抗氰烯菌酯假禾谷鐮孢突變體的誘導(dǎo)及其生物學(xué)特性

逯燕騰 李新蕾 鄧淵鈺 曹淑琳 李偉 孫海燕 陳懷谷

摘要 為評(píng)估引起小麥莖基腐病的病原菌假禾谷鐮孢Fusarium pseudograminearum對(duì)氰烯菌酯的抗性風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)5株敏感菌株進(jìn)行了室內(nèi)藥劑馴化，獲得33株抗性突變體，突變頻率為16.5%，其對(duì)氰烯菌酯的抗性水平范圍為7.39～1 665.76倍，3株表現(xiàn)低抗，4株表現(xiàn)中抗，26株表現(xiàn)高抗;發(fā)現(xiàn)在myosin-5基因上存在11種抗性突變類型，其中217位的絲氨酸突變?yōu)榱涟彼幔⊿217L）、420位的谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔‥420K）和135位的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸（A135T）為主要突變類型，其比例分別為45.5%、15.2%和9.1%。S217L型抗性突變體的產(chǎn)孢量顯著下降，菌絲生長(zhǎng)速率和致病力與親本菌株無(wú)顯著差異。E420K型抗性突變體的菌絲生長(zhǎng)速率和致病力顯著下降，產(chǎn)孢量與親本菌株無(wú)顯著差異。A135T型抗性突變體的菌絲生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量與親本菌株無(wú)顯著差異。研究結(jié)果表明假禾谷鐮孢在藥劑選擇壓力下易形成氰烯菌酯的抗性群體，對(duì)氰烯菌酯存在中到高等的潛在抗性風(fēng)險(xiǎn)，其myosin-5的點(diǎn)突變與其對(duì)氰烯菌酯的抗性相關(guān)。

關(guān)鍵詞 小麥莖基腐病;?假禾谷鐮孢;?氰烯菌酯;?抗藥性;?生物學(xué)特性;?myosin-5

中圖分類號(hào)： S 435.121.49

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2021707

Abstract In order to assess the resistance risk of Fusarium pseudograminearum to phenamacril， a total of 33 phenamacril-resistant mutants were obtained through spontaneous selection with a mutation frequency of 16.5%， and the resistance level of these mutants to phenamacril ranged from 7.39 to 1 665.76 times， with three mutants showing low resistance， four mutants showing moderate resistance and 26 mutants showing high resistance. Eleven types of resistance mutations were found in myosin-5 gene. A serine （S） to leucine （L） transition at position 217 （S217L）， a glutamic （E） to lysine （K） transition at position 420 （E420K）， and an alanine （A） to threonine （T） transition at position 135 （A135T） were major mutation types， with a frequency of 45.5%， 15.2% and 9.1%， respectively. Compared with the parental strains， the spore production of the type S217L resistant mutants was significantly decreased， but there was no significant difference in mycelial growth rate and pathogenicity. Mycelial growth rate and pathogenicity of the type E420K resistant mutants were significantly decreased， and no significant difference was observed in spore production. The point mutation of myosin-5 was related to its resistance to phenamacril. The mycelial growth rate and spore production of A135T resistant mutants were not significantly different from the parental strains. The results suggested that F.pseudograminearum could easily form the phenamacril-resistant population under the pressure of fungicide selection， and had a moderate or high risk of resistance to phenamacril.

Key words wheat crown rot;?Fusarium pseudograminearum;?phenamacril;?resistance;?biological characteristics;?myosin-5

小麥莖基腐?。╟rown rot， CR）是由多種鐮刀菌引起的土傳病害［1-3］，在美國(guó)、加拿大、澳大利亞、中國(guó)等地廣泛發(fā)生［4-8］，我國(guó)小麥莖基腐病的主要病原菌為假禾谷鐮孢Fusarium pseudograminearum、亞洲鐮孢F.asiaticum和禾谷鐮孢F.graminearum等。不同地區(qū)引起莖基腐病的優(yōu)勢(shì)種不同，河南、河北、山西及山東等地以假禾谷鐮孢為優(yōu)勢(shì)種，而安徽、江蘇等地以禾谷鐮孢復(fù)合種為主［1，7-8］。

