甘草次酸修飾的莪術(shù)醇-芍藥苷共載納米脂質(zhì)體的制備及表征

曾盈蓉　蔣婉婷　彭程　雷雨菁　夏新華

〔摘要〕 目的 優(yōu)選甘草次酸修飾的莪術(shù)醇-芍藥苷共載納米脂質(zhì)體（GA-Cur-PF-Lips）的制備工藝，并對其理化性質(zhì)進(jìn)行表征。方法 采用乙醇注入法制備GA-Cur-PF-Lips，通過單因素考察和Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)選其制備工藝；利用透射電鏡觀察其顯微形態(tài)，采用馬爾文激光粒徑儀測定其粒徑、多分散指數(shù)（polydispersity index， PDI）及Zeta電位，并對其體外釋放度、溶血性進(jìn)行考察。結(jié)果 最佳工藝：脂質(zhì)量85.19 mg，膽脂比1∶9.74，總投藥量4.5 mg，導(dǎo)脂比1∶40，超聲時間6.4 min（工作2 s、停2 s）。制得的GA-Cur-PF-Lips外觀澄清并伴有淡藍(lán)色乳光，透射電鏡下觀察呈類球形；其平均粒徑為（101.1±0.25） nm，PDI為0.170±0.011，Zeta電位為（0.333±0.060） mV，莪術(shù)醇包封率為86.65%±1.11%，芍藥苷包封率為47.85%±1.02%，總載藥量為1.233%±0.022%；體外釋放呈現(xiàn)緩釋特征，且無明顯的溶血作用。結(jié)論 優(yōu)化后的GA-Cur-PF-Lips包封率高、粒徑小且分布均勻，無溶血性，且具有一定的緩釋作用，可為GA-Cur-PF-Lips進(jìn)一步研發(fā)為低毒高效的抗肝癌新藥奠定基礎(chǔ)。

〔關(guān)鍵詞〕 莪術(shù)醇；芍藥苷；納米脂質(zhì)體；乙醇注入法；Box-Behnken響應(yīng)面法；理化性質(zhì)

〔中圖分類號〕R283.6? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.05.011

Preparation and characterization of curcumol and paeoniflorin co-loaded nanoliposomes

modified by glycyrrhetinic acid

ZENG Yingrong， JIANG Wanting， PENG Cheng， LEI Yujing， XIA Xinhua

College of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To optimize the preparation process of curcumol and paeoniflorin co-loaded nanoliposomes （GA-Cur-PF-Lips） modified with glycyrrhetinic acid， and to characterize the physicochemical properties. Methods GA-Cur-PF-Lips were prepared by ethanol injection， and the preparation process was optimized by single-factor investigation and Box-Behnken response surface optimization method. The microscopic morphology was observed by transmission electron microscopy， the particle size， polydispersion index （PDI） and Zeta potential were measured by Malvern laser particle size analyzer， and the release degree and hemolysis were investigated in vitro. Results The optimum process was as follows： lipid weight was 85.19 mg， the ratio of cholesterol to phospholipid was 1∶9.74， the total dosage was 4.5 mg， the ratio of the guiding molecule to the lipid mass was 1∶40 and the ultrasonic time was 6.4 min （on for 2 s， off for 2 s）. The obtained GA-Cur-PF-Lips were clear with pale blue opalescence， and spherical in appearance under transmission electron microscope. The average particle size was （101.1±0.25） nm， the PDI was 0.170±0.011， the Zeta potential was （0.333±0.060） mV， the encapsulation rate of curcumol was 86.65%±1.11%， the encapsulation rate of paeoniflorin was 47.85%±1.02%， the total drug load was 1.233%±0.022%. Its in vitro release presented slow release characteristics， and there was no obvious hemolysis. Conclusion With high encapsulation rate， small particle size and uniform distribution， the optimized GA-Cur-PF-Lips have no obvious hemolysis， and have a certain sustained release effect. The experimental findings can lay a foundation for the further development of GA-Cur-PF-Lips as a new drug with low toxicity and high efficiency against liver cancer.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 curcumol; paeoniflorin; nano liposomes; ethanol injection method; Box-Behnken response surface method; physicochemical property

