魚油多不飽和脂肪酸的制備及降脂功能研究

張延秀，張建全，臧秀瑞，馬良，曲亭和，李德虎

山東禹王制藥有限公司（禹城 251200）

高脂血癥是指體內脂類代謝紊亂導致血脂水平增高的一種病癥。其與心肌梗死、中風、脂肪肝、糖尿病等疾病的發(fā)生關系密切，是引發(fā)腦梗死的主要潛在因素，是引起動脈粥樣硬化和冠心病發(fā)生的重要危險因素之一，同時還會引起糖尿病等疾病[1-4]。高脂血癥具體表現為脂肪代謝或轉運異常，血清中總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）含量過高，而高密度脂蛋白（HDL）含量降低[5]。研究表明膳食脂肪酸與高脂血癥的發(fā)生關系密切，多不飽和脂肪酸具有明顯的降血脂作用[6]。二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）是重要的多不飽和脂肪酸，是人體和動物不能合成，由食物提供的一類必需脂肪酸[7]。魚油中富含EPA、DHA等ω-3多不飽和脂肪酸[8]，具有降低血液中TC、TG、LDL-C，升高HDL-C等重要作用[9]，還可以改善血液微循環(huán)，降低血液黏稠度，在一定程度上極大地緩解和治療高脂血癥[10]。

高脂血癥是動脈粥樣硬化和冠心病發(fā)生、發(fā)展的獨立危險因素。血脂的降低被證實可以改善內皮功能障礙、減慢粥樣硬化斑塊的進展、降低心肌缺血和急性冠脈綜合征的發(fā)病率及致死率。因此，有效控制血脂已成為醫(yī)學界防治心腦血管疾病的主要方法之一。試驗以山東禹王制藥有限公司生產的魚油軟膠囊為樣品，委托山東大學齊魯醫(yī)院針對該產品對高脂血癥人群降脂功能有效性和安全性進行臨床驗證研究。

1 材料與方法

1.1 材料

魚油（市售）；濃硫酸、無水乙醇等（均為國產分析純）。

魚油軟膠囊（山東禹王制藥有限公司），成分含量為DHA 30~45 g/100 g、EPA 25~40 g/100 g。產品規(guī)格：0.35 g/粒。食用方法：每日3次，每次3粒。

1.2 方法

1.2.1 魚油多不飽和脂肪酸的制備

在反應釜中加入魚油、無水乙醇和濃硫酸，設定溫度和反應時間，開啟攪拌。反應停止后，取上層魚油進行分析。

1.2.2 魚油軟膠囊制備工藝

將反應得到的魚油按下述工藝制備得到軟膠囊。

化膠、配料→壓丸→定型→洗丸→干燥→選丸→包裝

1.3 降脂項目內容

1.3.1 療效觀察項目

1.3.1.1 觀察對象

高脂血癥人群。

1.3.1.2 觀察項目

評估指標：年齡、性別、血壓、身高、體重、BMI、肝功系列、腎功三項、血脂四項、載脂蛋白（ApoE）、空腹血糖、血常規(guī)、尿常規(guī)、肝臟B超、脂肪肝纖維化檢測、心電圖。

1.3.2 安全性觀察項目

不良反應指標：觀察項目評估指標及出現的其他不良反應情況，并記錄發(fā)生日期、程度及處理方法、變化過程等，判斷與該產品是否有因果關系。

1.4 試驗方法

選取山東大學齊魯醫(yī)院健康管理中心高脂血癥患者，納入標準：（1）年齡20~80歲；（2）空腹血清總膽固醇＞5.72 mmol/L或甘油三酯＞1.70 mmol/L或高密度脂蛋白＜0.91 mmol/L。排除標準：（1）3個月內發(fā)生急性冠脈綜合征、腦血管事件，血壓未控制者（收縮壓≥160 mmHg和或舒張壓≥100 mmHg）；（2）出血性疾病患者及出血傾向者；（3）嚴重肝腎功能損害、嚴重胃腸道疾病者；（4）合并惡性腫瘤，急慢性感染需要治療者；（5）懷孕或準備懷孕者。

研究人群干預方法：（1）魚油軟膠囊使用方法，每日3次，每次3粒；（2）飲食干預，飲食堅持“四低一高”原則，即“低熱量、低膽固醇、低脂肪、低糖，高纖維”；（3）生活方式干預，運動鍛煉、戒煙。研究對象入選前、3個月干預后，詳細檢查年齡、性別、血壓、身高、體重、BMI、肝功系列、腎功3項、血脂4項、載脂蛋白（ApoE）、空腹血糖、血常規(guī)、尿常規(guī)、肝臟B超、脂肪肝纖維化檢測、心電圖等項目，在干預前、干預3個月后分別檢測以上項目。評價魚油軟膠囊對高脂血癥人群降脂功能各項指標的統(tǒng)計學意義。根據統(tǒng)計學分析結果，判定魚油軟膠囊降脂效果。

