PEX 基因轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定

謝 炯，戚 繼

（北京豐臺(tái)醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100000）

膠質(zhì)瘤（glioma）是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病率最高、預(yù)后不佳的原發(fā)性腦腫瘤，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）是膠質(zhì)瘤中惡性程度最高的一種，即使采用手術(shù)及同步放化療的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，患者的一般生存期僅為14.4 個(gè)月左右[1]。因血腦屏障的存在，很多藥物無法準(zhǔn)確到達(dá)腫瘤病灶，但具有跨血腦屏障特性的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，HuMSCs）可以作為細(xì)胞載體有效地將所需藥物及目的基因送到靶向部位[2]，進(jìn)而提高膠質(zhì)瘤的治療效果。PEX 基因能夠干預(yù)惡性膠質(zhì)瘤的侵襲行為，在膠質(zhì)瘤基因治療中具有很好的臨床應(yīng)用前景。本研究主要探討PEX 基因修飾HuMSCs 的可行性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 HuMSCs（天津和澤生物科技有限責(zé)任公司提供），U87 膠質(zhì)瘤細(xì)胞（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心），DMEM/F-12 培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO 公司），F(xiàn)BS（以色列BI 公司），胰蛋白酶（美國(guó)AMRESCO 公司），EDTA（美國(guó)Sigma 公司），青/鏈霉素霉素溶液（Solarvio 公司），質(zhì)粒pcDNA3.1（+）（Invitrogen），JM109 高效率感受態(tài)細(xì)胞、pGEM?-T Easy 載體、RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、小提質(zhì)粒試劑盒、G418、轉(zhuǎn)染試劑FuGENE?HD、HEPES（Promega 公司），Xho Ⅰ、BamHⅠ、T4 DNA 連接試劑盒（日本TaKaRa 公司），Universal DNA Purifieation Kit DNA 純化回收試劑盒、大提質(zhì)粒試劑盒（北京艾德萊公司），F(xiàn)ITC 標(biāo)記小鼠抗大鼠CD19、CD34、CD90、CD45、CD105 單克隆抗體（BD Biosciences 公司），引物由Invitrogen 公司合成，其它常規(guī)試劑為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 HuMSCs 培養(yǎng)鑒定與U87 膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng) 將HuMSCs 和U87 細(xì)胞分別接種于面積為75 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，置入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h 換一次培養(yǎng)基。當(dāng)有約90%左右的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)時(shí)傳代培養(yǎng)，傳代時(shí)向培養(yǎng)瓶中加入0.25%的胰蛋白酶消化1.5 min 后棄去消化液，加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液終止消化，吹打沖洗成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液置入15 ml 離心管中于室溫下，1500 rpm/min離心5 min；棄去上清液，加入2 ml 全培養(yǎng)反復(fù)吹打沖洗成細(xì)胞懸液。以1∶3 傳代接種到75 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，后項(xiàng)培養(yǎng)瓶中加入全培養(yǎng)基約至10 ml，置入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取傳代至第3 代HuMSCs，待細(xì)胞長(zhǎng)滿80%～90%時(shí)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞CD11b、CD19、CD34、CD73、CD90、CD45、CD105 表面抗原的表達(dá)。

1.3 PEX 真核表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定 參照GenBank中MMP-2 堿基序列（NM-031054），設(shè)計(jì)PEX 正反引物：正向引：5'-CCGCTCGAGAGATCTGCAAGCAAGACAT-3'，反向引物：5'-CGGGATCCGCAGCCCAGCCAGTCCGATT-3'，產(chǎn)物為582 bp。分別加入XhoⅠ、BamHⅠ酶切位點(diǎn)（引物中劃線部分）。采用Promega 公司的RNA 提取試劑盒從U87 膠質(zhì)瘤細(xì)胞中提取總RAN，按RT-PCR 試劑盒操作步驟擴(kuò)增目的基因，退火溫度為60 ℃，PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，與單克隆pGEM?-T Easy 載體連接，轉(zhuǎn)化JM109 高效率感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)LB/Amp 培養(yǎng)基和藍(lán)白（IPTG/X-Gal）篩選挑取陽性克隆進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。以菌液為模板，按RT-PCR 體外獲取擴(kuò)增PEX 基因。目的基因與質(zhì)粒載體分別采用XhoⅠ、BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切后膠回收獲得載體片段和目的基因片段，然后連接、轉(zhuǎn)化，小抽質(zhì)粒，酶切鑒定，并送菌液測(cè)序。

