茄子種質(zhì)遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)分析

黃月琴, 廖秋石,2, 陳學(xué)軍, 袁欣捷, 雷 剛, 周坤華, 方 榮

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所, 南昌 330200;2.唐河縣第一高級(jí)中學(xué), 河南 南陽(yáng) 473400)

茄子(SolanummelongenaL.)為茄科茄屬(2 n=2 x=24)蔬菜作物,起源于印度及東南亞熱帶地區(qū),古印度為其最早馴化地[1]。我國(guó)茄子栽培歷史悠久,分布廣泛,品種類型繁多,我國(guó)是茄子次生起源中心,也是目前世界上最大的茄子生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)[2]。種質(zhì)資源是農(nóng)作物種質(zhì)創(chuàng)新、遺傳改良和品種選擇的基礎(chǔ),明晰種質(zhì)資源的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)是其有效保護(hù)和高效利用的前提。我國(guó)茄子栽培種遺傳基礎(chǔ)比較狹窄,在一定程度上限制了茄子的基礎(chǔ)研究和育種進(jìn)展[3]。因此,掌握茄子不同材料間的遺傳親緣關(guān)系、遺傳多樣性信息及遺傳組成成分,開(kāi)展茄子種質(zhì)資源的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)研究,對(duì)茄子遺傳改良具有重要意義。

關(guān)于茄子遺傳多樣性,國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展了形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生物化學(xué)和分子生物等多方面的研究。黃月琴等[4]基于17個(gè)表型性狀對(duì)113份茄子種質(zhì)進(jìn)行鑒定與遺傳多樣性評(píng)價(jià);齊東霞等[5]利用25對(duì)SSR分子標(biāo)記和24個(gè)表型性狀對(duì)105份中俄茄子材料進(jìn)行遺傳多樣性分析;吳麗艷等[6]為了明確云南野生茄資源的遺傳背景,對(duì)其進(jìn)行分類鑒定,利用9個(gè)形態(tài)性狀和8對(duì)SSR引物對(duì)從云南省搜集的43份野生茄資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。在茄子群體結(jié)構(gòu)研究方面,謝立峰等[7]采用SRAP標(biāo)記法對(duì)183份茄子種質(zhì)資源的遺傳關(guān)系和群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析;馮英那等[8]采用SSR標(biāo)記對(duì)70份國(guó)內(nèi)外茄子材料進(jìn)行多態(tài)性掃描、遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果顯示,各種質(zhì)遺傳相似系數(shù)平均為0.68,群體遺傳結(jié)構(gòu)分析將供試材料分為五個(gè)亞群;Flavien Shimira等[9]采用iPBS-反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子標(biāo)記系統(tǒng)對(duì)來(lái)自盧旺達(dá)兩個(gè)地區(qū)的52份紅茄種質(zhì)進(jìn)行了鑒定;Liu Jun等[10]利用45個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)287份國(guó)內(nèi)外茄子種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析。形態(tài)學(xué)簡(jiǎn)單直觀,是茄子種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)最常用的方式;SSR分子標(biāo)記以其多態(tài)性好、穩(wěn)定性高、呈共顯性遺傳、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于作物的遺傳多樣性研究。本試驗(yàn)利用50對(duì)SSR標(biāo)記和18個(gè)表型性狀對(duì)從國(guó)內(nèi)外引進(jìn)的77份茄子種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析,旨在深入探究茄子種質(zhì)間親緣關(guān)系和遺傳多樣性分布特點(diǎn),為茄子種質(zhì)資源的有效利用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試茄子種質(zhì)材料77份,其中68份引自國(guó)家蔬菜種質(zhì)資源中期庫(kù),包括栽培茄(SolanummelongenaL.)65份、近緣野生茄(Wild relatives of eggplant)12份;國(guó)內(nèi)種質(zhì)66份(來(lái)自我國(guó)16個(gè)省市自治區(qū))、國(guó)外種質(zhì)11份。供試種質(zhì)由江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供,詳見(jiàn)表1。

1.2 田間表型性狀調(diào)查

試驗(yàn)于2020年3—7月在江西南昌進(jìn)行。南昌地處長(zhǎng)江中下游地區(qū),屬亞熱帶季風(fēng)區(qū),雨量充沛,四季分明。試驗(yàn)采用高畦覆膜種植,每品種定植20株,行距65 cm,株距50 cm,每份材料隨機(jī)選取8株進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查,茄子以嫩果為食用果,表型性狀評(píng)價(jià)以果實(shí)為主,因此本研究主要選取果實(shí)和花等相關(guān)的18個(gè)表型性狀,調(diào)查方法參照《茄子種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[11]進(jìn)行。

