不同血糖水平的冠心病患者外周血中Th1、Th2細(xì)胞比例變化分析

高 卉,李 雷

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)研究生院,江蘇 徐州 221004;2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,江蘇 徐州 221006)

血糖升高是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素,動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的周圍血管、腦血管、心臟等血管病變發(fā)生率與非糖尿病患者相比提升約3倍,是糖尿病患者致殘、致死的主要原因之一[1].糖尿病促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的分子機(jī)制仍未完全明確,目前研究[2]顯示,亞臨床研究和慢性炎癥可能是動(dòng)脈粥樣硬化及糖尿病發(fā)生的病理基礎(chǔ),細(xì)胞免疫和體液免疫參與其中并發(fā)揮重要作用.輔助性T細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的主要參與者,與自然殺傷性細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等共同參與動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中的泡沫細(xì)胞形成、內(nèi)皮細(xì)胞損傷等,進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)[3].本研究主要探討不同血糖水平的冠心病患者外周血中1型輔助性T細(xì)胞(Th1)、2型輔助性T細(xì)胞(Th2)的細(xì)胞比例變化及意義.

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年3月—2021年7月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的冠心病患者86例.根據(jù)血糖檢測(cè)結(jié)果將患者分為冠心病血糖正常組34例,冠心病合并糖耐量異常組20例,冠心病合并糖尿病組32例.冠心病血糖正常組中男19例,女15例;年齡50～75歲,平均(61.95±7.38)歲.冠心病合并糖耐量異常組男12例,女8例;年齡53～74歲,平均(62.31±6.93)歲.冠心病合并糖尿病組男12例,女8例;年齡51～74歲,平均(61.58±7.62)歲.另收集同期健康志愿者25名為健康對(duì)照組,心電圖和心臟彩超檢查均無(wú)異常,無(wú)糖尿病、高血壓等慢性病,其中男14名,女11名;年齡47～72歲,平均(61.05±6.38)歲.性別、年齡在各組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性.

入選標(biāo)準(zhǔn):符合2018年發(fā)布的《中國(guó)穩(wěn)定性冠心病診治指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn),冠脈造影示1支及以上血管有硬化斑塊形成,狹窄程度50%及以上;理解和溝通能力正常,自愿參與并完成隨訪.

排除標(biāo)準(zhǔn):6個(gè)月內(nèi)診斷為急性冠脈綜合征者;先天性心臟病、嚴(yán)重心瓣膜病、心肌病、紐約心臟病學(xué)會(huì)(NYHA)分級(jí)≥Ⅲ級(jí)者;合并自身免疫性疾病者;惡性腫瘤患者.

1.2 主要試劑

γ干擾素、白細(xì)胞介素4、白細(xì)胞介素5、白細(xì)胞介素10酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑盒(北京梅科萬(wàn)德生物有限公司);Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(北京諾博萊德科技有限公司);DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、M199細(xì)胞培養(yǎng)基、牛垂體提取物(浙江森瑞生物有限公司);鼠抗人γ干擾素-PE、白細(xì)胞介素4-PE單克隆抗體(南京維森特生物有限公司);磁珠(Dynal Biotech公司,挪威).

1.3 方 法

1.3.1 各組血糖、糖化血紅蛋白及炎癥因子水平檢測(cè)

采集各組受試者的清晨空腹外周靜脈血,檢測(cè)空腹血糖和糖化血紅蛋白水平;2 500 r/min離心10 min,收集血清,-20 ℃保存待測(cè).酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清γ干擾素、白細(xì)胞介素4、白細(xì)胞介素5、白細(xì)胞介素10水平.

