藍(lán)細(xì)菌螺旋擬柱孢藻的抑菌活性研究

聶利華　張宇超　鐘富勝　肖璐　鄭雅瓊

摘要［目的］探討螺旋擬柱孢藻藻株是否具有潛在的抑菌活性。［方法］從汕頭澄海人工對蝦養(yǎng)殖池分離純化藻株，通氣擴(kuò)大培養(yǎng)、離心收集、冷凍干燥后，采用乙醇提取并用柱層析分離，先后得到藻體的乙醇提取物和葉綠素提取物。以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為受試菌種，采用圓形紙片法進(jìn)行抑菌活性研究。［結(jié)果］藻體乙醇提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有抑菌作用，其抑菌直徑分別為11.8、10.3 mm；藻葉綠素粗提物僅對金黃色葡萄球菌有抑菌作用，抑菌直徑為24.2 mm。［結(jié)論］螺旋擬柱孢藻乙醇提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有中等強(qiáng)度的抑菌活性，而藻體葉綠素提取物僅對金黃色葡萄球菌抑菌，但呈高靈敏抑菌效應(yīng)，該藻株有望成為生物抑菌來源物質(zhì)的新型材料而得到進(jìn)一步開發(fā)利用。

關(guān)鍵詞藍(lán)細(xì)菌；螺旋擬柱孢藻；乙醇提取物；葉綠素提取物；抑菌活性

中圖分類號R915文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2023）08-0001-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.08.001開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on the Antibacterial Activity of Cyanobacteria Cylindrospermopsis raciborskii helix to Bacteria

NIE Li-hua，ZHANG Yu-chao，ZHONG Fu-sheng et al（Department of Bioengineering，Jieyang Polytechnic，Jieyang，Guangdong 522000）

Abstract［Objective］To explore the potential antibacterial activity of Cyanobacteria C.raciborskii helix.［Method］After isolation and purification of the algae from the artificial shrimp culture pond in Chenghai，Shantou，aeration expansion culture，centrifugal collection，freeze-drying，ethanol extraction and column chromatography separation were used to obtain the ethanol extract and chlorophyll pigment extract of the algae.The antibacterial activity of Staphylococcus aureus and Escherichia coli was studied by circular disk method.［Result］The ethanol extract of the algal body had bacteriostatic effect on Staphylococcus aureus and Escherichia coli，and its bacteriostatic diameter was 11.8 mm and 10.3 mm respectively; The crude extract of algal chlorophyll only had bacteriostatic effect on Staphylococcus aureus，and the bacteriostatic diameter was 24.2 mm.［Conclusion］The ethanol extract of C.raciborskii had moderate antibacterial activity against S.aureus and E.coli，while chlorophyll extract only inhibited S.aureus with strong activity.It was expected to be a new source material of biological antibacterial and be further developed and utilized.

Key wordsCyanobacteria;Cylindrospermopsis raciborskii helix;Ethanol extract;Chlorophyll extract;Antibacterial activity

尋找能夠抗植物病原體、水生動(dòng)物病原體、人類病原體的有效化合物一直是科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)之一，特別是近年來隨著抗生素類藥物的濫用、環(huán)境污染的加劇，人類免疫力逐漸下降造成新的致病菌、條件致病菌及超級耐藥菌日益增多等全世界面臨的嚴(yán)峻的社會(huì)問題［1］，尋求安全有效的抗菌來源物質(zhì)顯得尤為迫切，天然中草藥植物及微生物資源在抗菌活性物質(zhì)的來源方面承擔(dān)著重要的角色［2-3］。擬柱孢藻是一種具有原核微生物特性與植物雙重特性的水生藍(lán)細(xì)菌藻類物質(zhì)，屬于藍(lán)藻綱念珠藻目念珠藻科擬柱孢藻屬，以拉氏擬柱孢藻（Cylindrospermopsis raciborskii）為模式種［4］，其生存適應(yīng)力高、入侵性強(qiáng)，是近年來呈全球性擴(kuò)張分布的一種新型淡水藍(lán)藻，它首次入侵某一水體幾年后就能形成強(qiáng)烈占優(yōu)勢的水華藻［5］。

