獨一味種子生活力最優(yōu)測定方法研究

李廷菊, 樊錦雅, 王成輝, 古 銳, 鐘世紅

(1.成都中醫(yī)藥大學藥學院, 成都 611137; 2.成都中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學院, 成都 611137; 3.西南民族大學藥學院, 成都 610041)

獨一味[Lamiophlomisrotata(Benth.) Kudo],又稱達巴、嘎果拉、野秦艽, 是唇形科獨一味屬多年生草本植物,為《中華人民共和國藥典》2020年版一部所收載,為常用大宗藏藥材,具有活血止血,祛風止痛之功效[1]。目前,以獨一味為原料的復方制劑涉及30余種,包括藏藥奇正消痛貼、獨一味丸、獨一味顆粒等。在市場需求日益龐大與野生資源逐漸萎縮的背景下,多地已經開展人工種植探索[2]。獨一味主要依靠種子繁殖,但野生種子質量卻參差不齊,導致種子萌發(fā)實驗耗時相對較長,為了快速了解種子質量,開發(fā)快速檢測方法已成為亟待解決的問題。

種子的生活力是指種子的潛在發(fā)芽能力或者種胚所具有的生命力,是種子預期能夠長成正常幼苗的潛在能力[3]。四唑染色法測定種子生活力具有簡單、方便、快速而準確的優(yōu)點,現已成為國際通用的種子檢測方法[4],但對獨一味種子生活力測定的方法優(yōu)化研究目前尚少見報道,胡瑩瑩等[5]僅對其生活力進行了初步研究,未摸索其最適染色條件。本研究采用單因素試驗和正交試驗對測定種子活力的5個相關影響因素進行研究,明確獨一味種子生活力檢測的最優(yōu)條件,以期能夠快速客觀地評價獨一味種子的萌發(fā)率,完善獨一味種子質量檢測方法,為無土育苗的種子處理和育苗研究提供參考。

1 試驗材料和方法

1.1 試驗材料

供試獨一味種子于2021年9月初采自四川省阿壩藏族羌族自治州阿壩縣分水嶺,經成都中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學院古銳教授鑒定為唇形科植物獨一味的種子,用簸箕、撞籠、木棒等工具抖種子,采用水選法除去癟種子,選取健康飽滿、無病蟲害、無機械損傷的種子作為供試種子,千粒重為3.070 g,保存于4 ℃冰箱內備用。

1.2 發(fā)芽率測定

取獨一味種子50粒,重復3次,用流水沖洗干凈后,放入0.5%高錳酸鉀溶液中消毒30 min,蒸餾水洗凈,用100 mg/L赤霉素(GA3)溶液浸泡24 h,然后置于直徑為90 mm的培養(yǎng)皿中,內墊2層濾紙,蓋上皿蓋保濕,25 ℃恒溫培養(yǎng)箱萌發(fā)。每日記錄種子萌發(fā)情況及發(fā)芽粒數,連續(xù)記錄直至連續(xù)7 d不再發(fā)芽為止。

1.3 TTC染色方法

1.3.1儀器和試劑

恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)皿,手術刀,鑷子,2,3,5-氯代三苯基四氮唑,pH=7.0磷酸緩沖液。

1.3.2TTC染色試劑的配制

磷酸緩沖溶液的配制參照雷慧霞等[6]的方法,先配制pH=7.0的磷酸緩沖溶液,再在此基礎上配制不同濃度的TTC溶液。

0.1% TTC溶液配制:稱取0.1 g 2,3,5-氯代三苯基四氮唑粉劑溶解于100 mL磷酸緩沖溶液,按此法分別配制0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、2.0%TTC溶液,于棕色瓶中4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3種子處理

取浸種后的種子25粒,3次重復,用手術刀劃開胚乳,取出發(fā)育良好、完整無損傷的胚,置于直徑90 mm的培養(yǎng)皿中,倒入配制好的染色液,以浸沒為度,在各培養(yǎng)皿上標記所用TTC溶液濃度,置于相應溫度的烘箱中暗光進行染色反應。待達到設定的培養(yǎng)時間時,取出培養(yǎng)皿,倒去染色液,用去離子水稍稍沖洗胚,然后將胚放置于濾紙上吸去多余水分,以白色濾紙為背景,根據胚染色深淺和面積大小判斷種子活力。

