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    猴樟CbP5CR基因克隆及生物信息學(xué)分析

    2023-05-18 17:22:10黃東莉何敏紀(jì)洪玲陸林燕嚴(yán)功力張穎張麗華
    安徽農(nóng)學(xué)通報(bào) 2023年4期
    關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)錄因子生物信息學(xué)分析基因克隆

    黃東莉 何敏 紀(jì)洪玲 陸林燕 嚴(yán)功力 張穎 張麗華

    摘要 為研究猴樟CbP5CR蛋白的序列結(jié)構(gòu)和功能,克隆猴樟CbP5CR基因CDS序列,進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明,克隆得到的序列具有一個(gè)810 bp完整的ORF框,編碼269個(gè)氨基酸,與沉水樟中收錄的RWR74447.1基因序列一致性達(dá)98.88%,系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果表明,猴樟CbP5CR蛋白具有較高的保守性;猴樟CbP5CR蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,CbP5CR蛋白具有PLN02688家族結(jié)構(gòu)域,CbP5CR蛋白化學(xué)分子式為C1242H2015N345O375S7,相對(duì)分子量28.01 kD,理論等電點(diǎn)7.03,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,不存在氨基酸無序化區(qū)域,為脂溶性和親水性蛋白,磷酸化氨基酸位點(diǎn)有45個(gè),亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)為細(xì)胞質(zhì)。

    關(guān)鍵詞 猴樟;轉(zhuǎn)錄因子;基因克??;生物信息學(xué)分析

    中圖分類號(hào) S792? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

    文章編號(hào) 1007-7731(2023)04-0022-04

    猴樟(Cinnamomun bodinieri Levl.)是我國重要的綠化樹種、經(jīng)濟(jì)樹種和林用樹種,主要分布于我國南方地區(qū)。近幾年,猴樟產(chǎn)業(yè)因其生長速度快、抗性強(qiáng)而迅速發(fā)展起來[1],并逐漸向我國長江以北地區(qū)推廣應(yīng)用,而北方地區(qū)堿性土壤環(huán)境限制了猴樟的生產(chǎn)栽培。植物耐堿性能與其根系適應(yīng)堿脅迫的策略密切相關(guān),包括膜穩(wěn)定性、抗氧化系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)和離子平衡等方面,脯氨酸的生物合成和積累是植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫的主要方式,逆境脅迫下可以作為滲透調(diào)節(jié)物防止細(xì)胞脫水,還是生物大分子的保護(hù)劑和羥基清除劑,同時(shí)還可為植物從脅迫條件恢復(fù)而提供氮源、碳源和還原劑,耐堿性強(qiáng)的品種含有更高的脯氨酸含量[2]。以往研究認(rèn)為,在多種脅迫條件下P5CR、P5CS、δ-OAT基因的表達(dá)量增加,而PDH基因的表達(dá)量降低,脯氨酸積累[3],但植物體內(nèi)脯氨酸的積累與植物的抗逆性之間的關(guān)系在不同植物之間存在差異,其在賦予耐受性方面的實(shí)際作用仍然存在爭(zhēng)議。該研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆出猴樟脯氨酸合成關(guān)系酶基因序列,并分析其特性,以期為猴樟耐堿性機(jī)理研究提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    試驗(yàn)材料為耐堿猴樟變種2年生種苗,于2019年2月上旬播種,2021年4月上旬進(jìn)行移栽。于2022年3月10日取猴樟枝條頂部幼嫩芽片液氮速凍后,用RNAperp Pure Plant Kit(天根,北京)試劑盒提取材料的總RNA,按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa,大連)方法去除基因組DNA后,用TR Prime Mix(random primer)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),獲得的cDNA產(chǎn)物作為模板。

    1.2 基因克隆

    根據(jù)猴樟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),獲得在耐堿性猴樟變種葉片中調(diào)控脯氨酸合成的關(guān)鍵酶基因序列,使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)CDS擴(kuò)增引物[F(5'—3'):ATGGCAACAGCAGAGACG;R(5'—3'):CTAGAGAGTGTGCTACTC],PCR反應(yīng)采用25 μL體系[4],反應(yīng)產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞(TSINGKE,北京),挑單菌落進(jìn)行PCR鑒定,將PCR陽性菌落培養(yǎng)后,提取質(zhì)粒送擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

