綠殼蛋雞群體的選育及蛋殼顏色分子標(biāo)記的應(yīng)用研究

吳震洋 宋興超 羅杰 廖恩俊 田旭 艾德錢(qián) 王云燕 李麗

(1.銅仁學(xué)院農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院，貴州 銅仁 554300；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 741000；3.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 銅仁 554300)

長(zhǎng)順綠殼蛋雞作為我國(guó)珍稀地方品種之一，具有覓食性強(qiáng)、耐粗飼，蛋殼厚且質(zhì)密，蛋殼顏色呈現(xiàn)不同程度綠色等特點(diǎn)。長(zhǎng)順綠殼蛋雞選育較晚，目前還未開(kāi)展系統(tǒng)性的選育工作，開(kāi)產(chǎn)日齡為165～195日齡，開(kāi)產(chǎn)日齡相對(duì)較晚，且年產(chǎn)蛋量120～150個(gè)，年產(chǎn)蛋量很低。有關(guān)蛋殼顏色的研究開(kāi)展于20世紀(jì)初，蛋殼顏色主要由3種色素所決定[1，2]。其中，綠殼蛋雞的綠殼性狀是膽綠素及其鋅螯合物在雞蛋形成過(guò)程中沉積在蛋殼中所致[3]。雖然蛋殼形成的部位在雞輸卵管的子宮部，但膽綠素的合成和分泌部位仍存在爭(zhēng)議。

Bruckner等最早發(fā)現(xiàn)綠殼基因和豆冠基因連鎖[4]，而Zartman則將豆冠基因定位到雞的1號(hào)染色體，說(shuō)明綠殼基因位于雞的1號(hào)染色體[5]。隨后發(fā)現(xiàn)了和綠殼基因連鎖的許多基因、SNP位點(diǎn)或分子標(biāo)記，進(jìn)一步將綠殼基因在1號(hào)染色體的位置精細(xì)化。Wang[6]等通過(guò)對(duì)有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1C1基因(SLCO1C1)表達(dá)水平的分析，發(fā)現(xiàn)SLCO1C1基因影響綠殼蛋的形成。而Wang等[6]和Wragg等[7]最終闡明綠殼蛋形成的分子機(jī)制。

本試驗(yàn)利用綠殼蛋雞蛋殼顏色性狀的分子標(biāo)記對(duì)長(zhǎng)順綠殼蛋雞進(jìn)行了初步的選育，分別以長(zhǎng)順綠殼蛋雞和羅曼粉蛋雞為父、母本進(jìn)行雜交，觀(guān)察雜交F1代的體型、外貌特征及生長(zhǎng)性能，為探討雜交F1代的可利用性及雜交模式提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)父本為長(zhǎng)順綠殼蛋雞公雞，母本為羅曼粉白羽蛋雞，飼養(yǎng)場(chǎng)地為銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院養(yǎng)殖場(chǎng)，飼養(yǎng)方式為籠養(yǎng)，并在雛雞脫溫后進(jìn)行淘汰選留。選取30只180日齡攜帶綠殼基因且采精反應(yīng)強(qiáng)的長(zhǎng)順綠殼蛋雞公雞作為父本，210只173日齡處于產(chǎn)蛋期的羅曼粉白羽蛋雞作為母本進(jìn)行雜交試驗(yàn)。采用人工授精的方式進(jìn)行配種，比例為1只公雞配種7只母雞，每只母雞隨機(jī)收集7～8枚種蛋共計(jì)1538枚種蛋進(jìn)行孵化。日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.2 外貌觀(guān)測(cè)及綠殼性狀雛雞篩選

出雛當(dāng)天，觀(guān)察F1代雛雞初生羽色，統(tǒng)計(jì)各類(lèi)型羽色比例。F1代30日齡時(shí)，翅靜脈采血，提取DNA后利用分子標(biāo)記對(duì)綠殼性狀基因檢測(cè)，對(duì)綠殼基因型進(jìn)一步判別，篩選產(chǎn)綠殼雞蛋的雛雞，最終篩選出370只雛雞進(jìn)行進(jìn)一步飼養(yǎng)。綠殼基因純合型標(biāo)注為L(zhǎng)C/LC，綠殼基因雜合性標(biāo)注為L(zhǎng)C/N，非綠殼基因型標(biāo)注為N/N。分子標(biāo)記引物序列見(jiàn)表2。

