北柴胡標(biāo)準(zhǔn)湯劑中柴胡皂苷量值傳遞規(guī)律研究

杜微波，張志強(qiáng)，陳敬然，萬瑩瑩，沈建梅

（北京康仁堂藥業(yè)有限公司，中藥配方顆粒關(guān)鍵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，北京市中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心，北京 101301）

柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd. 的干燥根，按性狀分別習(xí)稱“北柴胡”和“南柴胡”，其中北柴胡為臨床常用藥。北柴胡中主要藥效成分為柴胡皂苷（SS），具有抗菌、解熱、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用［1］。 SS 包含柴胡皂苷a（SSa）、柴胡皂苷c（SSc）、柴胡皂苷d（SSd）、柴胡皂苷f（SSf）等原生苷，柴胡皂苷b1（SSb1）、柴胡皂苷b2（SSb2）等次生苷。 近年來，學(xué)者采用高效液相色譜-紫外檢測（HPLC-UV）法測 定SSa［2］或SSa+SSd［3-5］或SSa+SSc+SSd［6-9］或SSa+SSb2+SSc+SSd［10］或SSa+SSb2+SSc+SSd+SSf［11］、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測（HPLC-ELSD）測定SSa［12］或SSa+SSd［13-14］或SSa+SSc+SSd+SSf［15］、液 相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）測定SSa+SSd［16］等，為北柴胡的質(zhì)量評價提供了一定的參考信息。

中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑是飲片以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，臨床應(yīng)用為基礎(chǔ)，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成的水煎液。 在工藝過程中要關(guān)注各個成分是否存在轉(zhuǎn)化、降解等現(xiàn)象，當(dāng)成分的量傳遞較低，說明該成分在中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑中轉(zhuǎn)移較差或者發(fā)生分解（即負(fù)轉(zhuǎn)化），若為主要活性成分，在生產(chǎn)中則需要進(jìn)行控制，保證其臨床藥效，當(dāng)成分的量傳遞明顯過高時，說明該成分在中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑中得到富集或由其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來（即正轉(zhuǎn)化），則應(yīng)重點監(jiān)控，控制富集或正轉(zhuǎn)化程度，保證其臨床應(yīng)用的安全性。 因此，對成分的量值傳遞規(guī)律研究是中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑的關(guān)鍵步驟，其決定了以中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑為參照而制定的中藥配方顆粒工藝的穩(wěn)定性及所得產(chǎn)品的安全有效性。

《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》（《技術(shù)要求》）也明確了對量值傳遞的要求，“以出膏率、含量及含量轉(zhuǎn)移率、指紋圖譜或特征圖譜、浸出物等的值為表征，詳細(xì)說明生產(chǎn)全過程的量值傳遞情況”［17］。目前對于如何利用指紋圖譜或特征圖譜進(jìn)行量值傳遞還處于摸索階段，雖然現(xiàn)有研究嘗試以相似度、峰相對保留時間及峰數(shù)目等方式描述標(biāo)準(zhǔn)湯劑化學(xué)成分的變化，但均屬于定性評價，不適用于物質(zhì)傳遞規(guī)律的分析［18-20］。

本研究以北柴胡為例，基于目前對北柴胡化學(xué)成分的研究情況，針對SS 進(jìn)行特征圖譜研究，采用雙波長對北柴胡標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的原生苷和次生苷進(jìn)行監(jiān)測。 并參照含量轉(zhuǎn)移率，建立了以標(biāo)準(zhǔn)湯劑、飲片中單位濃度下特征峰峰面積、標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率為因子的公式，計算K 值，在不需要測定各特征峰含量的前提下描述標(biāo)準(zhǔn)湯劑中SS 的量值傳遞，明確北柴胡標(biāo)準(zhǔn)湯劑的傳遞規(guī)律，用于指導(dǎo)北柴胡配方顆粒及含北柴胡經(jīng)典名方制劑的生產(chǎn)研究及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定。

1 材料

表1 北柴胡材料來源

2 方法

2.1 北柴胡標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備及出膏率測定

將北柴胡藥材按2020 年版《中國藥典》柴胡飲片炮制的規(guī)定進(jìn)行炮制，獲得北柴胡飲片。 取飲片適量于砂鍋中，浸泡30 min，一煎加入飲片量9 倍水，武火（500 W）煮沸后，文火（200 W）煎煮20 min，趁熱過濾，迅速冷卻，備用；二煎加飲片量6 倍水，武火煮沸后，文火煎煮15 min，趁熱過濾，迅速冷卻備用，合并二次煎煮濾液，在50 ℃以下濃縮，濃縮至料液比約為1∶1，冷凍干燥，即獲得北柴胡標(biāo)準(zhǔn)湯劑。稱定北柴胡標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量，計算出膏率。

