石榴離體再生體系建立及遺傳轉(zhuǎn)化技術研究進展

劉春 儲思媛 李錦錦

摘要 石榴果實營養(yǎng)豐富，樹形優(yōu)美，花色鮮艷，果形奇特，是一種兼具食用觀賞價值的經(jīng)濟樹種，在國內(nèi)深受大眾喜愛。我國石榴種質(zhì)資源豐富，栽培歷史悠久。然而近年來由于栽培技術落后，生產(chǎn)管理粗放，導致品種退化、樹勢減退。隨著生活水平提高和經(jīng)濟的發(fā)展，人們對石榴的品質(zhì)要求日益提高，因而培育優(yōu)質(zhì)果苗，篩選優(yōu)良品種成為石榴生產(chǎn)的必然趨勢。采用離體培養(yǎng)技術及構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化體系，對培育脫毒苗和選育優(yōu)良品種提供了技術手段。通過對國內(nèi)外研究成果進行收集分析，對石榴離體培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化技術、現(xiàn)狀、問題分析及未來研究發(fā)展趨勢等進行闡述，以期為開展石榴的科學研究和生產(chǎn)實踐提供理論基礎和科學依據(jù)。

關鍵詞 石榴；離體培養(yǎng)；再生體系；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號 S665.4? ?文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）04-0017-05

Research Progress on Establishment of in Vitro Regeneration System and Genetic

Transformation Technology of Pomegranate

LIU Chun? ?CHU Siyuan? ?LI Jinjin

（College of Life Sciences， Huaibei Normal University， Huaibei Anhui 235000）

Abstract Pomegranate has rich nutrition， beautiful tree shape， bright colors and peculiar fruit shape.It is an economic tree species with edible and ornamental value. It is deeply loved by the public in China.China is rich in pomegranate germplasm resources and has a long history of cultivation.However， in recent years， due to backward cultivation techniques and extensive production management， varieties have degenerated and tree vigor has decreased.With the improvement of living standards and economic development， people's requirements for the quality of pomegranate are increasing.Cultivating high quality seedlings and screening excellent varieties have become the inevitable trend of pomegranate production. In vitro culture technology and genetic transformation system were used to provide technical means for cultivating virus-free seedlings and breeding excellent varieties. By collecting and analyzing the research results at home and abroad， this paper expounds the in vitro culture and genetic transformation technology， current situation， problem analysis and future research development trend of pomegranate， in order to provide theoretical basis and basis for scientific research and production practice of pomegranate.

Keywords pomegranate; in vitro culture; regeneration system; genetic transformation

石榴（Punica granatum L.）屬石榴科石榴屬植物，是一種深受人們喜愛的水果，綜合應用價值極高[1]。其花期一般在5—6月，果期大多為9—10月。適應于溫暖的環(huán)境，對土壤要求不嚴，總體生存能力較強，在溫帶與熱帶地區(qū)均有種植。我國栽培歷史可上溯至漢代，據(jù)陸鞏記載是張騫從西域引入。在中國以江蘇、河南等地種植面積較大，有一些廣為人知的優(yōu)良品種，如“紅石榴”“河陰石榴”“黃里石榴”等。其中，“黃里石榴”是安徽省淮北市的特產(chǎn)，色澤光鮮，味道鮮美可口，深受人們歡迎。

石榴是一種漿果，果實晶瑩剔透，顆粒飽滿，宛如紅寶石，味道酸甜可口，含有豐富的糖類、維生素C等，可以為人們補充身體所需能量。石榴中還富含多酚類與黃酮類物質(zhì)，具有一定的抗衰老和抗氧化功效。石榴全身是寶，花、葉、果、果皮、果核均可入藥。相關研究表明，石榴對提高老年人的免疫力，維持身體健康具有一定的作用。同時，石榴花、果、葉優(yōu)美，具有較高的觀賞價值。