小麥莖基腐病從小麥分蘗到成熟期均可發(fā)生，感病小麥莖基部葉鞘和莖稈變褐，莖節(jié)壞死，嚴(yán)重時(shí)植株死亡、枯白（孕穗期），出現(xiàn)白穗，小麥產(chǎn)量下降［8］。2010年前，該病害在我國(guó)偶有發(fā)生，危害不嚴(yán)重。近年來(lái)由于秸稈還田使土壤內(nèi)病原菌不斷積累、不合理使用化肥導(dǎo)致土壤鹽漬化嚴(yán)重，該病害在我國(guó)黃淮麥區(qū)逐年加重，對(duì)小麥安全生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅［9-11］。據(jù)報(bào)道，2013年－2016年間小麥莖基腐病在河南省部分重病田造成小麥產(chǎn)量損失高達(dá)38.0%～61.3%［12-13］;在河北省嚴(yán)重地塊白穗率高達(dá)20%～50%［14］;2019年山東省鄒城市小麥莖基腐病地塊發(fā)生率高達(dá)66.8%［15］;2017年－2019年，陜西省小麥莖基腐病發(fā)生面積均達(dá)到10萬(wàn) hm2以上［16］。

化學(xué)防治是目前控制該病害發(fā)生的主要方法之一。紀(jì)莉景等研究發(fā)現(xiàn)6種種衣劑包衣處理對(duì)小麥苗期莖基腐病病株率和病情指數(shù)的防效分別在60.4%～100.0%和45.5%～100.0%，隨著小麥生育期的推移，種衣劑的防治效果均呈下降趨勢(shì)［17］。張守成等研究發(fā)現(xiàn)種子處理或返青期噴施不同殺菌劑對(duì)小麥莖基腐病均有較好防效，但不同殺菌劑的防控效果及持效期有明顯差異［18］。

氰烯菌酯是一種2-氰基丙烯酸酯類殺菌劑，由江蘇省農(nóng)藥研究所于1998年自主研發(fā)。它對(duì)鐮刀菌具有?；咕钚?，已登記用于小麥赤霉病和水稻惡苗病的防治［19-20］。據(jù)報(bào)道，氰烯菌酯能抑制禾谷鐮孢肌球蛋白myosin-5馬達(dá)結(jié)構(gòu)域的ATP酶活性，從而導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白絲聚合受阻，影響囊泡運(yùn)輸，使菌絲細(xì)胞不能極性生長(zhǎng)［21-23］。肌球蛋白myosin-5基因的突變導(dǎo)致了禾谷鐮刀菌對(duì)氰烯菌酯的抗性。目前該藥劑還未在小麥莖基腐病防治上登記使用，也未有假禾谷鐮孢對(duì)其抗性的研究報(bào)道。本研究以假禾谷鐮孢為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行氰烯菌酯抗性突變體的誘導(dǎo)，并對(duì)抗性機(jī)理和突變體生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以期為氰烯菌酯在小麥莖基腐病防治上的應(yīng)用提供參考。

1?材料與方法

1.1?供試材料

供試菌株： 5株分別從山東壽光、江蘇鹽城和連云港采集的假禾谷鐮孢菌株CF1558、CF1566、CF15128、CF15263和CF15281，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所小麥病害防控團(tuán)隊(duì)分離純化、保存和鑒定。

供試藥劑：95%氰烯菌酯原藥，由江蘇省農(nóng)藥研究所股份有限公司提供，用甲醇溶解配制成1×104μg/mL的母液，于4℃保存，備用。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g，加蒸餾水定容至1 L，用于菌株的培養(yǎng)及保存;羧甲基纖維素鈉（CMC）培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉15 g、NH4NO3 1 g、KH2PO4 1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、酵母提取物1 g，加蒸餾水定容至1 L，用于菌株產(chǎn)孢培養(yǎng)。

1.2?方法

1.2.1?假禾谷鐮孢抗性突變體誘導(dǎo)

將5株假禾谷鐮孢分別接種到PDA平板上預(yù)培養(yǎng)4 d后，于菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅，將菌餅菌絲面朝下接于含5 μg/mL氰烯菌酯的PDA平板上［24］，每平板接種10個(gè)菌餅，每菌株接種40個(gè)，25℃黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)的扇形突變菌落即為疑似抗性突變體，將其轉(zhuǎn)接到含5 μg/mL氰烯菌酯的PDA平板上進(jìn)行抗性驗(yàn)證，能夠生長(zhǎng)的即為抗性突變體，命名為R-親本菌株編號(hào)后兩位-序號(hào)。計(jì)算抗性突變頻率。