1.3.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離及Th1、Th2細(xì)胞比例檢測(cè)

采集各組受試者清晨空腹外周靜脈血,經(jīng)肝素抗凝處理后使用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液提取外周血單個(gè)核細(xì)胞.4 ℃ 2 500 r/min離心15 min,毛細(xì)滴管吸取中間層云霧狀細(xì)胞層,使用5倍體積的緩沖液反復(fù)洗滌3次;4 ℃ 2 500 r/min離心10 min,棄去上清液;用DMEM培養(yǎng)液重懸分離得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞,加入胎牛血清0.1 mL、丙二醇甲醚醋酸酯1 mg/L、離子霉素50 mg/L、布雷非德菌素A 500 mg/L,室溫下孵箱中孵育4 h,加入鼠抗人CD3-FITC抗體,繼續(xù)孵育30 min;洗滌后加入破膜液,再加入鼠抗人γ干擾素-PE、白細(xì)胞介素4-PE單克隆抗體,室溫下孵育后上流式細(xì)胞儀檢測(cè),γ干擾素/CD3細(xì)胞為Th1細(xì)胞,白細(xì)胞介素4/CD3細(xì)胞為Th2細(xì)胞.

1.3.3 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

使用緩沖液洗滌臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞3次,然后向其中注射膠原酶,注射之前經(jīng)37 ℃預(yù)熱,消化30 min后收集人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞懸液;使用含10%胎牛血清的M199細(xì)胞培養(yǎng)基重懸,加入牛垂體提取物(終濃度300 μg/mL)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(終濃度10 μg/mL),接種在6孔板中,培養(yǎng)傳代至第3代用于本研究.

1.3.4 免疫磁珠清除外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞

分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,4 ℃ 2 500 r/min離心10 min,棄去上清液,加入洗滌后的免疫磁珠,在冰浴箱中搖動(dòng)混勻30 min;將EP管放于磁架3 min,棄去上清液,洗滌3次后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4表達(dá).

1.3.5 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

本研究共設(shè)8種效應(yīng)細(xì)胞,分別為健康對(duì)照組、冠心病血糖正常組、冠心病合并糖耐量異常組、冠心病合并糖尿病組的外周血單個(gè)核細(xì)胞以及清除CD4+T細(xì)胞的外周血單個(gè)核細(xì)胞.將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞洗滌后加入96孔板中,向培養(yǎng)孔中加入效應(yīng)細(xì)胞懸液,每種效應(yīng)細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔;加入孵育箱中37 ℃孵育6 h,棄去懸浮的細(xì)胞液,再次加入DMEM完全培養(yǎng)基液;向培養(yǎng)孔中加入MTT試劑(終濃度5 mg/mL),加入37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h,棄去培養(yǎng)液;每孔加入二甲基亞砜150 μL,室溫下振蕩10 min,上酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處各培養(yǎng)孔的吸光度值,計(jì)算細(xì)胞存活率.

1.3.6 隨 訪

患者出院后對(duì)其進(jìn)行1 a的隨訪,采取電話隨訪的方式進(jìn)行,記錄主要不良心血管事件發(fā)生情況,包括急性心力衰竭、惡性心律失常、心肌梗死、血運(yùn)重建、心源性死亡.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組空腹血糖和糖化血紅蛋白水平

本研究結(jié)果顯示,冠心病合并糖尿病組患者空腹血糖、糖化血紅蛋白水平明顯高于健康對(duì)照組、冠心病血糖正常組、冠心病合并糖耐量異常組(P<0.05).見(jiàn)表1.

表1 各組空腹血糖和糖化血紅蛋白水平 Tab.1 Fasting blood glucose and glycosylated hemoglobin levels in each group

2.2 各組Th1、Th2細(xì)胞比例分析

本研究結(jié)果顯示,Th1、Th2細(xì)胞比例在各組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);冠心病合并糖尿病組Th1細(xì)胞比例明顯高于冠心病合并糖耐量異常組、冠心病血糖正常組、健康對(duì)照組,Th2細(xì)胞比例明顯低于冠心病合并糖耐量異常組、冠心病血糖正常組、健康對(duì)照組(P<0.05).見(jiàn)表2.

