牛呼吸道疾病病原采樣方法概述

龐 敏,張力本,坤清芳,肖 霞,董彥強(qiáng)

阿壩職業(yè)學(xué)院,四川 茂縣 623200

0 引言

牛呼吸道疾病(bovine respiratory disease,BRD),又稱牛呼吸道疾病綜合征(bovine respiratory disease complex,BRDC),是牛場(chǎng)中最常見的一類疫病,主要由細(xì)菌、支原體、病毒單獨(dú)或混合感染引起的牛肺炎、支氣管炎等疾病的統(tǒng)稱[1]。全球約有46%的犢牛患有BRD,患病奶牛的產(chǎn)奶量、公牛的繁殖力、育肥牛的增重以及牛的免疫能力均會(huì)降低,嚴(yán)重影響了養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展[2]。與該病發(fā)生常見的病原有:睡眠嗜組織菌(Histophilussomni,Hs)、溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica,Mh)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,Pm)、牛支原體(Mycoplasmabovis,Mb)、牛呼吸道合胞病毒(bovinerespiratorysyncytialvirus,BRSV)、牛冠狀病毒(bovinecoronavirus,BCoV)、牛病毒性腹瀉病毒(bovineviraldiarrheavirus,BVDV)、牛α皰疹病毒1型(bovinealphaherpesvirus1,BoHV1)、牛副流感病毒3型(bovineparainfluenzavirus3,BPIV-3)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectiousbovinerhinotracheitisvirus,IBRV)[3]。此外,也與飼養(yǎng)管理水平和環(huán)境因素有關(guān)[4]。導(dǎo)致BRD流行的誘因包括:長(zhǎng)途運(yùn)輸、合群飼養(yǎng)前沒有時(shí)間適應(yīng)新環(huán)境、未注射疫苗、營(yíng)養(yǎng)、溫度等不利條件均可能導(dǎo)致免疫抑制進(jìn)而增加牛對(duì)呼吸系統(tǒng)病原體的敏感度。這些病原體可單一感染或在混合感染中協(xié)同作用,使疾病更加嚴(yán)重[5]。實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果的精準(zhǔn)性依賴于正確的采樣,一次性有效的采樣,不僅可以準(zhǔn)確檢測(cè)BRD病原,也可以減少重復(fù)采樣帶來(lái)的應(yīng)激反應(yīng)。

1 采樣動(dòng)物的選擇

在疾病發(fā)生的前期,無(wú)抗菌素治療史,也沒有表現(xiàn)出明顯的呼吸道癥狀的動(dòng)物是首選。在疾病的急性期取樣,檢測(cè)到病毒成分的幾率更高。此外,應(yīng)避免對(duì)嚴(yán)重呼吸窘迫的動(dòng)物取樣,可以降低疾病加重和死亡的風(fēng)險(xiǎn)。需要注意的是樣本量應(yīng)適宜,采樣的動(dòng)物應(yīng)具有群體代表性,使檢測(cè)結(jié)果能代表群體發(fā)病。

2 牛呼吸道疾病病原采樣方法

2.1 鼻拭子采樣

鼻拭子采樣(nasal swabs,NS),主要取樣自鼻黏膜,保定動(dòng)物頭部,用一次性紙巾把牛的鼻孔擦干凈,將20 cm長(zhǎng)的棉簽插入鼻腔約10 cm處,拭子在鼻黏膜上旋轉(zhuǎn)以收集鼻分泌物樣本。在插入和取出棉簽時(shí),需要防止棉簽被鼻孔上的灰塵等污染。除長(zhǎng)棉簽外,還可采用刷子拭子,刷子拭子會(huì)采集更密集的黏膜,可能具有更高的檢出率,但刷子拭子易損傷黏膜,采集的樣本可能會(huì)被血液污染。

