自制糖化血紅蛋白質(zhì)控品及其臨床應(yīng)用

王加平,王娜,傅美麗,李恒星,胡明

(東?？h人民醫(yī)院檢驗科,江蘇連云港222300)

糖化血紅蛋白A1c(glycated hemoglobin A1c,HbA1c)反映糖尿病患者2～3個月平均血糖水平,在糖尿病診斷、療效判斷等方面具有重要意義。我國糖尿病學(xué)會已將HbA1c列入糖尿病診斷指標(biāo)。為了減輕患者就醫(yī)費用,國家衛(wèi)生健康委積極推進(jìn)檢驗結(jié)果互認(rèn),互認(rèn)的基礎(chǔ)首先要保證檢驗結(jié)果的可靠性和一致性,質(zhì)量控制是實現(xiàn)這一目標(biāo)的重要手段。開展質(zhì)量控制的前提是要有良好的質(zhì)控品,目前市場上主要有伯樂、朗道、昆淶公司的HbA1c商品化質(zhì)控品,因其價格昂貴,也有實驗室用糖尿病患者血液自行制備質(zhì)控品[1-3]。本研究嘗試用健康體檢者靜脈血液標(biāo)本制備異常濃度的HbA1c質(zhì)控品用于室內(nèi)質(zhì)控,獲得了滿意的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1主要儀器與試劑 D-10糖化血紅蛋白儀及配套試劑(美國伯樂公司);邁瑞5390血細(xì)胞分析儀及配套試劑(深圳邁瑞公司);0.1 mol/L pH 6.8磷酸鹽緩沖液;牛血清清蛋白(新西蘭Prollat公司);葡萄糖(成都科隆化學(xué)品公司);海藻糖(羅恩試劑公司);Proclin 300防腐劑(美國Sigma公司)。

1.2標(biāo)本來源 收集2021年3月東?？h人民醫(yī)院健康體檢中心體檢健康者EDTA-K2抗凝靜脈血標(biāo)本,所有標(biāo)本HBV、HCV、HIV陰性。

1.3方法

1.3.1高值HbA1c生成 將EDTA-K2抗凝血標(biāo)本800×g離心15 min,棄上層血漿,用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞3次,將各管紅細(xì)胞混合。加入與紅細(xì)胞體積等量的1∶10稀釋0.1 mol/L pH 6.8磷酸鹽緩沖液,充分混勻。加入終濃度為555.6 mmol/L葡萄糖,37 ℃溫育48 h,HbA1c達(dá)到預(yù)期目標(biāo)濃度(13.0%～16.0%)后將血紅蛋白液放入透析袋中,置于0.05 mol/L pH 6.80磷酸鹽緩沖液中,4 ℃透析24 h,中間換緩沖液1次。

1.3.2不同水平糖化血紅蛋白質(zhì)控品配制 分別配制3個濃度水平質(zhì)控品,水平1(目標(biāo)值:5.0%～6.0%),體檢健康者血紅蛋白混合而成;水平2(目標(biāo)值:9.0%～10.5%)和水平3(目標(biāo)值:13.0%～16.0%),分別用水平1與1.3.1過程中生成的高值HbA1c混合而成,血紅蛋白濃度控制在100～120 g/L。在配制完成的3個濃度水平血紅蛋白液中分別加入保護(hù)劑牛血清清蛋白(20～60 g/L)、海藻糖(79.2～264.3 mmol/L)、Proclin 300(0.01%),分裝后-20 ℃冰凍保存。

2 實驗與結(jié)果

2.1葡萄糖濃度及溫育時間對HbA1c生成的影響 在血紅蛋白液中分別加入終濃度55.6、277.8、555.6、833.3、1 111.1 mmol/L葡萄糖,觀察葡萄糖濃度及溫育時間對體外HbA1c生成的影響,結(jié)果見表1,葡萄糖濃度≤55.5 mmol/L時,37 ℃溫育24～72 h,HbA1c幾乎沒有變化;葡萄糖終濃度555.6 mmol/L時,溫育48 h后HbA1c即達(dá)16%(預(yù)期目標(biāo)值13.0%～16.0%),溫育72 h,HbA1c穩(wěn)定不變,但血紅蛋白顏色變?yōu)樽睾稚?綜合考慮,最終選擇葡萄糖濃度為555.6 mmol/L,溫育時間48 h。

表1 不同終濃度葡萄糖溫育24、48、72 h后HbA1c濃度

2.5長期穩(wěn)定性觀察 將自制的質(zhì)控品作為室內(nèi)質(zhì)控品進(jìn)行臨床應(yīng)用1年,按照常規(guī)質(zhì)控方法,每天測定1次,結(jié)果見表2。水平1、水平2、水平3的月平均CV分別為2.46%～3.12%、1.63%～2.11%、1.25%～2.87%,年平均CV分別為2.97%、1.92%、2.25%。與初始檢測值(5.7%、9.0%、13.6%)比較,月平均值偏倚分別為0～1.75%、-1.11%～1.11%、-0.73%～0.73%,偏倚均<1/2 TEa(符合美國CLIA′88可接受性能指標(biāo)規(guī)定)。

表2 長期穩(wěn)定性觀察

3 討論

目前臨床上使用的質(zhì)控品大多為商品化凍干品,國內(nèi)也有自制質(zhì)控品的報道[3-4],其由臨床上HbA1c正?；虍惓?biāo)本直接制備,且最多只有2個水平,大多為1個水平。HbA1c是葡萄糖與血紅蛋白β珠蛋白鏈末端纈氨酸殘基結(jié)合生成的穩(wěn)定化合物[5]。根據(jù)此原理,本研究通過在健康體檢者靜脈血標(biāo)本中加入高濃度葡萄糖溫育方法獲得高值HbA1c,結(jié)果表明,HbA1c生成與葡萄糖濃度和溫育時間相關(guān),葡萄糖終濃度為555.6 mmol/L時,溫育48 h HbA1c即達(dá)到預(yù)期目標(biāo)值。隨著葡萄糖濃度和溫育時間的延長,HbA1c濃度會略有增加,但血紅蛋白的色澤變?yōu)楹稚?會影響后續(xù)的質(zhì)控品保存,因此本研究最終選擇葡萄糖終濃度為555.6 mmol/L,溫育時間48 h。

質(zhì)控品的重要質(zhì)量指標(biāo)是開瓶穩(wěn)定性、瓶間均勻性和長期保存穩(wěn)定性,本研究自制質(zhì)控品-20 ℃冰凍保存至少可以穩(wěn)定1年,開瓶后4 ℃保存至少穩(wěn)定14 d,瓶間均勻性CV<2%,反復(fù)凍融8次不影響結(jié)果,通常的蛋白類質(zhì)控品應(yīng)避免反復(fù)凍融,由于本研究在質(zhì)控品中加入保護(hù)劑海藻糖,有效地保護(hù)了凍融對HbA1c的影響,因而更方便基層工作量較小的醫(yī)院使用。

采用健康體檢者血標(biāo)本制備異常值糖化血紅蛋白,相較于國內(nèi)報道的直接用糖尿病患者標(biāo)本來講,標(biāo)本更易得到,來源更方便,方法更簡單,也便于推廣使用。在制備的質(zhì)控品中加入適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑和防腐劑,延長穩(wěn)定時間,能夠更好地滿足臨床使用,同時也可以降低成本。