表1 試驗(yàn)雞日糧組成及各階段營(yíng)養(yǎng)水平

表2 引物序列信息

1.3 生長(zhǎng)性能指標(biāo)測(cè)定

測(cè)定親代和F1代的試驗(yàn)群體生長(zhǎng)性能，測(cè)定方法依據(jù)《NY/T 823-2004家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語(yǔ)和度量統(tǒng)計(jì)方法》。F1代分別在30日齡和60日齡時(shí)，各隨機(jī)選擇40只公雞和40只母雞進(jìn)行生長(zhǎng)性能指標(biāo)測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)與分析

用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，使用SPSS 21.0進(jìn)行t檢驗(yàn)分析差異顯著性，定義P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交F1代與親代外觀(guān)比較

父本長(zhǎng)順綠殼蛋雞公雞背羽、腹羽紅黑相間，頸羽、鞍羽赤紅，主翼羽、尾羽墨綠而有光澤；母本羅曼粉羽色均為純白色。雜交F1代共孵化出1276羽雛雞，677羽公雛，599羽母雛進(jìn)行育雛，40日齡時(shí)觀(guān)察羽色。F1代總體分為白羽、紅麻羽和黑羽3種羽色，分別占64.03%、24.37%、11.60%。F1代麻羽分為2種羽色，一種是麻色深度與純度不及長(zhǎng)順綠殼蛋雞公雞，另一種以紅褐色為主而無(wú)麻色羽毛或麻色較淺，與長(zhǎng)順綠殼蛋雞差異較大。而白羽與羅曼粉蛋雞羽色一樣，黑羽為新分離出的毛色。整體而言，F(xiàn)1代羽色出現(xiàn)明顯分化，白羽個(gè)體為主，還出現(xiàn)了麻色和紅褐色的個(gè)體，少部分為黑色，與長(zhǎng)順綠殼蛋雞總體相似的麻羽個(gè)體較少。

圖1 雜交一代羽色分布

2.2 雜交F1代的綠殼性狀篩選

經(jīng)過(guò)對(duì)父代50羽長(zhǎng)順綠殼蛋雞、40日齡F1代公雞677羽、母雞599羽共計(jì)1276羽進(jìn)行基因型判斷，F(xiàn)1代公雞的綠殼基因型為82.3%，母雞的綠殼基因型為82.8%，選留產(chǎn)綠殼蛋母雞270羽留種，淘汰產(chǎn)粉殼蛋的個(gè)體。公雞的選育首先按照紅麻羽、黑羽和白羽的順序選留，共選取50羽進(jìn)行留種。圖2為綠殼基因檢測(cè)電泳圖片，表3為雞群體中的基因型頻率。

注：Marker條帶為100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、1500bp、2000bp。

表3 長(zhǎng)順綠殼蛋雞及F1代群體中的基因型頻率

2.3 雜交F1代的生長(zhǎng)性能

雜交F1代1周齡、3周齡、5周齡、6周齡、7周齡、8周齡、9周齡、10周齡母雞平均體重分別為71.34g、167.21g、326.58g、357.01g、364.56g、410.50g、620.06g、645.93g，見(jiàn)圖2。雜交F1代日齡母雞體重呈上升趨勢(shì)，1～5周齡體重上升較快，6～8周齡趨于平緩，9周齡時(shí)體重有較大上升。商品代羅曼粉蛋雞體重則呈現(xiàn)穩(wěn)步增長(zhǎng)，和商品代羅曼粉蛋雞1～10周齡體重?cái)?shù)據(jù)相比，F(xiàn)1代雛雞體重均比商品代羅曼粉蛋雞體重輕。

與親代相比，F(xiàn)1代母雞1周齡、3周齡、5周齡體重和同周齡羅曼粉母雞(P>0.05)差異不顯著，但6周齡、7周齡、8周齡、9周齡、10周齡體重均極顯著低于同周齡羅曼粉母雞(P<0.01)。

圖3 1～10周齡雛雞體重增長(zhǎng)趨勢(shì)

