參芪復(fù)方對(duì)衰老糖尿病模型大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)合成代謝及mTOR 信號(hào)通路的影響

田 苑，鐘 文，楊 燕

（1.成都醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610500； 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072）

衰老是肌少癥最根本的因素，伴隨年齡增加的不可避免的肌量損失和功能下降可導(dǎo)致原發(fā)性肌少癥［1-2］。 糖尿病是引發(fā)繼發(fā)性肌少癥的重要病因，糖尿病能加速因葡萄糖毒性、胰島素抵抗以及某些遺傳因素導(dǎo)致的肌肉損失［3］。 骨骼肌作為重要的糖代謝器官，其肌量的喪失會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的全身代謝紊 亂［4］。

肌少癥可導(dǎo)致跌倒、骨折、功能下降、老年人失去獨(dú)立性等，也能增加死亡率［5］。 衰老和糖尿病的各種病理因素導(dǎo)致骨骼肌肌量丟失、功能減退，使衰老糖尿病肌少癥成為一種普遍的共病狀態(tài)，對(duì)老年人生活質(zhì)量和生命安全造成不可忽視的危害，帶來(lái)巨大的醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 最新的《中國(guó)老年糖尿病診療指南（2021 年版）》中也明確將“肌少癥與衰弱”列為老年糖尿病共患疾?。?］。 骨骼肌是調(diào)節(jié)葡萄糖和蛋白質(zhì)代謝的重要器官，保護(hù)骨骼肌肌量和功能，能夠阻止老年衰弱狀態(tài)和肌少癥，遏制老年性代謝疾病的發(fā)生發(fā)展。

肌量減少是肌少癥的核心診斷標(biāo)準(zhǔn)，骨骼肌蛋白質(zhì)合成和分解代謝的平衡是肌量的保證。 本研究基于中醫(yī)脾主肌肉理論，探討中藥參芪復(fù)方調(diào)控哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路，干預(yù)衰老糖尿病大鼠肌量減損的分子機(jī)制，以期為中醫(yī)藥防治糖尿病肌少癥提供新的思路。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3 月齡健康無(wú)特定病原體（SPF 級(jí)）Wistar 雄性大鼠50 只，體質(zhì)量200～250 g，成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，許可證號(hào)為SCXK（川）2015-030，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審核申請(qǐng)備案編號(hào)為2019-25。 動(dòng)物飼養(yǎng)區(qū)域通風(fēng)、控溫、控濕，溫度22～23 ℃，濕度55%～56%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，3～5 只/籠。 飼養(yǎng)環(huán)境保持清潔干燥，定期消毒。 實(shí)驗(yàn)區(qū)黑暗與光照交替時(shí)間為每12 h 一次。

1.2 主要試劑與儀器

參芪復(fù)方組成：人參、黃芪、山藥、生地黃、山萸肉、天花粉、丹參、制大黃，成人一日劑量：人參、黃芪均15 g，大黃6 g，余皆為10 g。 制備參芪復(fù)方浸膏，每毫升含1.44 g 生藥，由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科生產(chǎn)提供。 磷酸西格列汀片（西格列汀）：每片100 mg，默沙東公司，批號(hào)J20140095。 磷酸西格列汀混懸液：將西格列汀片研成細(xì)末，加蒸餾水30 mL 混勻制備混懸液。 D-半乳糖：SIGMA 公司，貨號(hào)G0750-50G。 鏈脲佐菌素（STZ）：MAYA 公司，貨號(hào)833208-14684-1G。 mTOR 通路磷酸化懸浮芯片：Full Moon 公司，芯片貨號(hào)PMT138。 乙二胺四乙酸（EDTA）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號(hào)E196386。 考馬斯亮藍(lán)G-250：北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)C8420。 牛血清血蛋白BSA：Merck 公司，貨號(hào)A1933-25G。 三氯乙酸（TCA）：上海麥克林生化科技有限公司，貨號(hào)T834457。

數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海昕?jī)x儀器儀表有限公司，型號(hào)XY-SYG-14。 冷凍離心機(jī)：Thermo Scientific 公司，型號(hào)Heraeus Pico & Fresco。 超速離心機(jī)：Thermo Scientific 公司，型號(hào)Sorvall WX 80+。 超聲波清洗器：深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司，型號(hào)JP-720PLUS。高通量組織研磨器：寧波新芝生物科技有限公司，型號(hào)Sceintz-48。