表2 各組Th1、Th2細(xì)胞比例分析Tab.2 Proportion analysis of Th1 and Th2 cells in each group

2.3 各組Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞炎癥因子水平

本研究結(jié)果顯示,γ干擾素、白細(xì)胞介素4、白細(xì)胞介素5、白細(xì)胞介素10水平在各組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);冠心病合并糖尿病組γ干擾素水平明顯高于冠心病合并糖耐量異常組、冠心病血糖正常組、健康對(duì)照組(P<0.05),白細(xì)胞介素4、白細(xì)胞介素5、白細(xì)胞介素10水平明顯低于冠心病合并糖耐量異常組、冠心病血糖正常組、健康對(duì)照組(P<0.05).白細(xì)胞介素2在各組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).見(jiàn)表3.

表3 各組Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞分泌的炎癥因子水平 Tab.3 Levels of inflammatory factors secreted by Th1 cells and Th2 cells in each group

2.4 各組不同細(xì)胞亞群作用下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞存活率

本研究結(jié)果顯示,冠心病合并糖尿病組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞水平明顯低于冠心病合并糖耐量異常組、冠心病血糖正常組、健康對(duì)照組(P<0.05);清除CD4+T細(xì)胞的外周血單個(gè)核細(xì)胞在各組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).見(jiàn)表4.

表4 各組不同細(xì)胞亞群作用下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞存活率 Tab.4 Survival rate of human umbilical vein endothelial cells under different cell subsets in each group

2.5 空腹血糖、糖化血紅蛋白、Th1細(xì)胞比例、Th2細(xì)胞比例對(duì)冠心病患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值分析

隨訪1 a,結(jié)果86例冠心病患者中不良心血管事件發(fā)生率22.09%(19/86),使用ROC曲線檢測(cè)空腹血糖、糖化血紅蛋白、Th1細(xì)胞比例、Th2細(xì)胞比例對(duì)冠心病患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值.以空腹血糖、糖化血紅蛋白、Th1細(xì)胞比例、Th2細(xì)胞比例預(yù)測(cè)冠心病患者預(yù)后的靈敏度為縱坐標(biāo),以1-特異度為橫坐標(biāo),構(gòu)建ROC曲線,結(jié)果顯示,空腹血糖、糖化血紅蛋白、Th1細(xì)胞比例、Th2細(xì)胞比例對(duì)冠心病患者預(yù)后均具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值(P<0.05).將空腹血糖、糖化血紅蛋白、Th1細(xì)胞比例、Th2細(xì)胞比例納入Logistic回歸模型,通過(guò)回歸系數(shù)得出各指標(biāo)聯(lián)合的數(shù)值計(jì)算公式,得出聯(lián)合數(shù)據(jù),結(jié)果顯示各指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的預(yù)測(cè)價(jià)值最高(AUC=0.942),靈敏度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均明顯高于各指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè).見(jiàn)圖1、表5.

圖1 空腹血糖、糖化血紅蛋白、Th1細(xì)胞比例、Th2細(xì)胞比例對(duì)冠心病患者預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值的ROC曲線Fig.1 ROC curve of predictive value of fasting blood glucose,glycosylated hemoglobin,Th1 cell ratio and Th2 cell ratio on prognosis of patients with coronary heart disease

表5 空腹血糖、糖化血紅蛋白、Th1細(xì)胞比例、Th2細(xì)胞比例對(duì)冠心病患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值分析Tab.5 Analysis of predictive value of fasting blood glucose,glycosylated hemoglobin,Th1 cell ratio and Th2 cell ratio on prognosis of patients with coronary heart disease