肝癌是世界范圍內(nèi)癌癥死亡的主要原因之一，腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖能力，且很容易轉(zhuǎn)移到身體的其他部位并產(chǎn)生有害物質(zhì)，破壞正常器官結(jié)構(gòu)，危害人類生命和健康[1-2]。莪術(shù)醇是近年來發(fā)現(xiàn)的新的抗腫瘤中藥單體之一，它與許多傳統(tǒng)化學(xué)抗腫瘤藥物相比，具有無致突變性、低毒、安全可靠的特點，并且對多種腫瘤有治療效果[3]，芍藥苷是一種水溶性單萜類糖苷，在抗腫瘤方面有廣闊的應(yīng)用前景[4]。已有研究表明莪術(shù)醇和芍藥苷均能通過不同途徑和通路抗肝癌：莪術(shù)醇抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老和凋亡[5-8]，芍藥苷可通過不同的分子機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[9-12]。

脂質(zhì)體系指將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層而形成的微型泡囊體[13]。脂質(zhì)體擁有獨(dú)特的雙分子層結(jié)構(gòu)，既無毒又可生物降解，且具有改善藥物溶解性，提高藥物穩(wěn)定性，增強(qiáng)體內(nèi)靶向性從而提高藥物療效等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于腫瘤的治療[14]。肝癌多發(fā)生于肝實質(zhì)細(xì)胞，研究證實該細(xì)胞表面存在大量的甘草次酸（glycyrrhetinic acid， GA）特異性結(jié)合位點[15]，脂質(zhì)體經(jīng)甘草次酸修飾后，對HepG2細(xì)胞具有更高的親和力[16]，從而提高了脂質(zhì)體對肝癌細(xì)胞的靶向性。

前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)莪術(shù)醇-芍藥苷（1∶1）聯(lián)用對HepG2細(xì)胞增殖的抑制有一定的協(xié)同作用，為此設(shè)計將莪術(shù)醇-芍藥苷共載于甘草次酸修飾的脂質(zhì)體中，以便二者通過不同途徑和通路發(fā)揮協(xié)同作用，進(jìn)一步提高其抗肝腫瘤效果。本文采用單因素實驗結(jié)合Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法，對GA修飾的莪術(shù)醇-芍藥苷共載納米脂質(zhì)體（GA-Cur-PF-Lips）的處方與制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化，以期為研發(fā)一種低毒高效的抗肝癌新制劑奠定制劑學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料

Agilent Technologies 1200 Series高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Precisa XB 220A型分析天平（瑞士Precisa重量分析股份公司）；01A418型超聲細(xì)胞粉碎機(jī)、SCIENTZ-10N型冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Zetasizer Nano-ZS90激光粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）；ZNCL-G型智能磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SPX-250B型恒溫培養(yǎng)箱（上海博泰實驗設(shè)備有限公司）；H3-20KR型臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）。

莪術(shù)醇對照品（批號：100185-201908，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%）、芍藥苷對照品（批號：110736-202145，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.6%）（中國食品藥品檢定研究院）；莪術(shù)醇原料藥（批號：F17HB175748，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）、芍藥苷原料藥（批號：M28GS143089，質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%）、大豆卵磷脂（批號：T7011F127302））、D44 mm透析袋（截留相對分子質(zhì)量8000～14 000）（上海源葉生物有限公司）；二硬脂酰基磷脂乙醇胺-聚乙二醇2000-甘草次酸（DSPE-PEG2000-GA，西安齊岳生物科技有限公司）；膽固醇（批號20181128）、甲醇（色譜純）、無水乙醇（分析純）（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；無菌脫纖維兔血（批號210624，廣州鴻泉生物科技有限公司）；乙腈（色譜純，美國TEDIA天地試劑公司）；磷酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；蒸餾水（華潤怡寶飲料有限公司），其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1? 莪術(shù)醇與芍藥苷的HPLC含量測定