表1 供試材料Table 1 Test accessions

1.3 DNA提取和檢測(cè)

以茄子嫩葉為材料,采用改良CTAB法[12]提取總DNA,在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)樣品DNA的完整性;用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為260 nm和280 nm處測(cè)定OD值,檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度,并稀釋到50 ng/μL備用。

1.4 SSR擴(kuò)增體系的建立及檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[13]、[14]的方法,選用120對(duì)SSR引物(由武漢金開(kāi)瑞生物科技有限責(zé)任公司合成),利用V 06 B 0140、V 06 B 0523、V 06 B 0659等9份表型差異較大的材料進(jìn)行引物篩選,通過(guò)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選出多態(tài)性高、條帶清晰穩(wěn)定的引物。設(shè)定反應(yīng)體系為:0.4 μmol/L引物、9.2 μL×2TaqMaster Mix、0.4 μL模板DNA;反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性30 s,50～60 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,33～35個(gè)循環(huán),72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)在PCR儀(Biometra TGRADIEN)上進(jìn)行,反應(yīng)結(jié)束后,擴(kuò)增產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳,銀染檢測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016和SPSS 22.0軟件進(jìn)行變異分析、主成分分析和聚類分析,主成分分析采用相關(guān)性矩陣法和最大方差法;聚類分析采用系統(tǒng)聚類,選擇組內(nèi)平方歐氏距離的方法。采用人工讀膠法統(tǒng)計(jì)電泳譜帶,按形成1、0數(shù)據(jù)矩陣記載,計(jì)算單位引物擴(kuò)增的條帶、及多態(tài)性條帶百分率。利用POPGENE 32軟件分析Shannon信息指數(shù)(I)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和等位基因頻率[15-16]。參照Bostein等[17]的方法,計(jì)算各個(gè)SSR位點(diǎn)的多態(tài)性信息量(Plymorphism information content,PIC)。使用NTSYS-pc(2.10)計(jì)算遺傳相似系數(shù),用非加權(quán)類平均法(UPGMA,unweighted pairgroup method with arithmetic means)進(jìn)行聚類,生成聚類圖[18]。

利用Structure 2.3.4軟件進(jìn)行群體分析,設(shè)置程序運(yùn)行參數(shù),Burnin設(shè)置為10 000次,MCMC設(shè)置為100 000次,將最優(yōu)群體數(shù)K值的取值范圍設(shè)定在2～10之間,每個(gè)K值重復(fù)運(yùn)行3次,以最大似然值為原則選取最佳的K值作為群體結(jié)構(gòu)的最優(yōu)群體數(shù)目,用Sigma plot 2.5描繪K值折線圖,并進(jìn)一步計(jì)算各份種質(zhì)材料相應(yīng)的遺傳相似性權(quán)重值(Q值),繪制群體結(jié)構(gòu)圖,確定材料的遺傳組成[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于表型性狀的遺傳多樣性分析

2.1.1變異及遺傳多樣性分析

如表2所示,18個(gè)表型變異系數(shù)為11.47%～78.46%,其中果形指數(shù)的變異系數(shù)最大,為78.46%,其次為果長(zhǎng)、果形、熟性、果寬、果色、莖色和主莖高,分別為56.88%、50.05%、42.35%、41.99%、38.88%、38.87%和31.84%;莖表茸毛的變異系數(shù)最小,為11.47%。遺傳多樣性指數(shù)(H′)變化范圍為0.20～2.06,其中最大的為果形,最小的為莖表茸毛葉刺;株高、主莖高、始花節(jié)位、莖色、果形、果長(zhǎng)、果寬、果形指數(shù)、商品果光澤、商品果色澤、熟性等10個(gè)性狀的遺傳多樣性指數(shù)均超過(guò)1.0,各性狀的變異系數(shù)及遺傳多樣性指數(shù)表現(xiàn)出不同程度差異,表明供試茄子材料表型具有較為豐富的遺傳多樣性。

表2 77份茄子種質(zhì)表型性狀變異分析Table 2 Variation analysis on phenotypic traits of 77 eggplant germplasms

