膠體金免疫層析法在產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌目細(xì)菌檢測(cè)中的應(yīng)用評(píng)價(jià)*

陳善建,鄭芷怡,林宇嵐,陳艷淑,張維清,陳守濤,江麗,羅成爍,楊濱

(1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科,福州 350005;2.福建省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州 350005;3.福建醫(yī)科大學(xué)基因診斷研究中心,福州 350005)

碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌目細(xì)菌(carbapenem-resistantEnterobacterales, CRE)的感染與傳播是全球共同關(guān)注的問(wèn)題[1]。產(chǎn)碳青霉烯酶是CRE主要的耐藥機(jī)制,其中以A類(lèi)絲氨酸酶中的KPC酶、B類(lèi)金屬酶中VIM、IMP、NDM酶和D類(lèi)絲氨酸酶中的OXA-48-like酶最為常見(jiàn)[2]。針對(duì)不同酶型的CRE,用于治療的抗菌藥物可能不同,如頭孢他啶-阿維巴坦對(duì)產(chǎn)絲氨酸酶的菌株具有較強(qiáng)的生物學(xué)活性,而對(duì)產(chǎn)金屬酶的菌株無(wú)效[3]。因此,產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌目細(xì)菌(carbapenemase-producingEnterobacterales, CPE)的酶型分析對(duì)CRE的流行病學(xué)調(diào)查以及臨床治療的選擇有著重要的意義。

CRE血流感染可選擇的抗菌藥物有限,這類(lèi)感染往往死亡率較高,醫(yī)療資源投入更大[4]。傳統(tǒng)CRE血流感染的診斷方法耗時(shí)較長(zhǎng),無(wú)法滿足臨床CRE快速診療的需要?；贙PC、NDM、VIM、IMP和OXA-48 5種常見(jiàn)碳青霉烯酶開(kāi)發(fā)的膠體金免疫層析法操作簡(jiǎn)便,可于15 min內(nèi)進(jìn)行碳青霉烯酶的分型檢測(cè),并且具有較高的敏感性與特異性[5]。更重要的是,即使不對(duì)血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行轉(zhuǎn)種培養(yǎng),只要提取到足夠的細(xì)菌蛋白質(zhì),該方法也可對(duì)碳青霉烯酶進(jìn)行分型檢測(cè),這為CPE血流感染的快速診斷提供了新的思路。本研究旨在評(píng)估膠體金免疫層析法對(duì)CPE臨床分離株及血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中碳青霉烯酶的檢測(cè)及分型能力,從而為臨床CPE感染的快速診斷提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 收集2018年6月至12月福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床樣本分離的非重復(fù)腸桿菌目細(xì)菌,所有菌株均分別由基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀及Vitek 2全自動(dòng)細(xì)菌藥敏分析儀進(jìn)行鑒定與藥敏分析。通過(guò)篩選,納入其中41株對(duì)亞胺培南和/或美羅培南最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)值≥4 μg/mL且PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)攜帶碳青霉烯類(lèi)耐藥基因的CRE菌株與24株碳青霉烯類(lèi)敏感(亞胺培南和美羅培南MIC值≤1 μg/mL)的腸桿菌目細(xì)菌作為研究對(duì)象。肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705與大腸埃希菌ATCC 25922為質(zhì)控菌株。

1.2主要儀器及試劑 Microflex LT/SH基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(德國(guó)布魯克公司),Vitek 2全自動(dòng)細(xì)菌藥敏分析儀(法國(guó)生物梅里埃公司),VeritiTMDx PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司),DYY-7C轉(zhuǎn)印電泳儀、WD-9413B凝膠成像分析系統(tǒng)(北京六一生物科技有限公司),BACTECTMFX全自動(dòng)血培養(yǎng)儀(美國(guó)BD公司)。Taq酶、DNA Marker(上海生工生物公司),美羅培南藥敏紙片(英國(guó)Oxoid公司),NG-Test CARBA 5碳青霉烯酶檢測(cè)試劑盒(膠體金免疫層析法,上海復(fù)星醫(yī)藥股份有限公司),血培養(yǎng)樣本釋放劑NG-Test?Blood Culture Prep(長(zhǎng)沙中生眾捷生物技術(shù)有限公司)。

1.3PCR法擴(kuò)增碳青霉烯類(lèi)耐藥基因 采用煮沸法提取細(xì)菌DNA,并根據(jù)文獻(xiàn)[6]合成blaKPC、blaIMP、blaVIM、blaOXA-48-like、blaNDM的引物。PCR反應(yīng)總體系共25 μL,包括Taq PCR Mix預(yù)混液(2×)12.5 μL,10 μmol/L上、下游引物各1 μL,DNA模板1 μL,以滅菌去離子水補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃ 1 min,共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳并觀察條帶,挑選部分陽(yáng)性產(chǎn)物送上海生工生物公司在ABI 3730XL測(cè)序儀上進(jìn)行Sanger測(cè)序并分析基因型。