2.1.1? 色譜條件? （1）莪術(shù)醇：Zorbax SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以0.1%磷酸水-乙腈溶液（40∶60）為流動相；檢測波長為210 nm；柱溫為35 ℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL。

（2）芍藥苷：Zorbax SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸水（14∶86）為流動相；檢測波長為230 nm；柱溫為25 ℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL。

2.1.2? 對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液的制備? （1）對照品溶液的制備：精密稱取莪術(shù)醇對照品適量，加甲醇稀釋制成每1 mL含5 μg的莪術(shù)醇對照品溶液。另精密稱取芍藥苷對照品，加甲醇稀釋制成每1 mL含10 μg的芍藥苷對照品溶液。

（2）空白對照溶液、供試品溶液與陰性對照溶液的制備：溶劑甲醇過0.22 μm微孔濾膜，作為空白對照，備用；精密移取GA-Cur-PF-Lips供試品1 mL，加入甲醇[17]（破乳劑）定容至25 mL，過0.22 μm微孔濾膜，備用。同樣方法處理空白脂質(zhì)體樣品作為陰性溶液。

2.1.3? 專屬性試驗? 分別取“2.1.2”項下空白對照溶液、莪術(shù)醇對照品溶液、芍藥苷對照品溶液、GA-Cur-PF-Lips供試品溶液、陰性溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件分別進(jìn)樣測定。結(jié)果表明，供試品色譜分別在與莪術(shù)醇、芍藥苷對照品色譜峰相應(yīng)的位置顯相同的色譜峰，陰性對照均無干擾（見圖1—2）。

2.1.4? 線性關(guān)系考察? （1）莪術(shù)醇：精密吸取莪術(shù)醇對照品母液稀釋成質(zhì)量濃度分別為40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25、0.625 μg/mL的系列對照品溶液，按“2.1.1”項色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為Y＝15.709X+4.231 6，r2＝0.999 9，表明莪術(shù)醇在0.625～40.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

（2）芍藥苷：精密吸取上述芍藥苷對照品母液稀釋成質(zhì)量濃度分別為80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25 μg/mL的系列對照品溶液，按“2.1.1”項色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為Y＝14.311X，r²＝0.999 6，表明芍藥苷在1.25～80.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.1.5? 方法學(xué)考察? 分別進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收實驗，結(jié)果表明，莪術(shù)醇和芍藥苷的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性實驗RSD均小于3%，符合要求；加樣回收莪術(shù)醇加樣平均回收率為101.84%±0.78%，芍藥苷加樣回收率是101.78%±0.67%，表明測定方法的準(zhǔn)確度高。

2.2? 包封率和載藥量的測定

2.2.1? 包封率的測定? 采用透析法測定GA-Cur-PF-Lips包封率。精密移取pH=5的PBS 50 mL作為透析介質(zhì)，吸取GA-Cur-PF-Lips 1 mL放入透析袋中，在25 ℃、磁力攪拌（300 r/min）下透析，分別于透析15、30、45、60、90、120、150、180 min時取透析液進(jìn)樣測定。結(jié)果表明，隨著透析時間延長，透析介質(zhì)中游離莪術(shù)醇與芍藥苷的峰面積均一直增加，從30～45 min期間，透析袋內(nèi)外的莪術(shù)醇與芍藥苷呈現(xiàn)透析平衡狀態(tài)，而后透析介質(zhì)中游離藥物逐步增多，說明脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)開始被破壞，故確定透析時間為30～45 min（見圖3）。包封率按下述公式計算。