過去由于國內(nèi)長期關注蘋果、梨等大宗水果的發(fā)展，而對石榴的研究起步較晚，所以總體水平相對落后，影響了石榴優(yōu)良品種的合理開發(fā)和資源的優(yōu)化配置。此外，在石榴栽培過程中由于栽培技術落后，管理粗放，樹體易感染病害，主要包括白腐病、黑痘病、炭疽病，從而導致樹勢減退，品種退化。隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展和人們生活水平的提高，對石榴的品質(zhì)需求日益增加，培育壯苗和篩選優(yōu)良品種已成為石榴生產(chǎn)的必然趨勢。采用離體培養(yǎng)技術及構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化體系，對培育脫毒苗和選育優(yōu)良品種具有重要的意義。筆者通過查閱相關文獻資料，對近年來有關石榴離體培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化的研究了進行總結(jié)分析，并對其發(fā)展前景做出了展望，以期為石榴育種研究提供一定的理論基礎和科學依據(jù)。

1 石榴的離體培養(yǎng)研究

1.1 外植體選擇

在石榴組培生產(chǎn)過程中，外植體的選擇非常廣泛，目前國內(nèi)外以莖尖、莖段、葉柄、成熟葉片、嫩葉等為外植體進行組織離體培養(yǎng)，先后獲得了成功。閆志佩[2]以新梢莖尖為外植體快速繁殖獲得無毒試管苗，成功挽救了軟籽石榴瀕危品種；程江華[3]通過對莖尖、莖段、成熟葉片、真葉、上胚軸、種子7種外植體的試驗得出葉片是最佳的外植體；陳海燕[4]以靠近基部的萌生枝條、根蘗等作為外植體培養(yǎng)建立了泰山紅石榴快速繁殖體系。外植體的選擇對試驗結(jié)果有著關鍵作用，必須按照一定的依據(jù)選擇合適的外植體進行試驗。

1.2 外植體存活

影響外植體存活的因素有很多，如光照、溫度、濕度、試驗操作技術、培養(yǎng)基等培養(yǎng)條件。研究表明，光照在石榴的組織培養(yǎng)中起著至關重要的作用，不同光照條件下，外植體的生理狀態(tài)表現(xiàn)出顯著差異，直接影響后續(xù)的生長分化；溫度決定了外植體的呼吸速率，溫度過高或者過低都會使其組織代謝紊亂，試驗中須根據(jù)實際情況合理調(diào)控溫度；濕度的影響主要在于培養(yǎng)容器和培養(yǎng)室的濕度條件，濕度過大會引起外植體發(fā)生褐變，濕度過低會導致外植體生理性脫水，根據(jù)生長環(huán)境適度的調(diào)整適度對外植體的培養(yǎng)至關重要。

此外，試驗員的操作技術也影響著外植體的生長，如切取外植體的過程中，應盡可能地減少傷口面積，從而有效防止褐變的產(chǎn)生[5]；對外植體的消毒是否徹底，也決定了培養(yǎng)的效果。研究表明，試驗前應先將外植體用流水沖洗30 min，再使用70%～75%乙醇浸泡1～2 min，最后用0.1%氯化汞或0.5%NaClO等進行處理，達到消毒作用[6]。材料不同，消毒的方法有所變化。

1.3 愈傷組織的誘導分化

在石榴的離體培養(yǎng)中，愈傷組織的形成與分化尤為重要。其中最關鍵的影響因素是植物生長調(diào)節(jié)劑，不同種類、濃度與配比的生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織的誘導與分化作用差異性較大。目前，誘導愈傷組織常用的植物生長調(diào)節(jié)劑是生長素和細胞分裂素。生長素一般使用NAA、IBA、IAA等，而細胞分裂素一般有KT、ZT、6-BA等，其中以6-BA的應用最為廣泛，常用濃度為1.0～3.0 mg/L[7]。

