陽(yáng)性基質(zhì)樣品渦旋振蕩15 min，超聲提取15 min，-4 ℃低溫離心，10 000 r·min-1 離心15 min，取上清液4 mL凈化。凈化柱選擇Oasis PRiME HLB Cartridge。將上清液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱，重力過(guò)柱，收集濾液，直接過(guò)濾膜進(jìn)樣。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

為了避免不同填料的色譜柱的影響，本研究選擇Waters?Acquity UPLC C18 HILIC BEH（100 mm×2.1 mm，2.1 μm）、Waters?Acquity UPLC C18 BEH（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Waters?Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）3種色譜柱。經(jīng)對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，Waters?Acquity UPLC C18 BEH（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）分離效果最好。流動(dòng)相A為含有0.1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B為含有0.01%甲酸的甲醇溶液，梯度洗脫見(jiàn)表2，柱溫40 ℃，流速：0.2 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），采用正離子快速切換掃描模式；毛細(xì)管電壓：3. 0 kV（ESI+）；錐孔電壓：35 V（ESI+）；錐孔氣流量：150 L·h-1；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L·h-1；碰撞氣流速：0.18 mL·min-1；霧化氣壓力：0.7 MPa；采用多離子反應(yīng)監(jiān)控（MRM）掃描方式。質(zhì)譜優(yōu)化MRM參數(shù)見(jiàn)表3。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用70%甲醇水溶液將中間液配制成5～500 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示3種內(nèi)源性雌激素及其衍生物在5～500 ng·mL-1線性良好。相關(guān)系數(shù)（R2）均≥0.990，檢出限為0.5～1.0 ng·mL-1，定量限為1.5～3.0 ng·mL-1，詳見(jiàn)表4。

2.2 回收率與精密度

為了評(píng)價(jià)該方法的有效性，測(cè)定了回收率和日內(nèi)精密度等參數(shù)。將高（70 ng·mL-1）、中（40 ng·mL-1）、低（10 ng·mL-1）3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白陰性樣品，回收率為80.20%～105.92%，日間穩(wěn)定性（n=3）為4.7%～11.5%，詳見(jiàn)表5。這些結(jié)果表明，該方法所提供的穩(wěn)定性是合理的，適用于常規(guī)分析。

3 結(jié)論

本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了一種同時(shí)測(cè)定乳制品中3種內(nèi)源性雌激素的檢測(cè)方法，無(wú)需衍生化和復(fù)雜步驟，選擇含0.1%甲酸的酸化乙腈為提取溶劑，Oasis PRiME HLB Cartridge固相萃取柱凈化，使用含0.1%甲酸水溶液和含有0.1%甲酸甲醇溶液為流動(dòng)相，得出的結(jié)果線性關(guān)系良好。本方法快速、便捷，應(yīng)用范圍廣，具有較高的靈敏度、選擇性和準(zhǔn)確性，易于實(shí)現(xiàn)高通量處理，適用于乳制品中內(nèi)源性雌激素及其代謝物含量的分析。此外，該方法還有較強(qiáng)的擴(kuò)展性，對(duì)于多種基質(zhì)中內(nèi)源性雌激素及其衍生物的檢測(cè)都具有可借鑒性，可進(jìn)一步開(kāi)展新的研究。

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基金項(xiàng)目：河南省市場(chǎng)監(jiān)督管理局科技計(jì)劃項(xiàng)目任務(wù)書(shū)（2021sj86）。