3 討論

本試驗(yàn)選用長(zhǎng)順綠殼蛋雞為父本，羅曼粉蛋雞為母本進(jìn)行雜交，目的將綠殼基因?qū)氲诫s交F1代中，通過(guò)綠殼基因分子標(biāo)記對(duì)F1代進(jìn)行篩選，使得F1代的綠殼率達(dá)到90%以上并測(cè)量其生長(zhǎng)性能。后續(xù)再利用篩選出的F1代作為父本，不斷和羅曼粉蛋雞進(jìn)行級(jí)進(jìn)雜交，以期獲得高產(chǎn)的綠殼蛋雞，最后通過(guò)橫交固定進(jìn)行純系的培育。而毛色的改良則在純系培育的基礎(chǔ)上，進(jìn)行進(jìn)一步的雜交改良，以期獲得較好的商品代雞種，提高市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力。

長(zhǎng)順綠殼蛋雞與羅曼粉白羽蛋雞的雜交F1代以白羽為主，占比64.03%，其次為紅麻羽，占比24.37%，其余為黑羽。雞的某些羽色除了單基因或少數(shù)基因控制外，還存在基因互作效應(yīng)，因此不同品種的雞進(jìn)行雜交，會(huì)出現(xiàn)不同程度的羽色分離或出現(xiàn)新的羽色。雞的羽色由多種色素共同作用而形成，麻羽色基因由E(Extension)座位的2個(gè)以上等位基因控制[8]，但顯性白羽基因在其它羽色中占主導(dǎo)地位，由于母本為白色羅曼粉蛋雞，盡管父本為長(zhǎng)順綠殼蛋雞，但F1代中仍出現(xiàn)了較多白羽雛雞。因此，如利用隱性白羽蛋雞，則會(huì)出現(xiàn)較好的毛色體現(xiàn)，但獲得隱性白羽雞作為育種素材則較為困難。而出現(xiàn)的黑羽則有可能是父本長(zhǎng)順綠殼蛋雞混有黑羽雞的血統(tǒng)，導(dǎo)致F1代中出現(xiàn)了黑羽性狀的分離。曾道曙等[9]利用長(zhǎng)順綠殼蛋雞與隱性矮小白雞雜交，雜交一代黃麻羽母雞占比70.69%，深麻羽為22.20%，麻羽比例高達(dá)92.89%，這是由于母本為隱性白羽，從而獲得的F1代可用于替代長(zhǎng)順綠殼蛋雞。本試驗(yàn)F1代麻羽出現(xiàn)了與長(zhǎng)順綠殼蛋雞親本類(lèi)似的麻羽和紅褐色羽2種顏色，此種顏色的個(gè)體可留作開(kāi)發(fā)為替代長(zhǎng)順綠殼蛋雞的父母代，新出現(xiàn)的黑羽可在開(kāi)發(fā)中淘汰或作為生產(chǎn)配套系使用，而白羽可和羅曼粉蛋雞作進(jìn)一步的級(jí)進(jìn)雜交，用以產(chǎn)生高產(chǎn)綠殼蛋雞和純系使用。

為了利用好長(zhǎng)順綠殼蛋雞品種資源、快速篩選出攜帶綠殼基因的個(gè)體且提高雜交群體的產(chǎn)蛋率，本試驗(yàn)利用分子標(biāo)記快速篩選長(zhǎng)順綠殼蛋雞父代的綠殼基因，并根據(jù)篩選數(shù)據(jù)進(jìn)行組建家系，獲得了若干攜帶綠殼基因的雜交群體，加快了選育進(jìn)度。Wang等[6]發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒EAV-HP元件的反向插入到SLCO1B3基因5′-非編碼區(qū)后，可使得SLCO1 B3在輸卵管殼腺部特異性高表達(dá)，導(dǎo)致母雞產(chǎn)綠殼蛋，并將該綠殼基因定位到1號(hào)染色體中[6]。國(guó)外學(xué)者Wragg等[7]也報(bào)道了類(lèi)似研究，但所用分子標(biāo)記比Wang等更準(zhǔn)確。本試驗(yàn)檢測(cè)了長(zhǎng)順綠殼蛋雞公雞的綠殼基因型，篩選出純合和雜合的父本后在和羅曼粉母雞進(jìn)行雜交，結(jié)果表明，純合父本長(zhǎng)順綠殼蛋雞和羅曼粉蛋雞的F1代為雜合產(chǎn)綠殼蛋蛋的基因型(LC/N)，公、母雛綠殼基因型分別為82.3%和82.8%。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)雜交群體的生長(zhǎng)性能、羽色等分析，有望通過(guò)級(jí)進(jìn)雜交培育出替代長(zhǎng)順綠殼蛋雞且產(chǎn)蛋量高的雜交群體。