1.5 統(tǒng)計學處理

數據分析采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學處理，設定P＜0.05作為差異有顯著性。

2 結果與分析

2.1 酸催化制備魚油多不飽和脂肪酸

試驗優(yōu)化酸催化魚油與無水乙醇制備多不飽和脂肪酸的工藝過程，包括反應溫度、反應時間、無水乙醇添加量和濃硫酸添加量。

2.1.1 反應溫度對魚油多不飽和脂肪酸得率的影響

選取反應溫度65，70，75，80，85和90 ℃，反應時間8 h，無水乙醇添加量45%，濃硫酸添加量0.8%，考察反應溫度對魚油多不飽和脂肪酸得率的影響。

由圖1可以看出，隨著反應溫度升高，魚油多不飽和脂肪酸得率提高，超過80 ℃時，得率提高不明顯，說明該體系中反應已達平衡。

圖1 反應溫度對魚油多不飽和脂肪酸得率的影響

2.1.2 反應時間對魚油多不飽和脂肪酸得率的影響

選取反應時間6.5，7.0，7.5，8.0，8.5和9.0 h，反應溫度80 ℃，無水乙醇添加量45%，濃硫酸添加量0.8%，考察反應時間對魚油多不飽和脂肪酸得率的影響。

由圖2可以看出，隨著反應時間的延長，魚油多不飽和脂肪酸的得率提高，超過8.0 h時，得率未見明顯提高，說明該體系中反應已達平衡。

圖2 反應時間對魚油多不飽和脂肪酸得率的影響

2.1.3 無水乙醇添加量對魚油多不飽和脂肪酸得率的影響

選取無水乙醇添加量30%，35%，40%，45%和50%，反應溫度80 ℃，反應時間8 h，濃硫酸添加量0.8%，考察無水乙醇添加量對魚油多不飽和脂肪酸得率的影響。

由圖3可以看出，無水乙醇添加量為45%和50%時，魚油多不飽和脂肪酸得率基本相同，因此選擇無水乙醇添加量45%。

圖3 無水乙醇添加量對魚油多不飽和脂肪酸得率的影響

2.1.4 濃硫酸添加量對魚油多不飽和脂肪酸得率的影響

選取濃硫酸添加量0.2%，0.4%，0.6%，0.8%和1.0%，反應溫度80 ℃，反應時間8 h，無水乙醇添加量45%，考察濃硫酸添加量對魚油多不飽和脂肪酸得率的影響。

由圖4可以看出，濃硫酸添加量為0.8%和1.0%時，魚油多不飽和脂肪酸得率基本一致，因此選擇濃硫酸添加量0.8%。

圖4 濃硫酸添加量對魚油多不飽和脂肪酸得率的影響

2.1.5 正交試驗

在單因素試驗基礎上，選定四因素三水平作工藝優(yōu)化的正交試驗，見表1。極差數據分析表明：影響多不飽和脂肪酸得率的主次關系依次是反應溫度、無水乙醇添加量、反應時間、濃硫酸添加量。結果表明：反應溫度80 ℃、反應時間8.5 h、無水乙醇添加量50%、濃硫酸添加量0.8%時，多不飽和脂肪酸得率最高。

表1 正交試驗結果

表2 魚油軟膠囊對高脂血癥患者總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的影響單位：mmol/L

2.2 安全性觀察

2.2.1 一般性情況

共納入82位高脂血癥體檢者，1例發(fā)生輕微胃腸道反應、9例失訪、1例懷孕脫組，剩余71例，其中年齡分布在34~73歲，男性49人（69%），女22人（31%）。

2.2.2 BMI、心電圖、肝臟B超、脂肪肝纖維檢測

BMI改善不顯著，心電圖無明顯變化，肝臟超聲檢查提示干預后脂肪肝有輕微改善。

2.2.3 肝腎功能、血糖、血壓

研究數據顯示服用魚油軟膠囊及生活方式干預3個月后肝腎功能、血糖、血壓未見明顯異常。

2.3 功效觀察

數據顯示服用魚油軟膠囊及生活方式干預3個月后血脂有明顯變化。與干預前對比，干預后總膽固醇極顯著降低、甘油三酯顯著降低，干預前后高密度脂蛋白和低密度脂蛋白未見明顯差異。

3 結論

試驗采用酸催化制備魚油多不飽和脂肟酸，分別探討反應溫度、無水乙醇添加量、反應時間、濃硫酸添加量對魚油多不飽和脂肪酸得率的影響，在單因素試驗基礎上，通過正交試驗得出酸催化制備魚油多不飽和脂肪酸的最佳工藝條件：反應溫度80 ℃、反應時間8.5 h、無水乙醇添加量50%、濃硫酸添加量0.8%。魚油軟膠囊是用于調節(jié)血脂、預防高血脂癥和動脈粥樣硬化的天然海洋營養(yǎng)補品，其功效成分3A（即DHA、EPA、DPA）皆為ω-3型多烯脂肪酸乙酯（PUFA），是日常膳食中難以攝取的營養(yǎng)物質。EPA和DHA的降脂作用機理是：抑制肝內脂肪酸和甘油三酯的合成、抑制極低密度脂蛋白（VLDL）的合成、促進脂肪的氧化、加速VLDL膽固醇的清出[11]。經過進一步臨床驗證證實該產品對于高脂血癥患者有明顯改善作用，尚未發(fā)現明顯不良反應。