包封率（%）=（總藥量－游離藥量）/總藥量×100%

2.2.2? 總載藥量的測定? 精密移取2 mL GA-Cur-PF-Lips置于已干燥至恒定質(zhì)量的西林瓶中，冷凍干燥 48 h，得凍干粉，稱量，計算供試品凍干粉凈質(zhì)量。將凍干粉復(fù)溶后取1 mL樣品充分破乳后，按“2.1.1”項下色譜條件測定凍干粉中的莪術(shù)醇和芍藥苷的總藥量，計算總載藥量。

總載藥量（%）＝總藥量/凍干粉凈質(zhì)量×100%

2.3? GA-Cur-PF-Lips的制備

采用乙醇注入法制備GA-Cur-PF-Lips。精密稱取芍藥苷2 mg溶于10 mL磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=5）中作為水相，大豆卵磷脂80 mg、膽固醇20 mg、莪術(shù)醇2 mg溶于5 mL無水乙醇中作為油相，將油相預(yù)熱至60 ℃勻速滴入水相中，在磁力攪拌下（600 r/min）于60 ℃避光水合1 h后減壓旋蒸除去乙醇，經(jīng)探頭超聲（200 W，工作2 s、停2 s）一定時間后定容，分別過0.45、0.22 μm微孔濾膜，即得。同樣方法制備空白脂質(zhì)體樣品。

2.4? 制備工藝的單因素考察

2.4.1? 超聲時間的考察? 參照“2.3”項下方法制備脂質(zhì)體，并分別考察不同超聲時間（3、6、9、12、15 min）對脂質(zhì)體的影響。結(jié)果表明，隨著超聲時間的增加，粒徑呈現(xiàn)增大的趨勢，PDI與Zeta電位變化不明顯，芍藥苷與莪術(shù)醇的包封率則先增大后減小，兩藥包封率均在超聲6 min時達(dá)到最大值，故選擇超聲時間3～9 min做進(jìn)一步優(yōu)化。

2.4.2? 脂質(zhì)量的考察? 通過預(yù)實驗摸索，選擇以大豆卵磷脂為原料，其他制備條件同“2.4.1”項，設(shè)計脂質(zhì)量為20、40、80、120、160 mg分別進(jìn)行考察。結(jié)果表明，隨著脂質(zhì)總量的增加，粒徑總體呈現(xiàn)減小的趨勢，PDI升高，Zeta電位總體先升高后降低，包封率均呈現(xiàn)增大的趨勢，在脂質(zhì)量為80 mg時兩藥包封率及各項指標(biāo)均無較大變化，故選擇脂質(zhì)量在40～120 mg做進(jìn)一步優(yōu)化。

2.4.3? 膽脂比的考察? 固定脂質(zhì)量80 mg，水合溫度55 ℃，其他制備條件同“2.4.2”項，設(shè)計膽脂比（即膽固醇與大豆卵磷脂的質(zhì)量比）為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14分別進(jìn)行考察。結(jié)果表明，隨著膽脂比的減少（即膽固醇相對比例下降），粒徑總體呈現(xiàn)減小的趨勢，PDI總體呈減小趨勢，Zeta電位總體略有降低，包封率均呈現(xiàn)增大后減小的趨勢，在膽脂比1∶10時達(dá)最優(yōu)值，故選取膽脂比1∶8～1∶12做進(jìn)一步優(yōu)化。