篩選合適的培養(yǎng)基在一定程度上影響了愈傷組織的分化，程江華[3]通過試驗得出結(jié)論，石榴愈傷組織誘導的最佳激素組合是：MS（基本培養(yǎng)基）+1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA。除此之外，蔗糖濃度、pH、滅菌措施、溫度、光照等因素也在不同程度上影響著愈傷組織的誘導與分化。如果培養(yǎng)基中沒有蔗糖，一般情況下就不能誘導產(chǎn)生愈傷組織，通常蔗糖濃度在30～40 g/L，其生長狀況良好，濃度過大或過小都會產(chǎn)生不良后果；pH大小會導致細胞滲透壓發(fā)生變化，從而影響愈傷組織的生長。較多相關文獻表明，乙醇與升汞的有機組合是非常有效的滅菌方法，合理的滅菌組合將有利于石榴愈傷組織的誘導與分化；培養(yǎng)溫度一般設置在25 ℃左右有利于愈傷組織的形成[8]。

1.4 組培苗誘導生根

在石榴的生根誘導階段，培養(yǎng)基的選擇至關重要，相關文獻報道，試驗中采用較多的為MS基本培養(yǎng)基，細胞分裂素和生長素的濃度要根據(jù)不同的情況適當控制。培養(yǎng)基中的激素濃度變化對生根率產(chǎn)生了一定的影響。生長素對外植體的生長可以起到促進作用，其濃度一般比細胞分裂素濃度低。陶秀冬等[9]在石榴試管苗的生根誘導試驗中發(fā)現(xiàn)，當IBA的濃度較低時，生根率也較低，所以應該適當增加培養(yǎng)基中IBA的濃度，以提高石榴的生根率。張愛民[10]試驗發(fā)現(xiàn)，試管苗的生根率和培養(yǎng)基中的NAA濃度相關，若培養(yǎng)基中無NAA或NAA濃度過低，生根數(shù)也會相對較少。同時，大量研究表明，如果能在培養(yǎng)基中加入一些低濃度的蔗糖，將有利于生根，其濃度范圍一般在1.0%～3.0%。整個生根誘導過程也受到諸多因素的影響，如溫度、光照等。一般情況下，石榴組培苗的誘導生根會采用黑暗交替培養(yǎng)的方式，黑暗下培養(yǎng)可以刺激生根，也有利于植株內(nèi)源生長素合成，培養(yǎng)溫度大多控制在25 ℃左右。

1.5 組培苗移栽

組培苗在移栽過程中，其成活率的高低受到不同因素的影響，如組培苗的質(zhì)量、移栽的基質(zhì)、移栽技術管理等。苗質(zhì)量越好，成活率越高；移栽基質(zhì)不同，成活率也有差異，移栽前可先進行試驗。大量研究表明，基質(zhì)的透氣性將影響栽培苗的移栽成活率。除此之外，試管苗的移栽成活率與水分、溫度、光照等外界環(huán)境關系密切，移栽最適溫度大多在25 ℃左右，若光照過強會灼燒幼苗，應適當進行遮陰處理[11]。栽培基質(zhì)需事先消毒，一般可噴施5%高錳酸鉀溶液，盡可能防止病蟲害發(fā)生。移栽之前可先進行煉苗，讓植株逐漸適應外部環(huán)境，期間給予適當?shù)臓I養(yǎng)液，待幼苗強壯后再進行移栽，可大幅度提高存活率[12]。因此，試管苗移栽過程應綜合考慮各方面因素，以保證苗木的成活率。

2 石榴的遺傳轉(zhuǎn)化研究

2.1 石榴遺傳轉(zhuǎn)化的方法

遺傳轉(zhuǎn)化技術在石榴育種方面應用廣泛，試驗中常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法主要有農(nóng)桿菌介導與DNA直接導入2種，后者又能細分為物理誘導法（基因槍法、注射法、花粉管通道法等）與化學誘導法（如PEG）[13]。