2.2 特征圖譜方法

2.2.1 對照品溶液的制備

取SSa、SSb1、SSb2、SSc、SSd、SSf 對照品適量，精密稱定，加甲醇制成1 mL 含SSa、SSb1、SSb2、SSc、SSd、SSf 75 μg 的溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液制備

取標(biāo)準(zhǔn)湯劑及飲片粉末（過三號篩）適量，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入含5%濃氨試液的50%乙醇25 mL，密塞，稱重，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱重，用5%濃氨試液的50%乙醇補(bǔ)足減失的粉量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，柱長為10 cm，柱內(nèi)徑為2.1 mm，粒徑為1.7 μm；以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按表2 中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為211 nm、250 nm；柱溫35 ℃；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣體積各3 μL。理論板數(shù)按SSa 峰計算，應(yīng)不低于10 000。

表2 北柴胡標(biāo)準(zhǔn)湯劑流動相梯度洗脫程序

2.2.4 特征峰確認(rèn)

測定18 批北柴胡標(biāo)準(zhǔn)湯劑、飲片特征圖譜，使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012.1 版本）［21］，按中位數(shù)計算，進(jìn)行共有峰標(biāo)識，生成對照圖譜，并利用SSa、SSb1、SSb2、SSc、SSd、SSf 對照品溶液進(jìn)行特征峰確定。

2.2.5 方法學(xué)考察

2.2.5.1 重復(fù)性試驗

按2.2.2 項下方法制備供試品溶液6 份，記錄其特征圖譜，以SSa 為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積。

2.2.5.2 中間精密度試驗

采用不同儀器（島津超高效液相色譜儀LC-30AD），按2.2.2 項下方法獲得6 份供試品溶液的特征圖譜，SSa 為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積。

2.2.5.3 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h 進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，并以SSa 為參照物峰，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積。

2.3 飲片至標(biāo)準(zhǔn)湯劑量值傳遞分析

按2.2.2 項“供試品制備方法”制備18 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑、飲片供試品溶液，按2.2.3 項色譜條件測定其特征圖譜，以獲得的特征圖譜數(shù)據(jù)，計算K 值，分析飲片至標(biāo)準(zhǔn)湯劑物質(zhì)傳遞情況。

3 結(jié)果

3.1 特征峰確認(rèn)

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012.1 版本），按中位數(shù)計算，對18 批北柴胡標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行共有峰標(biāo)識，生成的對照圖譜見圖1。

圖1 18 批北柴胡標(biāo)準(zhǔn)湯劑對照圖譜

通 過 對 比SSa、SSb1、SSb2、SSc、SSd、SSf 對 照 品溶液，分析確定了211 nm 下峰1 為SSc，峰2 為SSf，峰3 為SSa，峰4 為SSb2；250 nm 下峰6 為SSa，峰7為SSb2，峰9 為SSb1。 見圖2。

圖2 北柴胡標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜特征峰確認(rèn)

3.2 特征圖譜方法學(xué)

3.2.1 重復(fù)性試驗

各特征峰相對保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.11%～0.26%，相對峰面積的RSD 為1.07%～2.68%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.2.2 中間精密度試驗

各特征峰的相對保留時間的RSD 為0.1%～0.2%，相對峰面積的RSD 為0.3%～1.6%。 不同儀器間相對保留時間RSD 范圍為0.1%～0.5%，相對峰面積RSD 范圍為1.5%～21.8%，結(jié)果表明該特征圖譜的在不同儀器間相對保留時間符合分析要求，不同儀器間相對峰面積差異較大。

3.2.3 穩(wěn)定性試驗

各特征峰的相對保留時間RSD 為0.1%～4.0%，相對峰面積的RSD 為1.0%～4.1%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)測定結(jié)果穩(wěn)定。

3.3 飲片至標(biāo)準(zhǔn)湯劑物質(zhì)傳遞分析

以18 批北柴胡飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征峰峰面積、樣品濃度及出膏率計算K 值，結(jié)果見表3。

表3 18 批北柴胡中柴胡皂苷的K 值

由表3 可知，18 批北柴胡飲片與北柴胡標(biāo)準(zhǔn)湯劑的各峰量值傳遞的K 值趨勢一致，但傳遞的效率不一。其中峰1、2、3、4、8 的K 值小于1，表明該類成分至標(biāo)準(zhǔn)湯劑中不易轉(zhuǎn)移或發(fā)生分解（即負(fù)轉(zhuǎn)化），峰7、9 的K 值大于1，表明該類成分至標(biāo)準(zhǔn)湯劑中得到富集或存在物質(zhì)的正轉(zhuǎn)化過程，而峰5、峰6 在不同批次中傳遞趨勢不同。