查廣才等［6-7］在凡納濱對蝦健康養(yǎng)殖與蝦池環(huán)境微生物生態(tài)研究中，發(fā)現(xiàn)一株在蝦池中呈優(yōu)勢生長且其生長與水體致病性弧菌及其他藻類等水生生物數(shù)量呈負(fù)相關(guān)的擬柱孢藻，后經(jīng)形態(tài)與基因鑒定等方面證實(shí)，此藻為一株少見的呈螺旋形不產(chǎn)毒的擬柱孢藻，暫命名為螺旋擬柱孢藻（Cylindrospermopsis raciborskii helix） ［8］。為探究此藻株潛在的抑菌性能，該試驗(yàn)在前期采樣、分離、鑒定的基礎(chǔ)上，擴(kuò)大培養(yǎng)并收集、采用乙醇提取獲得醇提物，另外用柱層析分離藻體的葉綠素粗提物，以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為供試細(xì)菌，用圓形紙片法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，為天然抑菌活性物質(zhì)來源提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料試驗(yàn)藍(lán)細(xì)菌藻株采于汕頭澄海人工凡納濱對蝦養(yǎng)殖池，所用菌種金黃色葡萄球菌和大腸桿菌來自揭陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。受試細(xì)菌選用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（購自廣東凱微生物科技有限公司）進(jìn)行培養(yǎng)。試驗(yàn)藍(lán)細(xì)菌藻株的基礎(chǔ)培養(yǎng)基采用該實(shí)驗(yàn)室前期摸索出來的改良BG11培養(yǎng)基進(jìn)行［8］，其含量配方如下：NaNO 0.38 g/L、MgSO·7HO 75 mg/L、NaCO 20 mg/L、CaCl·2HO 36 mg/L、NaEDTA 1 mg/L、Citric acid 6 mg/L、KHPO 40 mg/L、Ferric ammonium citrate 6 mg/L、Trace metal mix A5 1 mL/L（A5的成分主要有ZnSO·7HO 0.22 g/L、MnCl·4HO 1.86 g/L、HBO 2.86 g/L、NaMoO·2HO 0.36 mg/L、CuSO·5HO 0.08 g/L、Co（NO）·6HO 0.05 g/L），雙純水定容至1 L，用0.1 mol/L的氫氧化鈉與0.1 mol/L的鹽酸調(diào)pH為8.2。

1.2試驗(yàn)儀器ML32明美拍照顯微鏡（明美科技有限公司）；SCIENTZ-650E超聲波細(xì)胞粉碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；TDL-8M臺式冷凍離心機(jī)（上海戶湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；LGJ-18真空冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）;ISO9001霉菌培養(yǎng)箱（韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司）；PGX-250B智能光照培養(yǎng)箱（寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠）；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1藻株培養(yǎng)與離心收集。在前期摸索出最佳培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，進(jìn)行無菌通氣擴(kuò)大培養(yǎng)［9］，通氣速率為1.5 L/min，培養(yǎng)條件為溫度（28±1）℃、光照4 000 lx、光暗周期12 h/12 h。每天觀察生長及藻色變化，并定期檢查通氣裝置，待其對數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行離心收集（4 000 r/min，10 min，4 ℃），之后進(jìn)行冷凍干燥獲得藻體。

1.3.2藻乙醇提取物的制備。稱取1 g干藻，加入95%乙醇9 mL，采用研磨、浸漬、超聲波（25 ℃、功率120 W、超聲6～8 min、靜置5～6 h）提取，完成置于15? mL離心管中后擰緊離心管蓋子，常溫放置24 h，離心、取上清液即可得到藻類乙醇提取液。