2.4.4? 總投藥量的考察? 固定膽脂比為1∶10，其他制備條件同“2.4.3”項，設(shè)計總投藥量為3、4.5、6、9 mg分別進(jìn)行考察。由于莪術(shù)醇包封率約為芍藥苷的2倍，故將二者投藥比設(shè)為1∶2以使包封的莪術(shù)醇-芍藥苷接近1∶1，從而更好地發(fā)揮其協(xié)同作用。結(jié)果表明，總投藥量增加，平均粒徑、PDI、Zeta電位及莪術(shù)醇包封率無明顯變化，芍藥苷包封率則呈先升后降的趨勢，故選取總投藥量為4.5 mg進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.4.5? 導(dǎo)脂比的考察? 以二硬脂?；字掖及?聚乙二醇2000-甘草次酸（DSPE-PEG2000-GA）為導(dǎo)向分子，固定總投藥量為4.5 mg，其他制備條件同“2.4.4”項，設(shè)計導(dǎo)脂比（即導(dǎo)向分子與脂質(zhì)量之比）為1∶80、1∶40、1∶20分別進(jìn)行考察。結(jié)果表明，導(dǎo)脂比增加（即導(dǎo)向分子相對比例增加），平均粒徑、PDI呈上升趨勢，而Zeta電位和包封率則呈下降趨勢。考慮加入過少導(dǎo)向分子將影響其靶向性，而過多導(dǎo)向分子會引起包封率下降，甚至出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，故選擇導(dǎo)脂比1∶40進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.5? Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件

2.5.1? 實驗設(shè)計及結(jié)果? 在前期單因素考察的基礎(chǔ)上，選擇影響較為顯著的脂質(zhì)量（A）、膽脂比（B）和超聲時間（C）作為考察因素，采用3因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化法按排試驗，以芍藥苷包封率（Y1）、莪術(shù)醇包封率（Y2）和總載藥量（Y3）為評價指標(biāo)，通過熵值法[18]對三指標(biāo)進(jìn)行賦權(quán)（Y1、Y2、Y3的權(quán)重系數(shù)分別為0.25、0.364、0.385）并計算綜合評分（Y）。因素水平、試驗設(shè)計及結(jié)果見表1—2。

2.5.2? 模型擬合及方差分析? 應(yīng)用Design Expert 10.0.7軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以Y對A、B、C進(jìn)行多元回歸，擬合得到二次多項式回歸方程：Y=79.79+7.12A-4.94B+2.33C+3.67AB-1.69AC+1.52BC-24.57A2-16.28B2-6.57C2。方差分析表明（表3），回歸模型P＜0.001，表明模型具有顯著性；失擬項P＞0.05，說明模型擬合良好；回歸方程擬合決定系數(shù)（r2）為0.959 6，校正決定系數(shù)（R2adj）為0.907 6，說明該模型可以解釋90.76%的響應(yīng)值的變異，且方程擬合程度較好；模型變異系數(shù)為9.44%＜10%，表明模型準(zhǔn)確度高；精密度值是有效信號與噪聲的比值，為13.588＞4，說明模型合理，表明該模型可用于設(shè)計分析。另外，脂質(zhì)量（A）、膽脂比（B）對Y均有顯著性影響（P＜0.05），各因素之間交互作用不明顯，且各因素均不是單純的一次關(guān)系，而是二次關(guān)系（A2、B2、C2的P＜0.05）。以Y為評價指標(biāo)對交互因素的響應(yīng)面等高線圖及3D效果圖見圖4。

2.5.3? 驗證試驗? 基于上述建立的二次多項式回歸方程模型，通過Design Expert 10.0.7軟件得到最優(yōu)工藝條件，即脂質(zhì)量85.19 mg，膽脂比1∶9.74，超聲時間6.4 min。在此工藝條件下平行試驗3次，結(jié)果實測值與預(yù)測值較為接近，相對偏差較小，表明模型預(yù)測性良好，優(yōu)選的GA-Cur-PF-Lips制備工藝穩(wěn)定可行（見表4）。

2.6? 質(zhì)量評價

2.6.1? 外觀及顯微形態(tài)? 按優(yōu)化工藝制得的GA-Cur-PF-Lips，外觀澄清并伴有淡藍(lán)色乳光，透射電鏡下可見脂質(zhì)體呈類球形，且飽滿圓整（見圖5）。