2.2 深部鼻咽拭子

深部鼻咽拭子(deep nasopharyngeal swabs,DNSs)取樣自鼻咽的呼吸道和相關(guān)淋巴上皮,用一次性紙巾把牛的鼻孔擦干凈,將59 cm的棉簽插入鼻腔約50 cm處進(jìn)行取樣,如圖1(a)所示[6]。然而,DNSs的最大問題是采集了大量的多微生物樣本,導(dǎo)致其他無(wú)關(guān)病原影響B(tài)RD的診斷,從而嚴(yán)重影響臨床解釋結(jié)果。

圖1 牛呼吸道取樣方法

2.3 防護(hù)套鼻咽拭子

防護(hù)套鼻咽拭子(guarded nasopharyngeal swab,NPS)在操作時(shí),動(dòng)物站立保定,用一次性紙巾將牛的鼻孔擦干凈,然后將59 cm的帶聚酯防護(hù)套的棉簽由鼻腔推進(jìn),直到剩下的長(zhǎng)度至眼內(nèi)眥頭端約2 cm的位置。取樣時(shí),棉拭子向前推進(jìn)約4 cm,在鼻咽部旋轉(zhuǎn),取樣完成后將棉簽收回聚酯防護(hù)套內(nèi),再取出。NPS與DNSs相比,采集的樣本免受鼻腔微生物的污染。

2.4 經(jīng)氣管沖洗或經(jīng)氣管抽吸

為了克服鼻拭子采樣污染的問題,經(jīng)氣管沖洗或經(jīng)氣管抽吸技術(shù)(transtracheal wash or transtracheal aspirate,TTW/TTA)被應(yīng)用。保定牛只,對(duì)操作部位皮膚進(jìn)行消毒后,通過(guò)采樣針或?qū)Ч苓M(jìn)行氣管穿孔,如圖1(b)所示。經(jīng)氣管抽吸呼吸道的黏液,或采用生理鹽水液體灌注、經(jīng)氣管沖洗呼吸道進(jìn)行采樣。由于支氣管分支是整個(gè)肺的黏液纖毛系統(tǒng)流出匯合的地方,因此,TTW、TTA取樣對(duì)整個(gè)肺具有代表性。

2.5 內(nèi)窺鏡支氣管肺泡灌洗和非內(nèi)窺鏡支氣管肺泡灌洗

在內(nèi)窺鏡支氣管肺泡灌洗(endoscopic bronchoalveolar lavage,BAL)操作中,將1根BAL導(dǎo)管或柔性內(nèi)窺鏡通過(guò)鼻子和氣管進(jìn)入下氣道,直到其進(jìn)入較大(或較小,取決于導(dǎo)管直徑)的支氣管。然后注射一定量(犢牛通常為60 mL)的無(wú)菌生理鹽水,并立即抽吸。如有必要,可進(jìn)行第2次或第3次注射抽吸。但是該方法成本較高,且耗時(shí)較長(zhǎng),因此不適合小型養(yǎng)殖場(chǎng)和多動(dòng)物采樣。

非內(nèi)窺鏡支氣管肺泡灌洗技術(shù)(nonendoscopic bronchoalveolar lavage,nBAL)可以解決內(nèi)鏡下BAL成本高的問題。在nBAL操作中,將犢牛頭部進(jìn)行固定,鼻子盡可能朝上,以便于將導(dǎo)管引入氣管,或者將牛的頭部置于水平位置,并在吸氣時(shí)通過(guò)鼻、咽喉和氣管引入BAL導(dǎo)管,到達(dá)大支氣管的楔形位置,并注射一定量(30～250 mL)的無(wú)菌生理鹽水,輕輕地抽吸,如圖1(c)所示。在80%的動(dòng)物中,nBAL取樣可以在幾分鐘內(nèi)完成[6]。

2.6 病死牛肺臟組織

病死牛肺臟組織取樣自BRD病死牛剖檢后肺臟病變部位,由于肺臟組織是在牛死亡后剖檢才能檢測(cè),所以對(duì)于預(yù)防性檢測(cè)病原體意義不大。

2.7 血清樣本

血清樣本采自尾靜脈穿刺采集全血,然后收集血清進(jìn)行檢測(cè)。

2.8 其他采樣方法

其他采樣方法包括采集患有呼吸道癥狀的牛的鼻液、眼分泌物、氣管病變部位、采集脾臟等實(shí)質(zhì)器官或出現(xiàn)相應(yīng)臨床癥狀的排泄物、陰道分泌物、牛乳等。