1.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HuMSCs 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3 代HuMSCs 接種于24 孔培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合約80%時(shí)，用轉(zhuǎn)染試劑Fu－GENE?HD 和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HuMSCs 細(xì)胞，具體步驟按照FuGENE?HD 轉(zhuǎn)染步驟操作。設(shè)立未轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h 后，采用G418篩選（400 ng/μl），10 d 后以200 ng/μl 篩選，4 周后將篩選出的細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增。以β-actin 為內(nèi)參，RTPCR 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組PEX 基因表達(dá)表達(dá)的差異性。設(shè)計(jì)GAPDH 正反引物：正向引物：AGAAGGCTGGGGCTCATTTG；反向引物：AGGGGCCATCCACAGTCTTC；產(chǎn)物為258 bp。

2 結(jié)果

2.1 HuMSCs 的培養(yǎng)及鑒定 原代培養(yǎng)的HuMSCs 細(xì)胞呈長(zhǎng)條狀或長(zhǎng)梭狀，細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加逐漸變長(zhǎng)變大并貼壁完全，形態(tài)學(xué)變?yōu)楸馄綘?，于傳代后? 天左右即可完全融合，呈放射狀或者螺旋狀生長(zhǎng)（圖1）。

圖1 HuMSCs 細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)（螺旋狀、發(fā)散型生長(zhǎng)）（×40）

通過流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)分別檢測(cè)P5 代HuCMSCs，表面分子標(biāo)志物結(jié)果顯示各代均表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志CD73、CD90 和CD105，而不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志CD11b、CD19、CD34、CD45 和組織相容抗原HLA-DR，見圖2。

圖2 原代培養(yǎng)的HuMSCs 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

2.2 目的基因培養(yǎng)及重組質(zhì)粒載體構(gòu)建 RT-PCR 檢測(cè)顯示，目的基因PEX 位于DNA Maker 500～750 bp 的特異性條帶（圖3），說明成功培養(yǎng)PEX；同時(shí)，抽提質(zhì)粒后雙酶切鑒定顯示，重組質(zhì)粒PEX-pcDNA3.1（+）位于DNA Maker 5000 bp 的特異性條帶，且重組質(zhì)粒PEX-pcDNA3.1（+）雙酶切后位于DNA Maker 500～750 bp 和5000 bp 兩條特異性條帶（圖4），說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，且成功轉(zhuǎn)染HuMSCs；留取菌液測(cè)序，結(jié)果證實(shí)證實(shí)質(zhì)粒載體PEX-pcDNA3.1（+）構(gòu)建成功，見圖5。

圖3 目的基因PEX 的擴(kuò)增

圖4 抽提質(zhì)粒后雙酶切鑒定

圖5 測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果

2.3 重組質(zhì)粒PEX-pcDNA3.1（+）表達(dá)情況 RTPCR 檢測(cè)驗(yàn)證了重組質(zhì)粒PEX-pcDNA3.1（+）成功轉(zhuǎn)染HuMSCs，且在HuMSCs 中高表達(dá)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HuMSCs 及經(jīng)G418 篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)PEX 基因的HuMSCs，其于紫外燈下可見分別位于DNA Maker 250～500 bp 和500～700 bp 產(chǎn)生兩條特異性條帶，與預(yù)期的GAPDH 及PEX 產(chǎn)物片段大小相符。轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞的GAPDH 產(chǎn)物亮度相仿，而轉(zhuǎn)染組細(xì)胞PEX 產(chǎn)物亮度較對(duì)照組明顯增強(qiáng)（圖6）。以G418 篩選（400 ng/μl），10 d 后以200 ng/μl 篩選，4 周后篩選出的細(xì)胞可穩(wěn)定生長(zhǎng)。

圖6 RT-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組HuMSCs 中PEX 基因的表達(dá)

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)[3，4]，幾乎所有MMPs 在其羧基末端均含有1 個(gè)血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域，通過C 端和αvβ3 關(guān)聯(lián)，激活其催化活性，產(chǎn)生C 端類血紅素結(jié)合片斷PEX。PEX 可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因2（FGF-2）、整合素αvβ3 以及玻連蛋白等的粘附，從而起到抑制膠質(zhì)瘤和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，進(jìn)而達(dá)到抑制膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)和復(fù)發(fā)。有研究表明[5]，PEX 對(duì)體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖有顯著抑制作用。因此，PEX 在針對(duì)人腦膠質(zhì)瘤侵襲性的治療上具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值，但如何使PEX基因精確且有效的發(fā)揮抑瘤作用值得臨床進(jìn)一步研究和探索。