2.6.2? 粒徑與Zeta電位測定? 取適量脂質(zhì)體，采用Zetasizer Nano-ZS90激光粒度分析儀測定脂質(zhì)體的平均粒徑和Zeta電位，結(jié)果表明：其平均粒徑為（101.1±0.25） nm，PDI為0.170±0.011，Zeta電位為（0.333±0.060） mV。

2.6.3? 體外釋放度考察? 采用透析袋法[19]考察莪術(shù)醇-芍藥苷的混合溶液與GA-Cur-PF-Lips的體外釋放情況。取5 mL脂質(zhì)體溶液置于透析袋中，然后將透析袋置于含有100 mL釋放介質(zhì)（PBS溶液，pH=5.0）的容器內(nèi)，于37 ℃、150 r/min恒溫震蕩，分別于0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h取樣1 mL（同時補(bǔ)充等溫等量釋放介質(zhì)），測定莪術(shù)醇、芍藥苷含量，計算各時間點的累積釋放率并作圖。計算脂質(zhì)體的累積釋放度[20]并繪制釋放曲線（見圖6）。

2.6.4? 溶血性考察? 參照2020版《中華人民共和國藥典》[21]的規(guī)定，對GA-Cur-PF-Lips的溶血性進(jìn)行評估。取EP管18只，分為2組，分別為莪術(shù)醇-芍藥苷共載納米脂質(zhì)體組（Cur-PF-Lips）、GA-Cur-PF-Lips組，每組9只，對其進(jìn)行編號（各組中1～6號管為供試品管，7號管為陰性對照管，8號管為陽性對照管，9號管為供試品對照管）。參考文獻(xiàn)[22]方案依次加入樣品、2%紅細(xì)胞混懸液、生理鹽水、去離子水，混勻后，立即置于（37.0±0.5） ℃的恒溫水浴中。3 h后觀察溶血和凝聚反應(yīng)，肉眼觀察并拍照。同時取上清液于比色皿中，用紫外分光光度計于576 nm處測定其吸光度值，計算溶血率，溶血率低于5%為合格。結(jié)果表明，Cur-PF-Lips和GA-Cur-PF-Lips均未出現(xiàn)明顯的溶血及凝聚現(xiàn)象，其溶血率均小于5%，符合注射用藥要求，可以用于后續(xù)動物實驗的靜脈給藥（見表6）。溶血率計算公式如下：

3 討論

本研究以二硬脂?；字掖及?聚乙二醇2000-甘草次酸（DSPE-PEG2000-GA）為導(dǎo)向分子，利用其磷脂端（DSPE端）可嵌入到脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙分子層實現(xiàn)對莪術(shù)醇-芍藥苷共載納米脂質(zhì)體的表面修飾，其GA端可與肝癌細(xì)胞膜上高表達(dá)的GA結(jié)合位點結(jié)合而使其具有肝腫瘤靶向性，其親水性PEG2000長鏈可增加脂質(zhì)體的穩(wěn)定性與體內(nèi)循環(huán)時間，從而使莪術(shù)醇-芍藥苷能更大程度地的協(xié)同發(fā)揮抗肝癌作用。

為了評價GA-Cur-PF-Lips的藥物包封率，本研究前期曾采用葡聚糖凝膠柱色譜法、低速離心法、凝膠微柱離心法等方法分離脂質(zhì)體與游離的莪術(shù)醇、芍藥苷，但均不能將其較好地分離，而透析法簡單快捷，能同時實現(xiàn)莪術(shù)醇與芍藥苷游離藥物與脂質(zhì)體的分離，且回收率符合要求、結(jié)果可靠，因此，選擇透析法測定莪術(shù)醇與芍藥苷的包封率。