1.3.3藻體葉綠素的提取與分離。稱取1 g干藻，加入90%乙醇9? mL，采用研磨、浸漬、超聲波（25 ℃、功率120 W、超聲6～8 min、靜置5～6 h）提取多次，合并濾液，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)得到浸膏，加入少量95%乙醇溶解，得到濃的粗產(chǎn)品，之后采用氧化鋁柱層析分離純化，濕法裝柱、上樣、用95%乙醇進(jìn)行洗脫，收集流出液，即得到純化的色素［10］。

1.3.4菌懸液的制備。采取涂布和劃線的方法將金黃色葡萄球菌與大腸桿菌進(jìn)行純化培養(yǎng)，之后挑選單菌落接種于裝有100? mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的150? mL錐形瓶中，置于霉菌培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)18 h。采用0.5麥?zhǔn)媳葷岱?，用無菌生理鹽水將菌培養(yǎng)液配制成1.5×10 CFU/mL，稀釋至106后，即制成試驗(yàn)所用的菌懸液，4 ℃保存?zhèn)溆茫?1］。

1.3.5抑菌活性測定。采用圓形紙片法［12］進(jìn)行抑菌試驗(yàn)設(shè)計(jì)，除提取物試驗(yàn)組外，試驗(yàn)設(shè)置對照組有無菌蒸餾水空白對照、1 mg/mL氨芐青霉素鈉陽性對照、細(xì)菌純菌培養(yǎng)對照和溶劑陰性對照，其中各提取物試驗(yàn)組、氨芐青霉素鈉陽性對照和溶劑陰性對照制作相應(yīng)的藥敏紙片。試驗(yàn)時(shí)，加100 μL 菌懸液于平板上，均勻涂布，擺放在直徑為5 mm已制作好的藥敏紙片上，在37 ℃培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果，測量抑菌圈。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，結(jié)果取平均值。

2結(jié)果與分析

2.1分離藻株生長情況分離純化的藻體鏡下觀察呈卷曲、螺旋的絲狀，末端尖細(xì)，寬度2.0～3.5 μm，長度可至 60 μm、多數(shù) 20～50 μm （圖1），偶見異形孢，頂生。

2.2抑菌活性圖2～3和表1是螺旋擬柱孢藻乙醇提取物采用圓形紙片法對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌結(jié)果。圖2～3的A是無菌蒸餾水空白對照，表明操作無污染；B是金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的單純菌接種，說明這2種細(xì)菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基生長良好，并且培養(yǎng)和操作過程中沒有被污染；C是溶劑揮發(fā)至干的藥敏紙片（乙醇的揮發(fā)干片）對2種受試菌的抑菌情況，測量結(jié)果表明，2種受試菌的抑菌圈直徑均為6.0 mm；D是氨芐青霉素鈉藥物對2種細(xì)菌的陽性對照，測量結(jié)果表明，陽性對照的抑菌圈直徑均為17.0 mm；E是藻類乙醇提取物對2種細(xì)菌的抑菌試驗(yàn)組，其中對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為11.8 mm，對大腸桿菌的抑菌圈直徑為10.3 mm。以上測量數(shù)據(jù)顯示，藻類乙醇提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑均大于10.0 mm，說明藻類乙醇提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有較強(qiáng)的抗菌活性，且呈現(xiàn)中度敏感。

圖4～5和表2是螺旋擬柱孢藻葉綠素提取物采用圓形紙片法對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌結(jié)果。圖4～5的A～C與藻體的乙醇提取物一樣，分別為無菌蒸餾水空白對照、純菌培養(yǎng)對照與溶劑陰性對照；D是氨芐青霉素鈉藥物對2種細(xì)菌的陽性對照，抑菌圈直徑分別為41.0 mm（金黃色葡萄球菌）、21.6 mm（大腸桿菌）；E是螺旋擬柱孢藻葉綠素提取物對2種細(xì)菌的抑菌試驗(yàn)組，抑菌圈直徑分別為24.2 mm（金黃色葡萄球菌）、6.0 mm（大腸桿菌）。以上測量數(shù)據(jù)顯示，藻類葉綠素提取物對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑>15.0 mm，抗菌活性強(qiáng)，呈現(xiàn)高度敏感；而藻類葉綠素提取物對大腸桿菌抑菌圈直徑<7.0 mm，說明藻類葉綠素提取物對大腸桿菌并無抗菌活性。