4 討論

北柴胡主要化學(xué)成分為皂苷、黃酮、揮發(fā)油、甾醇、香豆素、多糖類、木脂素等，具有解熱、抗炎、抗病毒、抗細(xì)菌內(nèi)毒素、抗腫瘤、保肝、降血脂、抗驚厥、提高免疫力等作用，其中生理活性較強(qiáng)有皂苷、黃酮、揮發(fā)油等［22］。 北柴胡標(biāo)準(zhǔn)湯劑是中藥飲片的水煎液，因此物質(zhì)基礎(chǔ)主要為水溶性成分。 梳理活性成分發(fā)現(xiàn)，黃酮類成分多為水溶性，但該類成分主要分布于地上部分［23］，根中含量較低；揮發(fā)油成分由于其揮發(fā)性，湯劑中不易獲得。 SS 為柴胡主要活性成分，且水溶性較好，為本研究的目標(biāo)分析物質(zhì)。 由于SS 結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，在酸性及高溫等條件下，原生苷易降解為次生苷。 因此，針對標(biāo)準(zhǔn)湯劑中原生苷與次生苷成分，利用UPLC 建立了真實反映標(biāo)準(zhǔn)湯劑物質(zhì)成分的特征圖譜方法。

指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率是以成分含量的相對值進(jìn)行定量評價，能夠表明物質(zhì)成分的變化趨勢，但僅適用于有對照品參照的成分。 本研究參照指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率公式，以特征峰峰面積、樣品濃度、出膏率為因子，建立基于特征圖譜分析物質(zhì)傳遞規(guī)律的K 值。 K 值是以峰面積進(jìn)行比對，不需引入成分對照品進(jìn)行含量測定，在缺少成分對照品的前提下也能夠進(jìn)行分析，同時降低了多因子對于結(jié)果分析的影響，能夠科學(xué)分析標(biāo)準(zhǔn)湯劑量值傳遞規(guī)律。

由表3 可知，飲片至標(biāo)準(zhǔn)湯劑過程中主要物質(zhì)都進(jìn)行了傳遞，但傳遞效率不一。 峰1、2、3 分別為211 nm 下的SSc、SSf、SSa，由于轉(zhuǎn)化為次生皂苷，因此較小，多在0.10 左右。峰6 為250 nm 下的SSa，而SSa 末端紫外吸收，因此在250 nm 上靈敏度較差，導(dǎo)致傳遞趨勢不一；同樣峰4 為211 nm 下的次生皂苷SSb2，在211 nm 上靈敏度較差，SSb2的傳遞規(guī)律以250 nm 峰7 為 參 照。 峰7、9 為 次 生 苷SSb2和SSb1，K 值均大于1，這與原生苷SSa、SSd 在標(biāo)準(zhǔn)湯劑中不同程度的轉(zhuǎn)化有關(guān)。 根據(jù)文獻(xiàn)報道SSa 轉(zhuǎn)化為SSb1，SSd 轉(zhuǎn)化為SSb2，對比SSb1與SSb2的K 值可知，SSb2K 值大于SSb1，說明SSd 轉(zhuǎn)化程度較大，這與李軍等［24］對水煎液中SSa、SSd 的溶出與轉(zhuǎn)化差異研究結(jié)果一致。 綜上，北柴胡標(biāo)準(zhǔn)湯劑物質(zhì)傳遞規(guī)律符合SS 成分特性，表明K 值能夠準(zhǔn)確分析標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備過程中物質(zhì)的變化規(guī)律。 根據(jù)《技術(shù)要求》中藥配方顆粒應(yīng)以標(biāo)準(zhǔn)湯劑為參照物的要求，應(yīng)根據(jù)北柴胡標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備過程中物質(zhì)的變化規(guī)律及各化學(xué)成分對北柴胡功效的影響，對北柴胡配方顆粒的質(zhì)量控制指標(biāo)進(jìn)行轉(zhuǎn)變，應(yīng)由傳統(tǒng)的SSa+SSd轉(zhuǎn)變?yōu)镾Sa 或SSa+SSb2，同時在配方顆粒生產(chǎn)過程中，也應(yīng)著重對各工藝環(huán)節(jié)影響上述指標(biāo)的因素進(jìn)行研究，控制SSa 負(fù)轉(zhuǎn)化及SSb2正轉(zhuǎn)化的程度，確保成分的量與標(biāo)準(zhǔn)湯劑相當(dāng)，保證配方顆粒與標(biāo)準(zhǔn)湯劑的一致性。

本研究利用北柴胡標(biāo)準(zhǔn)湯劑專屬性UPLC 特征圖譜方法，結(jié)合K 值，明確飲片至標(biāo)準(zhǔn)湯劑中各化學(xué)成分的傳遞情況，可根據(jù)《技術(shù)要求》明確可接受范圍，用于指導(dǎo)以標(biāo)準(zhǔn)湯劑為參照的北柴胡配方顆粒生產(chǎn)全過程，保證臨床用藥的安全性、有效性，為其他藥材標(biāo)準(zhǔn)湯劑量值傳遞規(guī)律的分析提供參考。