2 方法

2.1 分組與造模

50 只Wistar 雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，8 只大鼠以生理鹽水腹腔注射，為空白組；另10 只腹腔注射D-半乳糖（50 mg/kg，日1 次）42 d，為衰老模型組；另外32 只大鼠腹腔注射D-半乳糖42 d，并于第13 天喂養(yǎng)高脂高糖飼料，30 d 后腹腔一次性注射STZ（40 mg/kg），篩選空腹血糖（FPG）≥11.1 mmol/L 者為衰老糖尿病模型鼠。 空白組及衰老模型組以同等容量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射作為對(duì)照。

衰老糖尿病模型大鼠按照血糖由高到低進(jìn)行排列并編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為衰老糖尿病模型組、參芪復(fù)方組、西格列汀組。 分組后衰老糖尿病模型組和西格列汀組各11 只，參芪復(fù)方組10 只，加空白組8 只，衰老模型組10 只，共5 組。

2.2 干預(yù)

造模后進(jìn)行藥物干預(yù)，干預(yù)時(shí)長(zhǎng)為8 周。 空白組、衰老模型組及衰老糖尿病模型組灌服生理鹽水，參芪復(fù)方組和西格列汀組的給藥劑量相當(dāng)于成人劑量的10 倍，每周測(cè)量大鼠體質(zhì)量，并根據(jù)體質(zhì)量變化，及時(shí)調(diào)整灌胃藥量。 各組具體給藥方案見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠給藥方案

2.3 標(biāo)本采集與處理

大鼠處死前12 h 禁食不禁水，腹腔注射2%戊巴比妥（45 mg/kg）麻醉，置于冰盤(pán)四肢固定。 將腓腸肌自起點(diǎn)（股骨內(nèi)、外側(cè)髁）至止點(diǎn)（跟骨結(jié)節(jié)處）完整取下。 在磷酸鹽緩沖液（PBS）中洗凈血跡洗3 次，用剪刀剪碎腓腸肌，然后置于離心管中加入5%預(yù)冷緩沖液至浸沒(méi)，待測(cè)肌纖維與肌漿蛋白含量，在保證統(tǒng)計(jì)量有效的前提下，每組取3 只樣本；余腓腸肌組織分裝至微型離心管（EP 管）并標(biāo)記，放置于液氮中，存放溫度為-80 ℃，用于蛋白磷酸化抗體芯片檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析軟件為SPSS 22.0，計(jì)量資料以x±s 表示，各組數(shù)據(jù)分別進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布且方差齊，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD 法；不符合方差齊性要求則進(jìn)行秩和檢驗(yàn)。 取α=0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

4 結(jié)果

4.1 各組大鼠腓腸肌肌纖維蛋白質(zhì)量濃度比較

各組大鼠腓腸肌肌纖維蛋白質(zhì)量濃度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腓腸肌肌纖維蛋白質(zhì)量濃度比較（）

表2 各組大鼠腓腸肌肌纖維蛋白質(zhì)量濃度比較（）

組別 n 肌纖維蛋白質(zhì)量濃度/（μg/mL）空白組 3 75.65±0.42衰老模型組 3 75.37±1.11衰老糖尿病模型組 3 74.27±1.74參芪復(fù)方組 3 74.50±0.79西格列汀組 3 75.20±0.95

4.2 各組大鼠腓腸肌肌漿蛋白質(zhì)量濃度比較

結(jié)果顯示，衰老糖尿病模型組大鼠骨骼肌肌漿蛋白質(zhì)量濃度顯著降低。 與衰老糖尿病模型組比較，參芪復(fù)方組和西格列汀組都能提高衰老糖尿病模型大鼠的腓腸肌肌漿蛋白質(zhì)量濃度。 見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠腓腸肌肌漿蛋白質(zhì)量濃度比較（）

注：與衰老糖尿病模型組比較，＊P＜0.05。

組別 n 肌漿蛋白質(zhì)量濃度/（μg/mL）空白組 3 71.70±0.90＊衰老模型組 3 71.13±1.59＊衰老糖尿病模型組 3 60.28±7.01參芪復(fù)方組 3 70.72±2.00＊西格列汀組 3 67.29±4.06＊