家禽早期體重是肉用禽類(lèi)育種的目標(biāo)，也是衡量肉雞生長(zhǎng)、生產(chǎn)能力的重要性狀[10]。本試驗(yàn)中，1～5周齡F1代雜交母雞與羅曼粉親代相比，體重差異不顯著，第6周齡開(kāi)始，F(xiàn)1代雜交群體母雞的體重均極顯著低于同周齡羅曼粉母雞(P<0.01)，并未表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢(shì)。這有可能和父本長(zhǎng)順綠殼蛋雞有關(guān)。謝卓君等研究了清遠(yuǎn)麻雞和隱性白羽蛋雞的雜交一代，結(jié)果表明，雜交F1代母雞體重和體型均比其母本矮小隱性白羽蛋雞更大，F(xiàn)1代公雞體重小于其父本清遠(yuǎn)麻公雞[11]。劉嘉等[12]比較了綠殼蛋雞和蘆花雞的雜交后代體尺性狀，結(jié)果表明，雜交一代胸深和脛圍均小于父母代。賀興龍[13]則研究了蘇禽綠殼蛋雞和白來(lái)航蛋雞正、反交雜交一代的生長(zhǎng)性狀，結(jié)果表明，不論是白來(lái)航公雞和蘇禽綠殼蛋雞母雞雜交F1代，還是蘇禽綠殼蛋雞公雞和白來(lái)航母雞的反交結(jié)果，40周齡雜交1代公、母雞體重均比其對(duì)應(yīng)的父母代親本體重小。姜慧繪[14]探討了長(zhǎng)順綠殼蛋雞公雞和矮小隱性白雞母雞雜交一代的體重，結(jié)果表明，雜交一代的體重接近長(zhǎng)順綠殼蛋雞。本試驗(yàn)用長(zhǎng)順綠殼蛋雞和羅曼粉蛋雞進(jìn)行雜交，F(xiàn)1代母雞比母本體重較輕，說(shuō)明長(zhǎng)順綠殼蛋雞作為我國(guó)優(yōu)良的地方品種，雖然經(jīng)過(guò)了一定的人工選擇，但仍然具有生長(zhǎng)緩慢的特點(diǎn)，F(xiàn)1代雛雞受到了父本遺傳效應(yīng)的影響較大，也可能和不同的雜交組合及長(zhǎng)順綠殼蛋雞的純度有關(guān)。

4 結(jié)論

雜交F1代初生以與羅曼粉母本為主的白羽，占比64.03%，白羽可和羅曼粉蛋雞作進(jìn)一步的級(jí)進(jìn)雜交，用以產(chǎn)生高產(chǎn)綠殼蛋雞。成年雜交F1代公雞和母雞均出現(xiàn)羽色分化或變異，出現(xiàn)了與長(zhǎng)順綠殼蛋雞親本類(lèi)似的麻羽和紅褐色羽2種顏色，占比24.37%，此種顏色的個(gè)體也可留作開(kāi)發(fā)為替代長(zhǎng)順綠殼蛋雞的父母代或參與到后續(xù)的級(jí)進(jìn)雜交中，新出現(xiàn)的黑羽占比11.60%，可在開(kāi)發(fā)中淘汰或作為生產(chǎn)商品代時(shí)為配套系使用；雜交F1代母雞體重和體型均比其母本小，且差異極顯著，后續(xù)可通過(guò)級(jí)進(jìn)雜交再做進(jìn)一步的生長(zhǎng)性能測(cè)定，以期達(dá)到和羅曼粉蛋雞相似的體重水平和產(chǎn)蛋性能。因此，通過(guò)后續(xù)的雜交試驗(yàn)和橫交固定選育，有望培育出高產(chǎn)的可替代長(zhǎng)順綠殼蛋雞的父母代親本及純系。