1.4改良碳青霉烯類(lèi)失活法(mCIM)和EDTA碳青霉烯類(lèi)失活法(eCIM)聯(lián)合試驗(yàn) 以1 μL接種環(huán)挑取一環(huán)菌落懸浮于2支裝有2 mL TSB肉湯的試管中,其中1支試管加入20 μL 0.5 mol/L EDTA溶液,另外1支不加。分別取1片美羅培南紙片(10 μg)浸入2支試管中,置于35 ℃的環(huán)境中溫育4 h±15 min。然后,取出美羅培南紙片貼于已涂布大腸埃希菌ATCC 25922懸液的MH平板上,35 ℃溫箱中溫育18～24 h后量取抑菌圈直徑。結(jié)果判讀根據(jù)2020版美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)M100指南標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.5膠體金免疫層析法檢測(cè)碳青霉烯酶 EP管中滴入5滴(約150 μL)提取緩沖液,用1 μL接種環(huán)挑取一環(huán)細(xì)菌樣本置于EP管中并混勻。然后用一次性移液管吸取100 μL制備好的混合液加入NG-Test CARBA 5檢測(cè)板的樣本孔中,15 min后根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)讀取結(jié)果。

1.6血培養(yǎng)陽(yáng)性建模及膠體金免疫層析法檢測(cè) 挑取待測(cè)菌落配制成0.5麥?zhǔn)蠞舛葐挝坏木鷳乙?隨后稀釋至菌液濃度為104CFU/mL[7]。取1 mL菌懸液注入BD BACTECTM血培養(yǎng)瓶中,然后置于血培養(yǎng)儀中培養(yǎng),直至報(bào)陽(yáng)。報(bào)陽(yáng)后的血培養(yǎng)以NG-Test?Blood Culture Prep商品化樣本釋放劑進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理步驟根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行:向EP管中加入1 mL報(bào)陽(yáng)血培養(yǎng)樣本與1 mL裂解緩沖液,渦旋儀混勻20 s,然后15 000 r/min離心1 min,棄上清液。以1 mL洗滌緩沖液重懸沉淀,渦旋混勻20 s后15 000 r/min離心1 min,棄上清液,得到細(xì)菌蛋白質(zhì)樣本。然后以膠體金免疫層析法檢測(cè)血培養(yǎng)樣品中的碳青霉烯酶。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 22.0軟件進(jìn)行。以PCR結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),分別計(jì)算膠體金免疫層析法及mCIM與eCIM聯(lián)合試驗(yàn)的敏感性和特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值,并與PCR方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行一致性分析:Kappa值<0.4,說(shuō)明一致性程度較差;Kappa值在0.4～0.75之間,說(shuō)明一致性程度尚可;Kappa值>0.75,說(shuō)明一致性程度較好。

2 結(jié)果

2.1PCR法檢測(cè)5種碳青霉烯類(lèi)耐藥基因結(jié)果 PCR擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn)41株CRE中有24株肺炎克雷伯菌與1株大腸埃希菌攜帶blaKPC基因;2株肺炎克雷伯菌、2株為大腸埃希菌、1株陰溝腸桿菌、1株弗勞地枸櫞酸桿菌與1株變棲克雷伯菌攜帶blaNDM基因;4株肺炎克雷伯菌攜帶blaIMP基因;4株肺炎克雷伯菌同時(shí)攜帶blaKPC+NDM基因,1株陰溝腸桿菌同時(shí)攜帶blaKPC+NDM+IMP基因;24株碳青霉烯類(lèi)敏感的腸桿菌目細(xì)菌均未檢出碳青霉烯類(lèi)耐藥基因。部分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

注:M,DNA marker(100～2 000 bp);1～3,blaKPC基因(798 bp);4～5,blaIMP基因(232 bp);6～7,blaNDM基因(621 bp)。

分別隨機(jī)挑取2個(gè)blaKPC基因、2個(gè)blaNDM基因以及2個(gè)blaIMP基因的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果通過(guò)網(wǎng)址https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi進(jìn)行比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)測(cè)序結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果一致。

2.2臨床分離株的表型檢測(cè)及膠體金免疫層析法檢測(cè)結(jié)果 41株CRE菌株的mCIM試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性,其中有11株eCIM試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性,30株eCIM試驗(yàn)結(jié)果為陰性。見(jiàn)表1。膠體金免疫層析法檢測(cè)結(jié)果與PCR擴(kuò)增結(jié)果完全一致。24株碳青霉烯類(lèi)敏感菌株的mCIM試驗(yàn)結(jié)果與膠體金免疫層析法檢測(cè)結(jié)果均為陰性。因此,mCIM試驗(yàn)的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值均為100.0%,與PCR方法結(jié)果的一致性較好,Kappa值為1.0。mCIM和eCIM聯(lián)合試驗(yàn)檢測(cè)絲氨酸酶的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值均為100.0%,與PCR方法結(jié)果的一致性較好,Kappa值為1.00;檢測(cè)金屬酶的敏感性為68.8%,特異性為100.0%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100.0%,陰性預(yù)測(cè)值為82.8%,與PCR方法結(jié)果的一致性尚可,Kappa值為0.73。膠體金免疫層析法的敏感性、特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值均為100.0%,與PCR結(jié)果完全一致,Kappa值為1.000。