4.3 mTOR 磷酸化抗體芯片磷酸化位點(diǎn)圖像

蛋白激酶B1（Akt1，Phospho-Thr450）、核糖體蛋白S6 激酶1/2/3/4（RSK1/2/3/4，Phospho-Ser221/227/218/232）及p70 核糖體蛋白S6 激酶（P70S6K，Phospho-Thr229）在衰老糖尿病模型組下調(diào)，在參芪復(fù)方組和西格列汀組均上調(diào)；人第10 號(hào)染色體缺失的磷酸酶（PTEN，Phospho-Ser370）在衰老糖尿病模型組上調(diào)，在參芪復(fù)方組和西格列汀組下調(diào)。 見(jiàn)表4、圖1。

表4 mTOR 磷酸化抗體芯片讀取的組間比較FC 值

5 討論

5.1 病機(jī)及治則

脾主肌肉。 《素問(wèn)·太陰陽(yáng)明論》載：“脾病四肢不用何謂也……今脾病不能為胃行其津液，四肢不得稟水谷之氣，氣日以衰，脈道不利，筋骨肌肉皆無(wú)氣以生，故不用焉?！毖悦髌⑦\(yùn)化不利，不能為胃行其津液，不能運(yùn)化水谷精微以達(dá)四末，四肢不得稟水谷之氣，致四肢脈道、筋骨、肌肉“無(wú)氣以生”，失于氣血之濡養(yǎng)，萎廢不用。 脾主運(yùn)化水谷精微功能受損，則四肢筋骨肌肉失于水谷精微、氣血的滋養(yǎng)，導(dǎo)致骨骼肌肌量受損，出現(xiàn)肌肉瘦削、乏力、運(yùn)動(dòng)障礙、易跌倒等表現(xiàn)，如《靈樞·本神》言：“脾氣虛則四肢不用?！惫署舨”旧碓从谄⑻撌н\(yùn)，脾虛失濡，治療尊“治痿獨(dú)取陽(yáng)明”，當(dāng)健脾助運(yùn)。

糖尿病歸屬中醫(yī)學(xué)消渴范疇。 葡萄糖作為水谷精微之一，需脾運(yùn)化至身體各處而被利用，施今墨言：“血糖者，飲食所化之精微也?！保?］脾的功能障礙則“脾不散精”或“散精不利”，導(dǎo)致葡萄糖不能被運(yùn)化和利用，在血液中積累，形成糖尿病之高血糖。 故消渴的核心病機(jī)為脾氣虛、脾不散精，健脾益氣也同為消渴的治療方法［8］。 消渴相關(guān)肌病以消渴為獨(dú)特病因，病機(jī)同為脾氣不足，治療首當(dāng)健脾益氣。

肌少癥是增齡性疾病，老年人為主要發(fā)病人群。老年人腎氣虛，更賴脾胃化生氣血以滋五臟，故衰老消渴相關(guān)肌病的治療仍以益氣健脾、助脾運(yùn)化散精為要，兼顧補(bǔ)腎，健脾補(bǔ)腎并行［9］。 脾氣不足，病理產(chǎn)物叢生，其中瘀血貫穿消渴始終，也是促進(jìn)肌病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。 衰老消渴相關(guān)肌病的治療方法為健脾益氣、滋陰補(bǔ)腎、活血化瘀。

5.2 前期研究基礎(chǔ)

參芪復(fù)方是臨床治療消渴的經(jīng)驗(yàn)方，該方可改善大鼠的一般狀況，降低大鼠食欲并減少飲水量，維持腓腸肌濕重，改善骨骼肌細(xì)胞炎癥浸潤(rùn)、萎縮、水腫情況，其中對(duì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的改善尤為明顯［10-11］，并能顯著升高血清胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）水平。前期研究還顯示，參芪復(fù)方維持骨骼肌肌量的作用可能與磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/mTOR 通路的激活相關(guān)［10，12］。