2.1.2主成分分析

對(duì)18個(gè)表型性狀進(jìn)行KMO和Bartlett檢驗(yàn),KMO值為0.641(>0.5),偏相關(guān)性弱;Bartlett球型檢驗(yàn),p<0.1%,拒絕原假設(shè),說(shuō)明可進(jìn)行主成分分析。如表3所示,特征值大于1的主成分共有6個(gè),累計(jì)貢獻(xiàn)率為72.208%。第1主成分貢獻(xiàn)率為19.298%,包括果長(zhǎng)(0.935)、果形指數(shù)(0.924)和果形(0.934)、花冠色澤(0.550)和熟性(-0.464),這類性狀主要與果實(shí)形狀相關(guān),可歸納為果形因子;第2主成分貢獻(xiàn)率為15.543%,包含莖色(0.831)、果萼色(0.862)和商品果色澤(0.862),主要為顏色性狀,可歸納為色澤因子;第3主成分貢獻(xiàn)率為12.295%,包含株高(0.787)、主莖高(0.918)和始花節(jié)位(0.581),這類性狀主要與植株高度相關(guān),可歸納為高度因子;第4主成分貢獻(xiàn)率為9.359%,包含果萼刺(0.762)和商品果光澤(-0.689),可歸納為果實(shí)光滑因子;第5主成分貢獻(xiàn)率為8.339%,包括果寬(-0.658)、葉形(0.779)和葉刺(0.433),可歸納為葉片形態(tài)因子;第6主成分貢獻(xiàn)率為7.374%,為莖表茸毛(0.740)和葉色(-0.635),可歸納為茸毛因子;6個(gè)主因子較為全面地詮釋了18個(gè)表型性狀在供試茄子材料中變異的貢獻(xiàn)。

表3 表型性狀的主成分分析Table 3 Principal component analysis of phenotypic traits

2.1.3聚類分析

對(duì)18個(gè)表型性狀進(jìn)行聚類分析,在遺傳距離15.5處將77份茄子種質(zhì)資源分成四類,如圖1所示,不同的類群表型性狀具有一定的差異。

第Ⅰ類包含24份種質(zhì),全部為栽培茄,主要來(lái)自中國(guó)廣東、福建、四川等省份。本類群植株平均株高、主莖高最高,分別為88.5 cm和36.1 cm、始花節(jié)位平均10節(jié);果形指數(shù)平均為3.82,果實(shí)大部分為棒形或長(zhǎng)卵圓形,紫色果,果萼刺有刺及無(wú)刺各占一半、顏色主要為紫色;莖、花冠均多為紫色,葉色多深綠;熟性早熟和晚熟各占比37.5%和29.2%。

第Ⅱ類包含24份種質(zhì),全部為栽培茄,主要來(lái)源于中國(guó)浙江、廣東等省。本類群植株平均株高最低、主莖高最矮,分別為59.6 cm和20.8 cm,平均始花節(jié)位9節(jié),大部分種質(zhì)熟性偏早熟或早中熟。在遺傳距離10.0處可繼續(xù)細(xì)分為3個(gè)亞群:Ⅱ-1包含6份種質(zhì),全部為長(zhǎng)條形果,果實(shí)紫黑色或紫色、果萼刺紫色,花紫色,莖紫色;Ⅱ-2包含11份種質(zhì),大部分為棒形果,果實(shí)紫色為主,花紫色,莖主要為紫色;Ⅱ-3包含了7份種質(zhì),為長(zhǎng)棒形或長(zhǎng)條形果,果實(shí)白色、果萼刺綠色,莖綠色,花淡紫色或紫色。

第Ⅲ類包含來(lái)自中國(guó)江西、貴州、遼寧、甘肅等省份及意大利等國(guó)家的15份種質(zhì),均為栽培茄。本類群植株平均株高76.5 cm、主莖高26.4 cm、始花節(jié)位與類群Ⅱ一樣;果實(shí)指數(shù)1.1,種質(zhì)為扁圓形或圓形果,果實(shí)紫色或紫黑色,大部分有果萼刺,果萼多為紫色,葉色綠或深綠,莖紫色、少部分為綠色或紫黑色,熟性以早熟和中熟為主。

第Ⅳ類包含14份種質(zhì)資源,12份近緣野生茄和2份栽培茄,主要來(lái)自中國(guó)云南、海南、黑龍江等省份及日本、巴西和孟加拉國(guó)等國(guó)家。本類群整體表型性狀表現(xiàn)為圓形小果,商品果及老果色澤豐富、少數(shù)果面有斑紋,野生茄整體植株及葉片帶刺,多為腋生總裝花序、花冠色澤為白色或淡紫色,莖色多為綠色,熟性整體較晚,田間抗性好。根據(jù)各植株特征特性,在遺傳距離10.0處可繼續(xù)細(xì)分為兩個(gè)亞群,Ⅳ-1包含9份種質(zhì),植株長(zhǎng)勢(shì)中等,平均主莖高最低,為18.7 cm,部分果實(shí)果面有深縱溝,嫩果以綠色為主、少數(shù)有白色、紅色等,除近緣野生茄V 06 B 1264外都無(wú)葉刺;Ⅳ-2包含5份種質(zhì),植株長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng),植株平均株高、主莖高最高,分別為97.4 cm和38.8 cm,嫩果白綠色為主,植株及葉片大部分有刺,聚類結(jié)果可將栽培茄與近緣野生茄區(qū)分開(kāi)。