表1 41株CRE的耐藥基因分型與表型檢測(cè)結(jié)果分析

2.3陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本的分型檢測(cè)結(jié)果 從65株腸桿菌目細(xì)菌中挑選53株菌株(見(jiàn)表2)構(gòu)建模擬血培養(yǎng)瓶并以膠體金免疫層析法進(jìn)行分型檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)膠體金免疫層析法分型結(jié)果與PCR分型結(jié)果完全一致。膠體金免疫層析法的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值與陰性預(yù)測(cè)值均為100%,與PCR方法的一致性程度好,Kappa值為1.000。

表2 53例血培養(yǎng)陽(yáng)性模擬標(biāo)本的膠體金免疫層析法和PCR法結(jié)果對(duì)比分析

3 討論

本研究以PCR法為參考標(biāo)準(zhǔn),分別評(píng)估m(xù)CIM和eCIM聯(lián)合試驗(yàn)以及膠體金免疫層析法對(duì)CPE的分型檢測(cè)能力。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)mCIM和eCIM聯(lián)合試驗(yàn)?zāi)軌驕?zhǔn)確區(qū)分單產(chǎn)絲氨酸酶或金屬酶,與Zhu等[8]的結(jié)果較為一致。然而,本研究中有5株同時(shí)攜帶blaKPC和blaNDM基因的CRE菌株被mCIM和eCIM聯(lián)合試驗(yàn)判斷為產(chǎn)絲氨酸酶,而金屬酶結(jié)果出現(xiàn)了漏檢。這表明mCIM與eCIM聯(lián)合試驗(yàn)對(duì)于同時(shí)產(chǎn)金屬酶和絲氨酸酶菌株的分型結(jié)果并不準(zhǔn)確,雖然溫育過(guò)程中EDTA能夠抑制金屬酶,但共存的絲氨酸酶仍然可以水解美羅培南,導(dǎo)致2個(gè)藥敏紙片抑菌圈的直徑相差≤4 mm,從而最終結(jié)果判定為產(chǎn)絲氨酸酶。此外,雖然mCIM和eCIM聯(lián)合試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、成本較低,但其過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng),且隨著同時(shí)產(chǎn)金屬酶和絲氨酸酶菌株分離率的增加,該方法在臨床上的應(yīng)用將表現(xiàn)出一定的局限性。

既往研究發(fā)現(xiàn),膠體金免疫層析法對(duì)5種主要碳青霉烯酶的檢測(cè)均有較高的敏感性與特異性[8-10]。本研究中該方法檢測(cè)結(jié)果與PCR法結(jié)果完全一致,與mCIM和eCIM聯(lián)合試驗(yàn)相比,該方法不僅能準(zhǔn)確區(qū)分絲氨酸酶與金屬酶,還能分析碳青霉烯酶的具體分型。對(duì)于同時(shí)攜帶2種及以上基因型的菌株,該方法也具有更高的準(zhǔn)確性。Yoon等[11]還比較了膠體金免疫層析法與Xpert Carba-R方法的檢測(cè)性能,發(fā)現(xiàn)2種方法對(duì)KPC、NDM、IMP以及OXA-48-like酶的敏感性與特異性一致,但膠體金免疫層析法的平均檢測(cè)時(shí)限明顯短于Xpert Carba-R方法(24 min vs 7 min)。此外,與Rapidec Carba NP方法及改良Hodge試驗(yàn)相比,膠體金免疫層析法不僅操作簡(jiǎn)便,檢測(cè)時(shí)限更短,且對(duì)OXA-48-like酶擁有更高的敏感性[12-13]。

傳統(tǒng)CRE血流感染的診斷常需要24～48 h甚至更久,無(wú)法滿足臨床快速診療的需要。膠體金免疫層析法可以直接分析預(yù)處理后的陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本,從而判斷血流感染的病原菌是否產(chǎn)生5種主要的碳青霉烯酶。本研究發(fā)現(xiàn)膠體金免疫層析法對(duì)血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本碳青霉烯酶分型檢測(cè)的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值均為100%,與Jenkins等的研究結(jié)果大致相同[10]。但本研究中的敏感性略高于部分研究[14-15],這可能是由于不同研究中菌株的構(gòu)成比不同造成的,也有可能是不同研究中陽(yáng)性血培養(yǎng)標(biāo)本預(yù)處理的方法不同導(dǎo)致。

本研究存在以下不足。首先,未納入blaVIM和blaOXA-48-like基因陽(yáng)性的菌株,且blaIMP基因陽(yáng)性菌株也較少,因此無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)估膠體金免疫層析法對(duì)這些基因型的檢測(cè)能力。但國(guó)內(nèi)CRE的流行株也主要以blaPKC與blaNDM基因?yàn)橹鱗16],因此本研究結(jié)果仍可為國(guó)內(nèi)臨床微生物實(shí)驗(yàn)室方法學(xué)的選擇提供一定的參考。其次,本研究主要評(píng)估膠體金免疫層析法在CPE檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值,而臨床上銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)的耐藥情況也不容忽視,后續(xù)研究需要擴(kuò)大樣本的收集范圍,進(jìn)一步評(píng)估該方法的分型檢測(cè)能力。