抗性突變頻率＝（抗性突變體數(shù)／藥劑馴化的菌餅數(shù)）× 100%。

1.2.2?抗性水平測(cè)定

將抗性突變體及其親本菌株分別接種到PDA平板上，25℃預(yù)培養(yǎng)4 d后，在菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，親本菌株轉(zhuǎn)接到含0、0.125、0.25、0.5、1、2、4 μg/mL氰烯菌酯的PDA平板上，抗性突變體接于含0、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160 μg/mL氰烯菌酯的PDA平板上，25℃黑暗培養(yǎng)4 d，十字交叉法測(cè)量菌落直徑取平均值。每菌株3次重復(fù)。根據(jù)各突變體的EC50與其親本菌株的EC50比值計(jì)算抗性倍數(shù)，根據(jù)抗性倍數(shù)將各突變體的抗性水平劃分為敏感、低抗、中抗和高抗［25］，其中：抗性倍數(shù)≤3的為敏感菌株（S）;3<抗性倍數(shù)≤10的為低抗菌株（LR）;10<抗性倍數(shù)≤100的為中抗菌株（MR）;抗性倍數(shù)>100的為高抗菌株（HR）。

1.2.3?抗性遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

從藥劑馴化獲得的抗性突變體中每種突變類型各選取1株進(jìn)行測(cè)定。將-80℃保存6個(gè)月后的11株抗性突變體在無(wú)藥PDA平板上繼代培養(yǎng)4代，25℃黑暗培養(yǎng)5 d，按1.2.2節(jié)方法中的十字交叉法測(cè)定抗性突變體對(duì)氰烯菌酯的敏感性（EC50），計(jì)算抗性倍數(shù)，并根據(jù)抗性突變體的生長(zhǎng)速度確定其遺傳穩(wěn)定性。

1.2.4?myosin-5 基因擴(kuò)增及序列分析

將抗性突變體及其親本菌株在PDA平板上25℃恒溫培養(yǎng)4 d后，收集菌絲，采用CTAB法提取菌絲基因組DNA［26］。使用myosin-5基因序列特異性引物5-F（5′-CGACAAATTCACTTCAGGCTC-3′），5-R（5′-TTGCCTGTCTGCTACCATCA-3′），以提取的基因組DNA為模板， 使用南京諾唯贊生物科技有限公司的Max Super-Fidelity DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min;95℃變性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸60 s，循環(huán)35次;72℃延伸5 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將目的擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程 （上海） 股份有限公司測(cè)序，分析突變體myosin-5基因的堿基及氨基酸變化情況。

1.2.5?抗性突變體的生物學(xué)特性研究

1.2.5.1?菌絲生長(zhǎng)速率測(cè)定

將抗性突變體及其親本菌株分別沿菌落邊緣，用直徑為5 mm的打孔器打取菌餅，接種于無(wú)藥PDA平板上，25℃黑暗培養(yǎng)4 d后，十字交叉法測(cè)量菌落直徑［27］。每菌株3次重復(fù)。

1.2.5.2?產(chǎn)孢量測(cè)定

將抗性突變體及其親本菌株沿菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，放入裝有50 mL CMC的培養(yǎng)瓶中，每瓶接種5個(gè)菌餅，25℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)孢。5 d后無(wú)菌條件下過(guò)濾獲得孢子懸浮液，適量無(wú)菌水稀釋至合適濃度，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)算孢子數(shù)量。每菌株3次重復(fù)。

1.2.5.3?致病力測(cè)定

抗性突變體及其親本菌株對(duì)苗期小麥的致病力測(cè)定參照Gardiner等［28］的方法。采用1.2.5.2方法誘導(dǎo)產(chǎn)孢，將孢子懸浮液濃度調(diào)整至1×105個(gè)/mL。將消毒后的‘揚(yáng)麥158小麥種子置于鋪有單層濾紙的培養(yǎng)皿中，清水保濕，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽。2 d后選取萌發(fā)一致的種子浸蘸孢子懸浮液10 s，用無(wú)紡布包裹保持均勻間距的10粒種子豎直放置于裝有適量水的廣口塑料瓶中，25℃、L∥D=12 h∥12 h光暗交替的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中清水保濕。每處理3次重復(fù)，14 d后記錄幼苗發(fā)病情況。參照Bovill等［29］的方法根據(jù)第1葉鞘下莖稈褐變長(zhǎng)度，對(duì)小麥莖基腐病發(fā)生的嚴(yán)重度進(jìn)行分級(jí)，0級(jí)：無(wú)病;1級(jí)：褐變長(zhǎng)度為25%以下;2級(jí)：褐變長(zhǎng)度為25%～50%;3級(jí)：褐變長(zhǎng)度為51%～75%;4級(jí)：褐變長(zhǎng)度為76%～100%。計(jì)算各處理的病情指數(shù)。