3 討 論

相關(guān)研究[4]顯示,合成并分泌γ干擾素的Th1參與1型糖尿病患者的發(fā)病過(guò)程.輔助性T細(xì)胞是一個(gè)具有異質(zhì)性的細(xì)胞群,包括具有促炎作用的Th1細(xì)胞亞群及對(duì)炎癥反應(yīng)具有多種調(diào)節(jié)作用的Th2細(xì)胞亞群[5].本研究中冠心病合并糖尿病組Th1細(xì)胞比例明顯高于冠心病合并糖耐量異常組、冠心病血糖正常組、健康對(duì)照組(P<0.05),Th2細(xì)胞比例明顯低于冠心病合并糖耐量異常組、冠心病血糖正常組、健康對(duì)照組(P<0.05);提示隨著血糖水平的升高冠心病患者中Th1細(xì)胞比例明顯升高、Th2細(xì)胞比例明顯降低,其中合并糖尿病的冠心病患者Th1和Th2細(xì)胞比例異常改變最為明顯.Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展過(guò)程,其中Th1細(xì)胞主要分泌γ干擾素、白細(xì)胞介素2,γ干擾素還能夠活化單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)而維持炎癥反應(yīng)的持續(xù)性[6].Th2細(xì)胞能夠分泌白細(xì)胞介素4、白細(xì)胞介素5、白細(xì)胞介素10,可通過(guò)活化轉(zhuǎn)錄激活因子6抑制GATA結(jié)合蛋白3表達(dá),降低Th1細(xì)胞分化和γ干擾素分泌,進(jìn)而減緩或抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[7].正常生理狀態(tài)下Th1細(xì)胞與Th2細(xì)胞亞群相互調(diào)節(jié),呈動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[8].有研究[9]顯示,Th1細(xì)胞數(shù)和γ干擾素分泌量增加能夠促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展.

本研究結(jié)果顯示,隨著冠心病患者血糖水平的升高,γ干擾素濃度明顯增加,但白細(xì)胞介素2濃度增加不明顯,提示Th1細(xì)胞炎癥反應(yīng)在合并糖尿病的冠心病患者動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中處于長(zhǎng)期慢性炎癥狀態(tài),與急性冠脈綜合征病情進(jìn)展中硬化斑塊短時(shí)間內(nèi)破裂引發(fā)血栓存在區(qū)別.隨著冠心病患者血糖水平的升高,Th2細(xì)胞亞群分泌的白細(xì)胞介素4、白細(xì)胞介素5、白細(xì)胞介素10濃度明顯降低,提示高糖狀態(tài)會(huì)減弱冠心病患者Th2細(xì)胞對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制作用.高糖狀態(tài)下冠心病患者外周血中存在Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞平衡失調(diào)和局部炎癥反應(yīng),能夠促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生與發(fā)展.

血管內(nèi)皮損傷是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的誘發(fā)因素[10],本研究經(jīng)細(xì)胞毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),冠心病合并糖尿病患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷程度隨著血糖水平的升高逐漸加強(qiáng),提示血糖水平升高會(huì)增加外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用,且該作用隨著外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞的清除而逐漸消失,說(shuō)明輔助性T細(xì)胞在外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用.人體外周血單個(gè)核細(xì)胞中包含多種異質(zhì)性細(xì)胞亞群,包括分泌多種細(xì)胞因子CD4+的輔助性T細(xì)胞,能夠殺傷細(xì)胞的CD8+的毒性T細(xì)胞,調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,相互作用形成一個(gè)復(fù)雜免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),參與病理生理過(guò)程[11].輔助性T細(xì)胞是外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞亞群的主要成分,Th1細(xì)胞亞群活化能夠維持炎癥反應(yīng)的持續(xù)存在,還能夠加強(qiáng)毒性T細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用,進(jìn)而促進(jìn)冠心病患者高糖狀態(tài)下動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[12-13].本研究進(jìn)一步分析顯示,空腹血糖、糖化血紅蛋白、Th1細(xì)胞比例、Th2細(xì)胞比例聯(lián)合檢測(cè)對(duì)冠心病患者預(yù)后具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值(AUC=0.942),可用于冠心病患者的預(yù)后評(píng)估,還可對(duì)治療方案的合理制定提供參考.