圖1 茄子77份材料18個(gè)表型性狀的Square euclidean distance樹(shù)狀圖Fig.1 Square euclidean distance dendrogram based on 18 phenotypic traits of 77 eggplant accessions

2.2 SSR多樣性分析

2.2.1SSR引物標(biāo)記多態(tài)性分析

用篩選出的50對(duì)多態(tài)性SSR引物對(duì)77份茄子種質(zhì)進(jìn)行檢測(cè),擴(kuò)增條帶分子量在50～500 bp之間,擴(kuò)增反應(yīng)共檢測(cè)到條帶252個(gè),其中多態(tài)性條帶139個(gè);平均每對(duì)標(biāo)記擴(kuò)增出5.040個(gè)條帶,多態(tài)性位點(diǎn)比例(P)為60.057%。不同引物對(duì)擴(kuò)增的條帶數(shù)為2～8條,多態(tài)性條帶1～7條。有研究表明,當(dāng)PIC>50%時(shí),該標(biāo)記為高度多態(tài)性標(biāo)記;25%

圖2 77份茄子材料SM遺傳相似系數(shù)的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA clustering diagram of SM genetic similarity coefficient of 77 accessions

2.2.2基于SSR的聚類分析

基于SSR分子標(biāo)記對(duì)供試材料進(jìn)行聚類分析,通過(guò)計(jì)算材料間SM遺傳相似系數(shù),以UPGMA方式獲得聚類圖(圖2)。由圖2可知,供試材料的遺傳相似系數(shù)在0.43～0.94之間,平均為0.78。在遺傳相似系數(shù)0.64處,將供試材料劃分為六個(gè)類群:第Ⅰ類群包含34份材料,全部為栽培茄,主要來(lái)自中國(guó)浙江、四川、廣東、江西等省份,果實(shí)多為長(zhǎng)棒形或條形,早熟類型材料居多。第Ⅱ類群中只含1份材料,即V 06 B 1297,引自孟加拉國(guó),花紫色、果實(shí)卵圓形、嫩果綠色有淺色花紋,無(wú)葉刺,果萼綠色帶刺。第Ⅲ類群包含28份材料,均屬栽培茄,主要來(lái)自中國(guó)遼寧、貴州、廣東、江西、四川等省份和意大利,以棒形果為主,熟性多為中熟。第Ⅳ類群包含4份近緣野生茄,即V 06 B 864、V 06 B 865、V 06 B 874、V 06 B 0140和1份栽培茄V 06 B 659;近緣野生茄3份來(lái)自中國(guó)云南、1份來(lái)自中國(guó)海南,栽培茄來(lái)自日本;5份種質(zhì)果形多為卵圓形或扁圓形,晚熟、抗性較好。第Ⅴ類群包含2份材料,即近緣野生茄V 06 B 0523和栽培茄V 06 B 0543,2份材料均來(lái)自我國(guó)遼寧,果萼均無(wú)刺、圓形果、晚熟,V 06 B 0523老熟果為紅色。第Ⅵ類群包含7份材料,全部為近緣野生茄,除1份來(lái)自中國(guó)云南、2份引自中國(guó)黑龍江外,其他均為國(guó)外引進(jìn)品種;主要表現(xiàn)為嫩果以綠色為主,老熟果多為紅色,腋生總狀花序,果實(shí)圓形或扁圓形、部分帶縱溝,種質(zhì)多為早熟、有果萼刺。

圖4 77份茄子種質(zhì)的群體遺傳結(jié)構(gòu)Fig.4 Population genetic structure of 77 eggplant germplasms