現(xiàn)階段，農(nóng)桿菌介導法在石榴的遺傳轉(zhuǎn)化方面應用最廣，技術成熟，受到研究者的青睞。應用最多的是根癌農(nóng)桿菌，其作用原理是將農(nóng)桿菌中的Ri質(zhì)?；騎i質(zhì)粒當作基因轉(zhuǎn)化載體，繼而將外源基因?qū)нM植物體基因組，完成轉(zhuǎn)化過程。影響根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素眾多，如菌株的類型、菌液的濃度、外植體的生理狀態(tài)等。通常情況下，農(nóng)桿菌菌株侵染力表現(xiàn)為：農(nóng)桿堿型菌株>胭脂堿型菌株>章魚堿型菌株；農(nóng)桿菌菌液的濃度視具體情況而定；在石榴的遺傳轉(zhuǎn)化中，培養(yǎng)的時間一般為3～4 d，溫度在20～25 ℃；處于發(fā)育幼年期的組織細胞轉(zhuǎn)化能力更強，采用該方法的轉(zhuǎn)化頻率很高，同時轉(zhuǎn)化質(zhì)量也最好。

基因槍法是一種物理誘導法，利用超速運動的金屬微粒直接將核酸分子引入受體細胞，然后通過離體培養(yǎng)來獲取完整植株。通過這種方法獲取的植株變異率較低，操作方法較為簡便，但也存在一定的缺陷，如費用昂貴，轉(zhuǎn)化效率通常較低等。

注射法就是利用注射器，在細胞中注射試驗需要的遺傳物質(zhì)，再通過組織離體培養(yǎng)獲得植株，這有利于克服遠緣雜交困難，同時能夠保證注射的準確性，但是轉(zhuǎn)化效率低下。該方法在基因槍法出現(xiàn)后已較少應用。

花粉管通道法的工作原理是將外源DNA注入到子房中，然后進一步進行轉(zhuǎn)化。該方法不需要進行細胞或組織培養(yǎng)，但是操作手續(xù)極為嚴格，在試驗中應用不多[14-15]。

此外，物理誘導還可通過電擊、激光等方式來實現(xiàn)，它們之間工作原理相似，都是利用細胞膜將DNA等遺傳物質(zhì)導入細胞中完成轉(zhuǎn)化。這2種方法對于單子葉植物與雙子葉植物均能適用，但也存在較多的問題，現(xiàn)階段應用很少。

聚乙二醇（PEG）是一種化學物質(zhì)，它的作用主要是使細胞膜通透性發(fā)生變化，繼而達到轉(zhuǎn)化目的。這種方法費用較低，結(jié)果精準，不需要復雜精密的儀器，主要缺點是轉(zhuǎn)化植株的變異率高，轉(zhuǎn)化率相對較低。

2.2 石榴遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料

試驗中不同類型的受體轉(zhuǎn)化率效果差別較大，試驗過程應根據(jù)具體情況，對不同的受體材料進行合理選擇與優(yōu)化。若外植體的生理狀態(tài)活躍，那么轉(zhuǎn)化效率會更高。一般而言，子葉、愈傷組織、上下胚軸、葉片等都是試驗中常用到的受體材料。郭曉麗[16]曾以突尼斯軟籽石榴的葉片愈傷組織作為受體材料進行遺傳轉(zhuǎn)化試驗，成功獲得了抗性愈傷組織并且分化出抗性芽。李躍霞[17]曾對石榴遺傳轉(zhuǎn)化的侵染材料進行篩選，試驗結(jié)果顯示，在試驗條件完全相同的情況下，葉片褐化較嚴重，而愈傷組織的褐化率較低，生長狀態(tài)也良好。石榴遺傳轉(zhuǎn)化受體材料選擇通常需滿足一些條件，如穩(wěn)定的再生體系與來源，并且需要對農(nóng)桿菌侵染有一定的敏感性。

2.3 遺傳轉(zhuǎn)化植株的鑒定方法

當前，試驗中遺傳轉(zhuǎn)化的植株鑒定最常用的方法有3種：免疫技術鑒定、標記基因的篩選鑒定與分子水平上的鑒定。

免疫技術有很多種類型，常見的有免疫熒光法和酶聯(lián)免疫法。前者必須以抗體為基礎進行檢測，利用顯微鏡觀察檢測抗體發(fā)出的熒光；后者是利用加上酶的抗體去檢測抗原，這種方法目前也被廣泛使用。