病情指數(shù)=100×Σ（各級(jí)病株數(shù)×病級(jí)值）/（調(diào)查總株數(shù)×4）。

1.3?數(shù)據(jù)分析

采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)LSD法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，測(cè)序結(jié)果用DNAMAN軟件進(jìn)行序列對(duì)比分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?假禾谷鐮孢抗性突變體的類型

5株親本菌株經(jīng)藥劑馴化25 d后，共獲得33株抗性突變體，平均突變頻率為16.5%。通過(guò)對(duì)抗性突變體及其親本菌株的myosin-5基因序列分析，發(fā)現(xiàn)11種突變類型，其中217位絲氨酸（serine）突變?yōu)榱涟彼幔╨eucine） （S217L）、420位谷氨酸（glutamic acid）突變?yōu)橘嚢彼幔╨ysine） （E420K）和135位丙氨酸（alanine）突變?yōu)樘K氨酸（threonine） （A135T）為主要突變類型，其比例分別為45.5%、15.2%和9.1%（表1）。

2.2?假禾谷鐮孢抗性突變體的抗性水平

5株親本菌株對(duì)氰烯菌酯的EC50為0.27～0.38 μg/mL，33株抗性突變體的EC50為2.07～459.75 μg/mL，抗性水平范圍為7.39～1 665.76倍。33株抗性突變體中3株表現(xiàn)低抗，4株表現(xiàn)中抗，26株表現(xiàn)高抗。3種主要突變類型中，S217L型和E420K型表現(xiàn)高抗，A135T型表現(xiàn)低抗（表1）。

2.3?假禾谷鐮孢抗性突變體的遺傳穩(wěn)定性

經(jīng)藥劑馴化的11株抗性突變體在無(wú)藥的PDA培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)4代后，第1代和第4代的菌落生長(zhǎng)速度無(wú)明顯差異，對(duì)氰烯菌酯的EC50也無(wú)明顯變化（表2），表明室內(nèi)藥劑馴化獲得的假禾谷鐮孢抗氰烯菌酯突變體可穩(wěn)定遺傳。

2.4?假禾谷鐮孢抗性突變體的生物學(xué)特性

2.4.1?菌絲生長(zhǎng)速率

抗性突變體及其親本菌株培養(yǎng)4 d后，親本菌株菌落直徑在6.07～7.40 cm之間，抗性突變體菌落直徑在2.30～7.57 cm之間（表3）。差異顯著性分析結(jié)果表明，E420K、E215K和K216E型抗性突變體的菌絲生長(zhǎng)速率顯著低于其親本菌株（表3，圖1），其他抗性突變體與其親本菌株沒(méi)有顯著性差異 （P>0.05）。

2.4.2?產(chǎn)孢能力

S217L、E215K和I581T型抗性突變體的產(chǎn)孢量顯著低于其親本菌株（表3），其他類型突變體的產(chǎn)孢量與其親本菌株相似，不存在顯著差異（P>0.05）。

2.4.3?致病力

與親本菌株相比，S217L、S418G和A577T型抗性突變體的致病力無(wú)顯著差異，其他突變體的致病力顯著下降（P<0.05） （圖2），病情指數(shù)下降范圍在5.37～48.44（表3）。

3?結(jié)論與討論

小麥莖基腐病是近年來(lái)我國(guó)小麥生產(chǎn)中發(fā)展迅速、危害嚴(yán)重的病害之一。該病害在小麥整個(gè)生育期都可發(fā)生，目前還未有完善的防治體系。周淼平等研究發(fā)現(xiàn)黃淮麥區(qū)大部分小麥推廣品種對(duì)小麥莖基腐病表現(xiàn)感病或高度感病，無(wú)高抗品種，只有極少數(shù)表現(xiàn)中抗［30］。因此在缺乏好的抗病品種情況下，化學(xué)防治是確保小麥穩(wěn)產(chǎn)的重要保障。目前小麥莖基腐病化學(xué)防治研究主要集中于篩選有效藥劑和明確藥劑防效［15-18］，對(duì)藥劑的抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和抗性機(jī)制研究還很少。前期研究結(jié)果表明，氰烯菌酯對(duì)假禾谷鐮孢等小麥莖基腐病菌具有較好的抑制作用，對(duì)于田間病害的發(fā)生也具有較好的控制效果。明確小麥莖基腐病菌對(duì)氰烯菌酯的抗性風(fēng)險(xiǎn)和抗性機(jī)制對(duì)于該藥劑在防治小麥莖基腐病中的開(kāi)發(fā)應(yīng)用有重要意義。