1.3.4最優(yōu)測定條件試驗

1) 單因素試驗

浸種溫度:采用浸種時間24 h,染色溫度25 ℃,染色時間6 h,TTC濃度為0.5%,浸種溫度分別設置20、25、30、35、40 ℃對種子進行染色,測定胚活力。

浸種時間:采用浸種溫度30 ℃,染色溫度25 ℃,染色時間6 h,TTC濃度為0.5%,浸種時間分別設置6、9、12、24、36 h對種子進行染色,測定胚活力。

染色溫度:采用浸種溫度30 ℃,浸種時間24 h,染色時間6 h,TTC濃度為0.5%,染色溫度分別設置20、25、30、35、40 ℃對種子進行染色,測定胚活力。

染色時間:采用浸種溫度30 ℃,浸種時間24 h,染色溫度25 ℃,TTC濃度為0.5%,染色時間分別設置1、3、6、9、12 h對種子進行染色,測定胚活力。

TTC溶液濃度:采用浸種溫度30 ℃,浸種時間24 h,染色溫度25 ℃,染色時間6 h,TTC溶液濃度分別為0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、2.0%對種子進行染色,測定胚活力。

2) 正交試驗

采用L16(45)5因素4水平正交設計(見表1),試驗以單因素試驗結果為依據,以浸種溫度、浸種時間、染色溫度、染色時間、TTC濃度等5個主要影響獨一味種子染色的因素進行正交試驗,每個因素設置4個水平。每組25粒,3次重復。

1.3.5染色后觀察

按《國際種子檢驗規(guī)程》判斷種子是否有生活力[7]:胚全部或絕大部分染成鮮紅色或大紅色為有生活力種子,只有少部分胚染色或大部分染色為淡粉色為低活力或無生活力種子。

種子生活力/%=(有生活力的種子數/供試種子總數)×100%。

表1 獨一味種子生活力測定正交試驗因素和水平Table 1 Determination of orthogonal test factors and levels by Lamiophlomis rotata viability

1.3.6數據分析

采用Excel 2019和SPSS 26.0軟件進行數據處理分析,p<0.05表示差異顯著,p<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 種子發(fā)芽率測定結果

經統(tǒng)計,獨一味種子萌發(fā)粒數分別為40粒、44粒、46粒,發(fā)芽率為86.67%。

2.2 單因素試驗結果

單因素試驗結果見表2。獨一味種子在不同浸種溫度下,胚的著色率隨浸種溫度升高而升高然后下降,在25 ℃時著色率最高,為80.0%,因此最佳浸種溫度為25 ℃;不同浸種時間處理時,胚的著色率依次為:浸種9 h>浸種24 h>浸種12 h>浸種6 h,即浸種9 h為最佳浸種時間;不同染色溫度處理時,胚的著色率隨染色溫度升高呈先增后減的趨勢,表明染色時染色溫度不宜過高,即適宜染色溫度為30 ℃(86.0%);不同染色時間處理時,胚的著色率隨染色時間的延長而增加,當染色時間達到12 h時,胚的著色率最高(91.7%),因此最佳染色時間在12 h左右;TTC濃度為0.1%、0.3%、0.5%時胚的著色率非常接近,但是當TTC濃度升到1.0%、2.0%時,著色率逐步降低,綜合考慮最佳TTC濃度應為0.1%。綜上所述,單因素條件下,最佳染色條件為浸種溫度25 ℃、浸種時間9 h、染色溫度30 ℃、染色時間12 h、TTC濃度0.1%。

表2 種子生活力測定單因素試驗結果Table 2 Single factor test results of seed viability determination

2.3 正交試驗結果

正交試驗結果見表3。在不同因素與水平組合處理下,獨一味種子生活力介于59.3%～89.3%之間,存在較大差異,其中以處理組合6(25 ℃浸種9 h、0.1%TTC、40 ℃染色9 h)和處理組合11(30 ℃浸種12 h、0.1% TTC、30 ℃恒溫箱染色12 h)染色效果最好,而處理組合1(20 ℃浸種6 h、0.1% TTC、25 ℃染色3 h)的種子生活力最低,染色較淺,效果最差。