基因療法作為治療膠質(zhì)瘤的一種新方式，如何尋找一種特異而有效性的靶向腫瘤細(xì)胞的載體，且可攜帶抗癌基因來跟蹤并有效抑制腫瘤細(xì)胞有待探索。研究發(fā)現(xiàn)[6-8]，MSC 本身具有易于體外擴(kuò)增、強(qiáng)大的遷移能力和趨瘤性、低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)作用，因此移植細(xì)胞的免疫排斥輕微，從而極大地降低了移植風(fēng)險(xiǎn)，其作為靶細(xì)胞基因載體在治療疾病中的作用越來越重要，并已成為最具臨床前景的細(xì)胞治療產(chǎn)品。Deng L 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL 的基因修飾MSCs 有抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的特性。羅曉紅等[10]成功構(gòu)建了攜帶HGF 基因的BMSC，不僅可以穩(wěn)定表達(dá)并可增強(qiáng)MSCs 增殖及遷移能力。李千會(huì)等[11]驗(yàn)證了VEGF 可穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BMSCs 內(nèi)并可穩(wěn)定表達(dá)發(fā)揮作用。

BMSCs 雖然具有高度增殖能力及多向分化潛能，但在實(shí)際應(yīng)用中，BMSCs 含量易受年齡因素影響，對(duì)供者有一定的創(chuàng)傷性，加之BMSCs 分離純化的難度增加、病毒感染率高，限制了其在臨床的應(yīng)用。相比之下，HuMSCs 的來源廣泛、成本低、取材方便、培養(yǎng)成功率較高、增殖能力強(qiáng)，并具有免疫原性低、免疫調(diào)節(jié)特性強(qiáng)的特點(diǎn)，使其成為一種潛在的、可大規(guī)模生產(chǎn)的神經(jīng)損傷“修復(fù)劑”及神經(jīng)炎癥“調(diào)節(jié)劑”[12-14]。崔連旭等[15]研究驗(yàn)證了HuMSCs 有減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的作用。另外，HuMSCs 還具有多向分化、旁分泌、免疫調(diào)節(jié)、定向遷移、基因穩(wěn)定易于轉(zhuǎn)染等優(yōu)勢(shì)，不易引起宿主對(duì)移植細(xì)胞的免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)[16，17]。因此，HuMSCs 具有更大的應(yīng)用潛能，可能成為BMSCs 的理想替代物，越來越受到臨床關(guān)注[18]。

另有研究發(fā)現(xiàn)[19，20]，HuMSCs 也具有抑制腫瘤生長(zhǎng)、選擇性遷移到損傷組織的歸巢能力，并可以通過釋放有益的細(xì)胞因子促進(jìn)自身組織的再生。已有學(xué)者研究PEX 基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞治療腫瘤研究[21-23]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEX 不僅可以阻止膠質(zhì)瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，同時(shí)可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞和血管的增殖以及轉(zhuǎn)移。因而，本研究擬構(gòu)建攜帶抗瘤基因PEX 的HuMSCs 細(xì)胞載體，利用其不間斷地表達(dá)、釋放可溶性的抗瘤分子來治療腫瘤，進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)，提高膠質(zhì)瘤患者的生存周期。最終，本研究成功構(gòu)建了PEXpcDNA3.1（+）真核表達(dá)載體，并將PEX 基因高效導(dǎo)入靶細(xì)胞，成功分泌出PEX 蛋白，使其不僅具有PEX 抗腫瘤血管形成、誘導(dǎo)凋亡和抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，又兼有HuMSCs 示蹤腫瘤的多重特性，為其在惡性膠質(zhì)瘤的基因治療開辟了一條新途徑。該體系的構(gòu)建為更深入地研究PEX 基因及HuMSCs 的作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為后續(xù)膠質(zhì)瘤的靶向治療提供了科學(xué)依據(jù)。

綜上所述，本研究構(gòu)建的PEX-pcDNA3.1（+）真核表達(dá)載體可用于轉(zhuǎn)染HuMSCs，為進(jìn)一步探討其在膠質(zhì)瘤治療中的作用奠定了基礎(chǔ)。