已有研究表明，氰烯菌酯的作用靶標(biāo)是病原菌的肌球蛋白-5（myosin-5）［23，31］。肌球蛋白是真核細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白依賴的ATP酶的馬達(dá)蛋白，在細(xì)胞質(zhì)運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞極性、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、胞內(nèi)運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)上有著極其重要的作用［23，31］。病原菌對(duì)氰烯菌酯產(chǎn)生抗性與肌球蛋白-5點(diǎn)突變相關(guān)。周明國(guó)教授團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)小麥赤霉病菌的肌球蛋白-5至少有12個(gè)氨基酸殘基可發(fā)生總頻率為23.9%的不同抗藥性水平變異［32］，其中最常見(jiàn)的突變類型是217位的絲氨酸突變?yōu)榱涟彼幔⊿217L）和420位的谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔‥420K）［33］。李斌研究發(fā)現(xiàn)水稻惡苗病菌對(duì)氰烯菌酯產(chǎn)生田間抗性的主要原因是肌球蛋白-5的219位由絲氨酸突變?yōu)楦彼幔⊿219P）和絲氨酸突變?yōu)榱涟彼幔⊿219L）［34］。本研究發(fā)現(xiàn)假禾谷鐮孢對(duì)氰烯菌酯的抗性至少存在11種突變類型，主要突變類型與小麥赤霉病菌相似，都為S217L和E420K型，這表明不同鐮刀菌對(duì)氰烯菌酯的抗性機(jī)制相似。

氰烯菌酯作用位點(diǎn)單一，其抗性風(fēng)險(xiǎn)備受關(guān)注。本文研究發(fā)現(xiàn)在離體條件下假禾谷鐮孢對(duì)氰烯菌酯易產(chǎn)生抗性，平均突變頻率為16.5%，這與亞洲鐮孢對(duì)氰烯菌酯的突變頻率相近，這可能與氰烯菌酯的作用靶標(biāo)相關(guān)，且其作用靶標(biāo)肌球蛋白-5的馬達(dá)結(jié)構(gòu)域在藥劑作用下容易發(fā)生改變，從而導(dǎo)致抗性的產(chǎn)生。在獲得的抗性突變體中主要突變類型（S217L和E420K）的抗性水平高，且S217L型抗性突變體的菌絲生長(zhǎng)速率、致病力與其親本相似，表明假禾谷鐮孢對(duì)氰烯菌酯存在潛在的抗性風(fēng)險(xiǎn)。S217L型抗性突變體的產(chǎn)孢能力顯著低于其親本菌株，E420K型抗性突變體的菌絲生長(zhǎng)速率、致病力顯著低于其親本菌株，表明這兩種主要抗性突變體的適合度弱于親本菌株，將來(lái)在田間流行的風(fēng)險(xiǎn)較低。周明國(guó)教授團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)小麥赤霉病菌對(duì)氰烯菌酯的主要抗性突變類型（S217L）也是產(chǎn)孢能力低于親本菌株［33］，推測(cè)與肌球蛋白-5結(jié)構(gòu)域內(nèi)類似“口袋”的結(jié)構(gòu)有關(guān)，在誘導(dǎo)過(guò)程中這類區(qū)域的變化可以直接影響抗藥水平，也有可能間接影響病菌的其他表型。大部分在室內(nèi)誘導(dǎo)下表現(xiàn)出高抗的抗性菌株的產(chǎn)孢量發(fā)生了顯著的降低，減弱了突變菌株在田間的適應(yīng)性，從而降低了抗性菌株在田間的種群比例［35］，這可能是氰烯菌酯在小麥赤霉病防治上使用近十年還一直未有抗藥性報(bào)道的原因之一。

氰烯菌酯于2012年同時(shí)登記用于小麥赤霉病和水稻惡苗病的防治，但目前僅有水稻惡苗病菌對(duì)其有田間抗性的報(bào)道［31］。這兩種病原菌對(duì)氰烯菌酯田間抗性風(fēng)險(xiǎn)的差異可能與病原菌本身特性相關(guān)，也有可能與施藥方式、施藥劑量相關(guān)，氰烯菌酯在小麥赤霉病防治上主要是揚(yáng)花期噴霧，在水稻惡苗病防治上主要是浸種。小麥莖基腐病的化學(xué)防治既可以用藥劑種子包衣，也可以在小麥拔節(jié)前噴施藥劑，不同用藥方式是否會(huì)導(dǎo)致病原菌對(duì)藥劑的抗性風(fēng)險(xiǎn)存在差異需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

本研究尚處于室內(nèi)試驗(yàn)階段，所得結(jié)果僅可為假禾谷鐮孢對(duì)氰烯菌酯的抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考，后續(xù)還將深入開(kāi)展研究。

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（責(zé)任編輯：田?喆）