2.2.3基于SSR的群體結(jié)構(gòu)分析

利用Structure 2.3.4軟件對(duì)77份茄子材料的50個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)信息基于混合模型法進(jìn)行分析。參考Evanno等[21]的方法,引入ΔK值來(lái)確定最佳K值,當(dāng)K值隨ΔK值的變化出現(xiàn)明顯的峰值時(shí),則作為最優(yōu)群體數(shù)。當(dāng)K=6時(shí),將77份茄子材料劃分為PopⅠ、PopⅡ、PopⅢ、PopⅣ、PopⅤ和PopⅥ共6個(gè)亞群,不同亞群之間間隔明顯(圖3和圖4),各亞群所含種質(zhì)數(shù)與UPGMA聚類一樣,如PopⅠ為UPGMA類群Ⅳ、PopⅢ為UPGMA類群Ⅴ、PopⅥ為UPGMA類群Ⅰ。當(dāng)Q≥0.6時(shí),表明材料血緣較純;Q<0.6則認(rèn)為,該材料具有混合來(lái)源,遺傳背景較復(fù)雜[22]。本研究77份供試材料中96.11%的材料Q值≥0.6,說(shuō)明供試茄子種質(zhì)大部分遺傳背景單一,與其他亞群間基因交流較少;3份材料V 06 B 0367、V 06 B 1297和V 06 B 0912的Q值<0.6,具有混合來(lái)源,其中種質(zhì)V 06 B 0367含有較多的PopⅤ(36.5%)遺傳背景,V 06 B 1297和V 06 B 0912含有較多的PopⅡ(1.38%和1.54%)和PopⅣ(3.71%和2.71%)背景,均混合了不同亞群的遺傳成分,遺傳背景均比較復(fù)雜,在使用這些混合來(lái)源材料作親本時(shí)應(yīng)特別注意。

圖3 ΔK值隨K值的變化Fig.3 Change of ΔK value with K value

3 討 論

本研究77份茄子種質(zhì)的18個(gè)表型性狀變異系數(shù)為11.47%～78.46%、平均值為33.58%,略高于許競(jìng)生[24]報(bào)道的平均變異系數(shù)32%;遺傳多樣性指數(shù)(H′)變化范圍為0.20～2.06、平均值為1.24,與鄒敏等[25]研究結(jié)果(0.32～2.01,平均值為1.15)相一致,表明供試茄子材料表型多態(tài)性高、遺傳多樣性較為豐富,其中果形指數(shù)、果長(zhǎng)、果形、熟性、果寬等性狀表現(xiàn)出較高的多態(tài)性,但莖表茸毛、葉刺、葉形等性狀多態(tài)性較低。主成分分析將18個(gè)表型性狀歸納為6個(gè)主因子,這與齊東霞等[5]的研究結(jié)果一致,其中果實(shí)形態(tài)特征占主要成分、且其多態(tài)性高,說(shuō)明在種質(zhì)資源鑒定及遺傳改良方面應(yīng)注重果實(shí)相關(guān)指標(biāo)。

表型聚類與分子UPGMA聚類和群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果相似,均能區(qū)分開(kāi)栽培茄和近緣野生茄,這與Li等[25]、房超等[26]研究結(jié)果相一致。類群的劃分與茄子果形分類較為一致,如長(zhǎng)條形或長(zhǎng)棒形果,扁圓或圓形果大部分上各聚為一類群;與地理來(lái)源有一定相關(guān)性,但不完全一致,這與張鴻燕等[27]、林琿等[28]的研究結(jié)果相似。但也有研究表明,聚類結(jié)果與茄子地理來(lái)源無(wú)直接關(guān)系[5,7,29],張強(qiáng)強(qiáng)等[29]采用19對(duì)InDel分子標(biāo)記對(duì)46份茄子種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行了分析,認(rèn)為其聚類結(jié)果與地理來(lái)源關(guān)聯(lián)性不大。群體結(jié)構(gòu)分析可進(jìn)一步揭示種質(zhì)資源的遺傳組分,本研究供試材料中只有3份種質(zhì)Q<0.6、具有混合來(lái)源,在選用這些種質(zhì)進(jìn)行遺傳改良時(shí),應(yīng)充分考慮其遺傳構(gòu)成。

供試茄子材料的分子遺傳相似系數(shù)為0.43～0.94,平均值為0.78,說(shuō)明供試材料具有一定的遺傳多樣性,但材料間的遺傳相似性較高,遺傳基礎(chǔ)相對(duì)較窄,這與齊東霞等[5]、何倚劍等[30]、Ge等[31]的研究結(jié)果相一致。莊勇等[32]研究表明,通過(guò)常規(guī)手段,SolanumintegrifoliumPoir、SolanumaethiopicumL.等少數(shù)近緣野生種可獲得種間雜種,供試的12份近緣野生茄分子聚類和群體結(jié)構(gòu)分析中被劃分為三個(gè)類/亞群,其生物學(xué)形態(tài)特征分別表現(xiàn)出與黃水茄(SolanumincanumL.)、非洲剛果茄(SolanumaethiopicumL.)和紅茄(SolanumintegrifoliumPoir)表型相似,說(shuō)明可基于種間雜交滲透的方法將這些近緣野生茄種內(nèi)優(yōu)異等位基因進(jìn)行茄子品種遺傳改良,擴(kuò)寬遺傳基礎(chǔ)。