3 不同采樣方法優(yōu)缺點(diǎn)

NS主要取樣自鼻黏膜,操作方便快捷,對(duì)操作人員技術(shù)要求低,對(duì)牛只刺激反應(yīng)小或幾乎無(wú)不良反應(yīng)。但采樣結(jié)果易受鼻腔共生微生物的影響,且只能對(duì)上呼吸道取樣。DNSs取樣自鼻咽的呼吸道和相關(guān)淋巴上皮,從鼻腔伸入取樣時(shí)易被鼻腔微生物污染,可通過(guò)擦拭鼻孔(用一次性紙巾或含酒精的紗布)或使用帶聚酯防護(hù)套的NPS來(lái)減少污染。雖然DNSs和NPS不直接采集下呼吸道樣本,但對(duì)于大多數(shù)病原體,DNSs和NPS結(jié)果與TTW或BAL結(jié)果之間存在關(guān)聯(lián)性[7]。此外,DNSs和NPS對(duì)牛只的并發(fā)癥較少,包括鼻出血和棉簽軸斷裂,若棉簽軸斷裂,動(dòng)物可以通過(guò)打噴嚏或吞咽將斷裂的棉簽進(jìn)行排出。BAL或nBAL可獲得具有代表性的下呼吸道樣本,但采集的樣本也可能包含上呼吸道共生細(xì)菌。此外,由于BAL僅對(duì)楔形管遠(yuǎn)端的支氣管肺泡單位進(jìn)行采樣,因此有可能漏掉在整個(gè)肺中分布不均勻的病原體。BAL或nBAL對(duì)操作人員技術(shù)要求高,BAL需要專門的儀器,價(jià)格昂貴,不適合小型養(yǎng)殖場(chǎng)。nBAL采樣大約需要耗時(shí)10 min/只,對(duì)于樣本數(shù)較大時(shí),花費(fèi)時(shí)間成本高。且采樣過(guò)程中可能發(fā)生鼻出血、肺內(nèi)出血、氣道穿孔、灌洗液引起的呼吸窘迫等并發(fā)癥。TTW或TTA允許在繞過(guò)鼻咽正常菌群的情況下從下呼吸道采集樣本,雖然克服了鼻咽的污染,但該過(guò)程是侵入性的且耗時(shí)較長(zhǎng)10 min/只,對(duì)操作人員技術(shù)要求高,且易發(fā)生皮下氣腫、穿刺孔感染、局部出血、穿刺導(dǎo)管斷裂在氣管內(nèi)以及灌洗液抽吸不全所引起的呼吸困難等并發(fā)癥。牛肺臟組織采樣自病死牛剖檢后肺臟病變部位,但需要在牛只死亡后才能采樣檢測(cè),對(duì)BRD的預(yù)防意義不大。血液樣本采自牛只靜脈血,操作簡(jiǎn)單,但對(duì)已接種疫苗的動(dòng)物或某些攜帶母源抗體的犢牛來(lái)說(shuō),存在假陽(yáng)性的情況,使檢測(cè)結(jié)果難以解釋。相比之下,NS更容易收集且操作方便,節(jié)省人力物力資源。通過(guò)一次性紙巾擦拭鼻腔可降低微生物污染。采樣部分優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比如表1所示。

表1 牛呼吸道疾病不同采樣部位概述及優(yōu)缺點(diǎn)

4 結(jié)束語(yǔ)

任何診斷工作的真正意義在于將檢測(cè)結(jié)果從采樣動(dòng)物外推到整個(gè)群體,有助于確定病因,盡早給出預(yù)防和治療策略,降低BRD導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失。快速準(zhǔn)確地診斷出導(dǎo)致BRD發(fā)生的病原依賴于正確的采樣部位。