    1.3 生物信息學(xué)分析

    通過ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)將猴樟CbP5CR基因翻譯成蛋白序列;利用NCBI的CCD工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè);利用Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)氨基酸序列的理化性質(zhì)和等電點(diǎn)進(jìn)行分析;采用Prot Scale(https://web.expasy.org/protscale/)進(jìn)行蛋白質(zhì)的親/疏水性預(yù)測(cè);采用PRABI(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl)在線軟件進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析;利用Fold Index 軟件(https://fold.weizmann.ac.il/fldbin/findex)分析氨基酸折疊無序化特性分析;采用SoftBerry ProtComp 9. 0(http://linux1.softberry.com/)和Cell-PLoc 2.0在線分析軟件(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位;采用Swiss-Model(http://www.Swissmodel.expasy.org)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu),并利用PyMOL軟件生成三級(jí)結(jié)構(gòu)模型;利用MEGA 7.0作出與CbP5CR的CDS序列同源性較近的物種序列進(jìn)化樹。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 猴樟CbP5CR基因的克隆與重組載體構(gòu)建

    根據(jù)克隆后的凝膠電泳圖片(圖1),以猴樟的cDNA為模板,通過PCR擴(kuò)增得到1條約900 bp的條帶,片段大小與預(yù)期一致,通過測(cè)序得到長864 bp的CDS序列。PCR產(chǎn)物送公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與沉水樟中收錄的RWR74447.1基因進(jìn)行比對(duì),序列一致性高達(dá)98.88%,具備P5CR的功能。將克隆獲得的基因編碼蛋白通過NCBI BLAST Protein與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),根據(jù)比對(duì)結(jié)果顯示,所克隆得到的序列具有一個(gè)810 bp完整的ORF框,推導(dǎo)編碼269個(gè)氨基酸,將獲得的目的基因命名為CbP5CR。

    2.2 猴樟CbP5CR蛋白的生物信息學(xué)分析

    2.2.1 猴樟CbP5CR蛋白的理化性質(zhì)分析。利用Protparam軟件對(duì)猴樟CbP5CR蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析,猴樟CbP5CR蛋白相對(duì)分子量28.01 kDa,理論等電點(diǎn)7.03,表明CbP5CR基因編碼蛋白為中性,化學(xué)分子式為C1242H2015N345O375S7,原子總數(shù)為3 984,不穩(wěn)定指數(shù)值為37.12,不穩(wěn)定系數(shù)大于40時(shí)為不穩(wěn)定蛋白,因而該蛋白質(zhì)穩(wěn)定。脂溶指數(shù)為99.85,CbP5CR基因編碼蛋白為脂溶性蛋白,帶負(fù)電荷的殘基(asp+glu)總數(shù)為26,帶正電荷的殘基(arg+lys)總數(shù)為26。利用NCBI的CCD工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè),結(jié)果表明(圖2),CbP5CR蛋白具有PLN02688家族結(jié)構(gòu)域,具備脯氨酸合成酶功能。利用Prot Scale(https://web.expasy.org/protscale/)對(duì)猴樟CbP5CR基因編碼蛋白的親水性進(jìn)行分析(圖3),總平均親水性值(GRAVY)為0.184,預(yù)測(cè)該蛋白為親水性蛋白。通常認(rèn)為,氨基酸分值越低親水性越強(qiáng),分值越高疏水性越強(qiáng),猴樟CbP5CR基因編碼蛋白各氨基酸序列中第43、44位氨基酸分值最低為-2.878,親水性值最強(qiáng);第99位氨基酸分值最高,為2.544,疏水性最強(qiáng),就整體分析而言,蛋白序列中36~49、105~115、139~150、218~233位氨基酸均為連續(xù)排列的親水性氨基酸,推測(cè)猴樟CbP5CR基因編碼蛋白為親水性蛋白。

    2.2.2 猴樟CbP5CR蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果表明該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。根據(jù)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)結(jié)果(圖4),該蛋白組成中135個(gè)氨基酸(50.19%)為α-螺旋、30個(gè)氨基酸(11.15%)為延伸主鏈,104個(gè)氨基酸(38.66%)為隨機(jī)卷曲,因而猴樟CbP5CR主要由α-螺旋和隨機(jī)卷曲組成;利用Fold Index對(duì)猴樟CbP5CR蛋白進(jìn)行氨基酸序列折疊無序化分析(圖5),結(jié)果表明,該蛋白不存在氨基酸無序化區(qū)域,折疊無序化指數(shù)為0.299。利用Net Phos 3.1(https://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)進(jìn)行蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)(圖6),該多肽鏈0.500以上分值的氨基酸位點(diǎn)為45個(gè),其中包含32個(gè)絲氨酸(S)、11個(gè)蘇氨酸(T)和2個(gè)酪氨酸(Y)磷酸化位點(diǎn)。根據(jù)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果和同源建模分析(圖7),CbP5CR編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與5bse.1.A的氨基酸序列一致性達(dá)68.28%,5bse.1.A序列的編碼蛋白為Pyrroline-5-carboxylate reductase(P5CR)。