標記基因主要可以分成選擇標記基因和報告基因2種。選擇標記基因是一種已知功能或序列的基因，并與受體細胞的遺傳背景存在很大區(qū)別，因此非常有利于篩選鑒定。石榴遺傳轉(zhuǎn)化經(jīng)常使用的選擇標記基因是NPTⅡ，標記基因具有遺傳片段小、易于檢測的優(yōu)點。報告基因通常情況下是酶的基因，可以在試驗中加入相應的底物，觀察酶是否還具有活性，繼而判斷基因是否完成轉(zhuǎn)化?，F(xiàn)階段經(jīng)常利用的報告基因有抗生素轉(zhuǎn)化酶類、有光學性質(zhì)的酶類、熒光素酶類等，它們具有無毒、表達水平穩(wěn)定、快速靈活、可重復等優(yōu)點，在石榴的遺傳轉(zhuǎn)化試驗中經(jīng)常用到。

分子水平上的鑒定主要包括分子標記與分子雜交2種。分子標記又名DNA標記，這種檢測手段簡單快速，成本不高。分子雜交可以與分子標記同步配合進行檢測，它可用于檢測轉(zhuǎn)基因植株是否在相應水平上表達，如PCR-Southern 雜交、PCR-Western雜交、PCR-Northern雜交等，每一種雜交方式的原理和鑒定水平都各有不同。此前，Terakami[18]等曾以矮化石榴nana為受體材料，進行遺傳轉(zhuǎn)化的研究，他們運用PCR-Southern 的雜交方法，并檢測到目的基因整合到石榴的基因組中。

2.4 石榴遺傳轉(zhuǎn)化的基因類型

相關研究表明，在較早時期石榴遺傳轉(zhuǎn)化中，基因類型主要是目的基因如NPTⅡ、Kan以及報告基因GUS。近幾年來，生物科學及遺傳轉(zhuǎn)化相關技術在不斷發(fā)展，有一些新的基因也相繼出現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因類型更加多樣化，如抗寒相關基因、抗病相關基因、改變生長習性的相關基因等[19]。

3 存在問題

影響石榴的離體培養(yǎng)因素較多，如外植體的選擇、石榴愈傷組織誘導分化率、各類激素與培養(yǎng)基的選擇、人為的操作技術、室外移栽的環(huán)境及設施等都是影響石榴離體的關鍵因素，且亟待解決。目前，石榴的遺傳轉(zhuǎn)化技術雖然在技術與應用上已有了一定的突破，但大規(guī)模應用在生產(chǎn)實踐中仍有差距，需要繼續(xù)進行探索和研究，建立一個較完善、穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

4 展望

現(xiàn)階段，石榴是深受大眾喜愛的一種水果，在市場上供不應求，但傳統(tǒng)的扦插、壓條等繁殖方式技術相對落后，在一定程度上限制了石榴的示范推廣。通過離體培養(yǎng)技術，可以在較短時間內(nèi)獲取大量的優(yōu)質(zhì)種苗，且繁殖速度快、效率高，可以為石榴育種提供技術支撐，解決石榴發(fā)展的瓶頸問題[20]。

石榴的遺傳轉(zhuǎn)化技術對改良品種性狀具有重要作用，對理論研究和生產(chǎn)實踐有一定的價值，具有廣闊的應用前景。利用遺傳轉(zhuǎn)化技術，可以有目的性、有針對性地創(chuàng)造具有優(yōu)良性狀的品種，豐富石榴種植質(zhì)資源。現(xiàn)階段，園藝工作者不僅要挖掘利用好已掌握的遺傳轉(zhuǎn)化技術，也要加快對石榴各品種資源的收集，建立種質(zhì)資源庫，開展基因工程育種工作，為后期的良種選育奠定基礎。相信未來隨著各項園藝栽培技術的發(fā)展以及園藝設施的完善，會進一步加大石榴品種改良的進度。

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（責編：張宏民）