5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

骨骼肌蛋白質(zhì)合成是維持肌量、肌力的關(guān)鍵因素。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，參芪復(fù)方組肌漿蛋白含量顯著高于衰老糖尿病模型組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 肌漿蛋白是與能量代謝功能有關(guān)的蛋白質(zhì)，占肌肉蛋白質(zhì)的30%～35%，參芪復(fù)方升高肌漿蛋白質(zhì)量濃度證明其可能通過(guò)促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成以保持肌量。

mTOR 信號(hào)通路磷酸化抗體芯片數(shù)據(jù)讀取結(jié)果顯示，參芪復(fù)方上調(diào)Akt1（Phospho-Thr450）、P70S6K（Phospho-Thr229）、RSK1/2/3/4（Phospho-Ser221/227/218/232）。 Akt 介導(dǎo)的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mTORC1）激活通過(guò)磷酸化調(diào)節(jié)許多下游效應(yīng)蛋白，包括具有良好特性的效應(yīng)因子p70 核糖體S6 蛋白激酶1（P70S6K1）和真核細(xì)胞翻譯起始因子4E 結(jié)合蛋白1（4E-BP1），以增加蛋白質(zhì)合成［13］。 從Akt 激酶被磷酸化的順序來(lái)看，蘇氨酸450 號(hào)位點(diǎn)的磷酸化優(yōu)先于絲氨酸473 號(hào)位點(diǎn)和蘇氨酸308 號(hào)位點(diǎn)的磷酸化，而且已經(jīng)被證明蘇氨酸450 號(hào)位點(diǎn)的磷酸化是接下來(lái)繼續(xù)磷酸化和激活A(yù)kt 激酶所必需的［14］。 P70S6K 的磷酸化增加，能夠促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)合成，mTORC1/P70S6K 信號(hào)通路的磷酸化是一種促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)合成的重要因素［15］。 在IGF-1/Akt/mTORC1 信號(hào)通路中，Akt/mTOR 激活和P70S6K的后續(xù)磷酸化被認(rèn)為是誘導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的原因［16］。RSK 已被證明是磷酸化160 kDa 的Akt/PKB 底物（AS160），AS160 是一種參與介導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4（GLUT4）轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜以響應(yīng)胰島素的蛋白質(zhì)［17］，RSK 磷酸化AS60，從而促進(jìn)分子內(nèi)GLUT4 蛋白向細(xì)胞膜遷移，促使葡萄糖從血液吸收到肌肉中儲(chǔ)存和/或利用。 在骨骼肌中，胰島素通過(guò)將GLUT4 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到肌細(xì)胞膜上，刺激葡萄糖攝取，并增加肌肉質(zhì)量和生長(zhǎng)［18］。 Akt1（Phospho-Thr450）、P70S6K（Phospho-Thr229）、RSK1/2/3/4（Phospho-Ser221/227/218/232）的表達(dá)上調(diào)都能促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)的合成。

參芪復(fù)方可下調(diào)PTEN（Phospho-Ser370），PTEN作為胰島素及IGF-1 信號(hào)調(diào)節(jié)器的作用，影響葡萄糖攝取和脂質(zhì)代謝，PTEN 表達(dá)增加可負(fù)性調(diào)節(jié)胰島素敏感性，并參與胰島素抵抗的發(fā)生［18］。 參芪復(fù)方可能通過(guò)下調(diào)PTEN（Phospho-Ser370），改善衰老糖尿病大鼠的糖脂代謝。

綜上，參芪復(fù)方通過(guò)升高肌漿蛋白質(zhì)量濃度，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成以保持肌量，其分子機(jī)制可能與mTOR信號(hào)通路中Akt1（Phospho-Thr450）、P70S6K（Phospho-Thr229）、RSK1/2/3/4（Phospho-Ser221/227/218/232）的上調(diào)有關(guān)。

5.4 小結(jié)

脾主肌肉，肌肉形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能的正常，都與脾胃密切相關(guān)。 脾胃功能正常發(fā)揮更是延緩衰老、防治消渴及其并發(fā)癥的根本。 mTOR 信號(hào)通路是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的重要通路，通過(guò)感受能量代謝和運(yùn)動(dòng)刺激，參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成代謝，進(jìn)而維持骨骼肌肌量和肌力。 脾胃主運(yùn)化受納，將外來(lái)攝入的飲食水谷轉(zhuǎn)化為精微的能量物質(zhì)，布散于四肢肌肉，使四肢得以充養(yǎng)。 綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，參芪復(fù)方可能通過(guò)干預(yù)mTOR 信號(hào)通路、調(diào)控骨骼肌蛋白質(zhì)合成代謝、維護(hù)骨骼肌能量代謝、保護(hù)骨骼肌肌量及肌力，而發(fā)揮防治衰老相關(guān)糖尿病肌少癥作用。