2.4 極差分析

對正交試驗數據進行極差分析(見表3),比較5個因素對獨一味種子胚生活力的影響大小。5個因素的極差值R分別為:R浸種溫度=7.97,R浸種時間=8.95,RTTC濃度=10.00,R染色溫度=13.68,R染色時間=14.45,即它們對獨一味種子胚生活力的影響依次為:染色時間>染色溫度>TTC濃度>浸種時間>浸種溫度,其中染色時間和染色溫度對胚生活力影響最大,浸種溫度影響最小。

用各因素對應的極差最大值(Ⅰj、Ⅱj、Ⅲj、Ⅳj)來確定測定種子生活力的最適條件,值越大表示最適程度越高。浸種溫度對應的Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅲ1、Ⅳ1的值分別為75.08、81.20、73.23、80.13,可以看出Ⅱ2值最大,即25 ℃為最適浸種溫度;浸種時間對應的Ⅰ2、Ⅱ2、Ⅲ2、Ⅳ2值中Ⅲ2最大,即最適浸種時間為12 h;同理可知最適的TTC濃度、染色溫度、染色時間依次為0.1% TTC、40 ℃恒溫箱染色12 h,無處理組合相對應,與正交實驗分析結果進行對比,出于節(jié)約時間和成本的考慮,處理組合6較為適宜,可為最佳染色條件。

表3 種子生活力測定正交試驗結果Table 3 Orthogonal test results of seed viability determination

2.5 方差分析

方差分析結果見表4。試驗設定的5個因素,即浸種溫度、浸種時間、染色溫度、染色時間、TTC濃度的p值均小于0.01,表明每個因素對種子生活力均有影響。

表4 方差分析Table 4 Variance analysis

3 結論與討論

TTC染色檢測種子生活力對快速檢驗植物種子的質量具有重要的指導意義[7],因此,國際種子檢驗規(guī)程以及我國農作物種子檢驗規(guī)程均將其作為檢測種子生活力及種子活力的重要參考。通過種子發(fā)芽率來判斷獨一味種子的質量過程較長,從置盤至完全發(fā)芽需要15 d左右,而TTC染色能快速進行質量檢驗,大大縮短時間成本。本實驗中,處理6和處理11染色效果相近,并與統(tǒng)計分析結果最佳處理方法有部分重合,因此,從節(jié)約時間和節(jié)約成本的角度考慮[6,8],選擇組合6作為最佳染色組合。王改花等[9]用0.09 g/mL+2 mL H2O牛糞水浸液、200 mg/L GA3、0.1%細胞分裂素濃度處理種子,發(fā)芽率分別為93.33%、73.33%、86.67%;羅桂花、金蘭[10]研究表明,種子千粒重5.03 g、溫度25 ℃、50 mg/L GA3浸種24 h,發(fā)芽率為90.67%;胡瑩瑩等[5]研究表明,蒸餾水浸種24 h,發(fā)芽率為82.67%;以上實驗及本實驗測定的發(fā)芽率(86.67%)和生活力測定(89.3%)均較為接近,其差異在于萌發(fā)實驗所用種子飽滿度各不相同,部分種子雖果實飽滿但胚乳已經霉變,實際操作中不易發(fā)現,經激素處理后其發(fā)芽率有所增減,故采用TTC法快速測定獨一味質量具有一定的指導意義,在育苗實踐中可作為參考。

正交試驗設計常被廣泛應用于種子TTC染色的最佳因素和水平篩選優(yōu)化上。種子浸泡溫度、浸泡時間、TTC濃度、染色溫度和染色時間等5個因素均能顯著影響獨一味種子染色效果,影響依次為:染色時間>染色溫度>TTC濃度>浸種時間>浸種溫度。其中染色溫度和染色時間為首要影響因素,表明這兩個因素是決定獨一味種子TTC染色效果最關鍵的因素。這一結果與王志威等[11]、朱思宇等[12]、吳紅等[13]對種子的生活力檢測結果有相似之處,即染色溫度和染色時間對于種子染色更為重要,后續(xù)可根據需要優(yōu)化檢測方法。