從螺旋擬柱孢藻提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌數(shù)據(jù)的橫向比較（圖6）可以看出，抑菌活性最強(qiáng)的是藻體葉綠素提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌，其次是藻體乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌，這3種情況的抑菌圈直徑均大于10.0 mm，屬于中度及高度敏感的范圍。從受試菌來看，該藻的2種提取物均對金黃色葡萄球菌有抑菌活性且呈中度、高度敏感，而對大腸桿菌來講，只有乙醇提取物呈中度敏感。另外從提取物的種類來看，該藍(lán)細(xì)菌的葉綠素提取物對金黃色葡萄球菌選擇性高，而乙醇提取物的抑菌范圍廣。

3討論與結(jié)論

我國醫(yī)藥市場上廣泛使用的抑菌劑很大一部分是化學(xué)合成，毒副作用大，且很多細(xì)菌也極易對抑菌藥產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致目前超級細(xì)菌流行，因此從天然生物材料中研發(fā)更高效、更安全的抑菌劑尤為迫切，而新型淡水來源的藍(lán)細(xì)菌擬柱孢藻具有這種潛質(zhì)。近年來的研究表明，擬柱孢藻不僅在我國水體廣泛分布， 甚至在一些大型水庫、湖泊中已成為優(yōu)勢種并產(chǎn)生水華［13］，此藻生物入侵能力很強(qiáng)，其一旦在某一水體生長后能明顯抑制水中其他藻類以及細(xì)菌的生長。該研究以潮汕地區(qū)汕頭澄海人工養(yǎng)殖蝦池中獲得的螺旋擬柱孢藻（C.raciborskii helix）為研究材料，該藻株是截至目前首次在國內(nèi)發(fā)現(xiàn)能夠生長在淡水蝦池中，并且可以促進(jìn)蝦池水質(zhì)健康，提高對蝦產(chǎn)量。有研究表明該藻分泌物可能對蝦育苗池中細(xì)菌和其他藻類有抑制作用［6-7］。但國內(nèi)外研究人員對擬柱孢藻抑菌活性的研究鮮見報(bào)道。故該研究以螺旋擬柱孢藻為材料，嘗試藻體多種成分的提取，以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為受試菌，進(jìn)行抑菌活性的檢測，以期探討螺旋擬柱孢藻是否可作為天然的生物抑菌劑，減少目前化學(xué)合成的抑菌劑給環(huán)境帶來的威脅。

目前關(guān)于藻類生物有效活性成分的提取方法主要有溶劑浸提、回流提取、索氏提取、蒸餾萃取、超臨界CO2萃取、超聲波輔助萃取、微波萃取等［14］。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件及前期摸索，該試驗(yàn)采用以乙醇為溶劑進(jìn)行浸提，為消除溶劑的影響，提取中需盡量使乙醇揮發(fā)完且需同時(shí)設(shè)立溶劑對照組同步處理。抑菌結(jié)果表明，藻類的乙醇提取物對2種受試菌均有不同程度的抑菌作用，因抑菌圈直徑均大于10.0 mm，表現(xiàn)為中等強(qiáng)度的抑菌性能，而藻體葉綠素提取物僅對金黃色葡萄球菌有效，但呈現(xiàn)高度敏感的抑菌效應(yīng)，表明藻體乙醇提取物可產(chǎn)生較廣范圍的抑菌效應(yīng)，葉綠素提取物抑菌范圍小但抑菌性能高。

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