本研究較系統(tǒng)地考察了超聲時間、脂質(zhì)量、膽脂比、總投藥量和導(dǎo)脂比多個因素對脂質(zhì)體的粒徑、PDI、Zeta電位、莪術(shù)醇和芍藥苷的包封率影響，并在此基礎(chǔ)上采用Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化法確定了GA-Cur-PF-Lips的最優(yōu)工藝條件，即脂質(zhì)量為85.19 mg，膽脂比為1∶9.74，總投藥量為4.5 mg，導(dǎo)脂比為1∶40，超聲時間為6.4 min（工作2 s、停2 s）。Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化法具有具預(yù)測性好、實驗次數(shù)少、高效等優(yōu)點，并能對各個影響因素及其相互作用進(jìn)行分析[23]，故常用于制劑工藝條件的優(yōu)化。本研究前期對脂質(zhì)體制備的其他影響因素（如油水比、水相pH、水合溫度、水合時間等）也進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)其他因素對脂質(zhì)體的各項質(zhì)量指標(biāo)均無較大影響。另外，考慮到莪術(shù)醇和芍藥苷的包封率差異，將二者投料比設(shè)計為1∶2，可使脂質(zhì)體包載的莪術(shù)醇-芍藥苷的配比接近1∶1，從而有助于二者發(fā)揮協(xié)同作用。

本研究制備的GA-Cur-PF-Lips具有粒徑小、分布均勻、外觀圓整等特點，較小粒徑的脂質(zhì)體有更快、更強(qiáng)的腫瘤分布[24]；PDI小于0.3說明脂質(zhì)體的粒徑分布均勻且狹窄，有助于提高其穩(wěn)定性。體外釋放實驗顯示GA-Cur-PF-Lips具有緩釋特性，這將有助于延長藥物成分在體內(nèi)的作用時間；溶血性實驗表明GA-Cur-PF-Lips與Cur-PF-Lips均無明顯的溶血與凝聚作用，故可注射給藥。綜上所述，本研究可為GA修飾的莪術(shù)醇-芍藥苷共載納米脂質(zhì)體的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)，同時對于研發(fā)低毒高效的抗肝癌新藥也具有一定的意義。

參考文獻(xiàn)

[1] YANG J Q， PAN G D， GUAN L J， et al. The burden of primary liver cancer caused by specific etiologies from 1990 to 2019 at the global， regional， and national levels[J]. Cancer Medicine， 2022， 11（5）： 1357-1370.

[2] LIU S Y， YAO M Z， LI X L， et al. Effects of circFOXO3 on the proliferation and invasion of liver cancer cells by regulating PI3K/Akt pathway[J]. Contrast Media & Molecular Imaging， 2022， 2022： 2109908.

[3] 李文杰. 莪術(shù)醇肝靶向脂質(zhì)體的制備及其抗腫瘤研究[D]. 廣州： 廣州中醫(yī)藥大學(xué)， 2014.

[4] WANG X Z， XIA L， ZHANG X Y， et al. The multifaceted mechanisms of Paeoniflorin in the treatment of tumors： State-of-the-Art[J]. Biomedecine & Pharmacotherapie， 2022， 149： 112800.

[5] 黃嵐珍， 楊飛城， 陽? 晶， 等. 莪術(shù)醇誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞衰老及其機(jī)制研究[J]. 廣西植物， 2018， 38（7）： 894-902.

[6] 聶添情， 孟祥偉， 應(yīng)宇晨， 等. 莪術(shù)醇及其衍生物的抗腫瘤活性研究進(jìn)展[J]. 中草藥， 2020， 51（21）： 5613-5621.

[7] ZHANG R Z， ZHONG L， SUN K W， et al. A study on curcumol influencing proliferation and apoptosis of hepatocellular carcinoma cells through DJ-1/PTEN/PI3K/AKT pathway[J]. BioMed Research International， 2022， 2022： 9912776.

[8] ZUO H X， JIN Y， WANG Z， et al. Curcumol inhibits the expression of programmed cell death-ligand 1 through crosstalk between hypoxia-inducible factor-1α and STAT3 （T705） signaling pathways in hepatic cancer[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2020， 257： 112835.