    2.2.3 猴樟CbP5CR蛋白序列同源比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹。在NCBI數(shù)據(jù)庫中對(duì)猴樟CbP5CR蛋白序列進(jìn)行blastp比對(duì),根據(jù)結(jié)果下載比對(duì)得分較高的氨基酸序列,再通過MEGA 7.0軟件構(gòu)建CbP5CR蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖8)。結(jié)果表明,猴樟CbP5CR蛋白在進(jìn)化上與同為樟科樟屬的沉水樟聚為一類,說明其親緣關(guān)系最近,樟科樟屬植物中該類蛋白具有較高的保守性。猴樟CbP5CR蛋白進(jìn)化樹中大概分3類,其中猴樟與沉水樟歸為一類,其次是絨毛狀煙草、煙草、番茄、蒂羅花、黃連、博羅回和罌粟歸為一類,與猴樟親緣關(guān)系更遠(yuǎn)的石刁柏、黃石斛、深圳擬蓮、薯蕷、小果野芭蕉、油棕和姜?dú)w為一類。

    3 結(jié)論與討論

    脯氨酸是植物體內(nèi)水合能力最強(qiáng)的氨基酸,具有分子量小、對(duì)細(xì)胞無毒副作用等特征,外源施用脯氨酸能夠促進(jìn)植物光合能力和水分利用能力[5],還能通過誘導(dǎo)植物抗氧化酶活性提高抗鹽堿脅迫能力。在高等植物體內(nèi),脯氨酸通過谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑在細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和線粒體中合成,在線粒體內(nèi)進(jìn)行降解,吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)、鳥氨酸-δ-氨基轉(zhuǎn)移酶(δ-OAT)和脯氨酸脫氫酶(ProDH)基因被認(rèn)為是關(guān)鍵基因[2]。該研究結(jié)果表明,克隆得到的序列具有一個(gè)810 bp完整的ORF框,編碼269個(gè)氨基酸,與沉水樟中收錄的RWR74447.1基因序列一致性達(dá)98.88%,系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果表明,猴樟CbP5CR蛋白具有較高的保守性;猴樟CbP5CR蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,CbP5CR蛋白具有PLN02688家族結(jié)構(gòu)域,CbP5CR蛋白化學(xué)分子式為C1242H2015N345O375S7,相對(duì)分子量28.01 kDa,理論等電點(diǎn)7.03,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,不存在氨基酸無序化區(qū)域,為脂溶性和親水性蛋白,磷酸化氨基酸位點(diǎn)有45個(gè),亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)為細(xì)胞質(zhì),研究結(jié)果為進(jìn)一步研究猴樟脯氨酸代謝調(diào)控耐堿性機(jī)理提供了基礎(chǔ)。

    4 參考文獻(xiàn)

    [1] 韓浩章,張麗華,王曉立,等.猴樟與香樟幼苗的耐鹽堿性比較[J].西部林業(yè)科學(xué),2019,48(5):7-14.

    [2] 邢曉琳.外源脯氨酸和水楊酸對(duì)鹽堿脅迫下紫花苜蓿生理特性及抗氧化酶基因表達(dá)的影響[D].沈陽:遼寧大學(xué),2020.

    [3] KIARASH J G,AMIN B,MALIHE A,et al.Effects of salinity stress on proline content and expression of Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthase and vacuolar-type H+ subunit E genes in wheat[J].Plant Genetic Resources,2020,18(5):334-342.

    [4] 韓浩章,張麗華,李素華,等.猴樟CbP5CS1基因克隆及表達(dá)載體構(gòu)建[J/OL].分子植物育種:1-9.http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20210720.1751.012.html.

    [5] NOREEN S, AKHTERM S, YAAMIN T, et al. The ameliorative effects of exogenously applied proline on physiological and biochemical parameters of wheat (Triticum aestivum L.) crop under copper stress condition[J]. J. Plant Interact,2018,13:221-230.

    (責(zé)編:王慧晴)

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