[9] 王昌高， 韋? 紅， 王裕宣， 等. 芍藥苷對肝癌HepG2細(xì)胞侵襲和遷移作用研究[J]. 中國臨床藥理學(xué)雜志， 2019， 35（15）： 1625-1628.

[10] 萬南燕， 蔣翠花， 高? 萌， 等. 芍藥苷調(diào)控JAK/STAT3通路干預(yù)HepG2細(xì)胞PD-L1表達(dá)的研究[J]. 中國藥科大學(xué)學(xué)報， 2019， 50（2）： 213-221.

[11] ZHOU Y， LIU X， GAO Y H， et al. Paeoniflorin affects hepatocellular carcinoma progression by inhibiting Wnt/β-catenin pathway through downregulation of 5-HT1D[J]. Current Pharmaceutical Biotechnology， 2021， 22（9）： 1246-1253.

[12] LIU H， ZANG L L， ZHAO J， et al. Paeoniflorin inhibits cell viability and invasion of liver cancer cells via inhibition of Skp2[J]. Oncology Letters， 2020， 19（4）： 3165-3172.

[13] 侯? 婷， 陳? 軍， 蔡寶昌， 等. 硫酸銨梯度法制備脂質(zhì)體的研究進(jìn)展[J]. 中國藥師， 2009， 12（12）： 1723-1725.

[14] DE LEO V， MAURELLI A M， GIOTTA L， et al. Liposomes containing nanoparticles： Preparation and applications[J]. Colloids and Surfaces B， Biointerfaces， 2022， 218： 112737.

[15] SALVI M， FIORE C， ARMANINI D， et al. Glycyrrhetinic acid-induced permeability transition in rat liver mitochondria[J]. Biochemical Pharmacology， 2003， 66（12）： 2375-2379.

[16] DINH C T， VU H T， PHAN Q T H， et al. Synthesis of glycyrrhetinic acid-modified liposomes to deliver Murrayafoline A for treatment of hepatocellular carcinoma[J]. Journal of Materials Science Materials in Medicine， 2022， 33（10）： 72.

[17] 席? 寧， 王永輝， 王麗森， 等. 線粒體靶向性的姜黃素TPP-PEG-PLGA脂質(zhì)體的制備及促肝癌細(xì)胞凋亡研究[J]. 中國藥學(xué)雜志， 2022， 57（17）： 1438-1446.

[18] 麻學(xué)鋒， 呂逸翔. 張家界城鎮(zhèn)居民幸福水平對旅游城鎮(zhèn)化集聚的響應(yīng)識別及測度[J]. 自然資源學(xué)報， 2020， 35（7）： 1647-1658.

[19] 張? 丹， 廖? 芳， 周? 潔， 等. Box-Behnken Design-響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化芍藥總苷脂質(zhì)體的制備工藝及體外釋放研究[J]. 中草藥， 2015， 46（3）： 359-364.

[20] 馮宇飛， 常書源， 秦國昭， 等. 星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化pH值響應(yīng)及線粒體靶向雙功能金絲桃苷脂質(zhì)體的處方及其體外評價[J]. 中草藥， 2020， 51（23）： 5934-5942.

[21] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[M]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2020： 516.

[22] 吳斯宇， 曾盈蓉， 唐? 聘， 等. RGD環(huán)肽修飾的姜黃素/黃芩苷靶向共遞送納米脂質(zhì)體的制備工藝優(yōu)化及表征[J]. 中草藥， 2021， 52（22）： 6834-6844.

[23] 彭曉霞， 路莎莎. 響應(yīng)面優(yōu)化法在中藥研究中的應(yīng)用和發(fā)展[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志， 2011， 17（19）： 296-299.

[24] MA S Y， LI M Y， LIU N， et al. Vincristine liposomes with smaller particle size have stronger diffusion ability in tumor and improve tumor accumulation of vincristine significantly[J]. Oncotarget， 2017， 8（50）： 87276-87291.