全長(zhǎng)朊粒蛋白淀粉樣纖維引發(fā)細(xì)胞毒性的機(jī)制研究*

王利強(qiáng) 袁菡燁 陶 菁 郝苗苗 陳 杰 朱海麗 梁 毅**

（1）細(xì)胞穩(wěn)態(tài)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢大學(xué)泰康生命醫(yī)學(xué)中心，武漢 430072；2）湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，咸寧 437100）

朊病毒?。╬rion disease），又被稱為傳染性海綿狀腦?。═SEs），是一類由朊粒蛋白（PrP）在神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)生錯(cuò)誤折疊、聚集成具有致病能力的PrPSc誘發(fā)的致死性神經(jīng)退行性疾病。此疾病可在多種哺乳動(dòng)物之間傳播，病死率很高。人類患有朊病毒病的臨床癥狀常常表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)功能障礙、癡呆和腦淀粉樣病變等［1-4］。1997年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主Stanley B. Prusiner 最先描述了朊病毒（prions），即蛋白質(zhì)感染因子［1-2］。常見的朊病毒病包括在牛群中傳播的瘋牛?。╞ovine spongiform encephalopathy，BSE）、羊的瘙癢?。⊿crapie）以及人類之間少量存在的克雅氏病（Creatzfeldt-Jakob disease，CJD）等［1-8］。該疾病的潛伏期很長(zhǎng)，一般可達(dá)到數(shù)十年，發(fā)病周期很短，病人一旦發(fā)病，往往在一年內(nèi)死亡。

盡管朊病毒病是一種罕見的神經(jīng)退行性疾病，但由于它獨(dú)有的生物學(xué)特征及其種間傳播的性質(zhì)，一直是近年來研究的熱點(diǎn)［3，9］。朊病毒是一類可以自我復(fù)制、具有感染性的蛋白質(zhì)聚集體，其可在大腦中積累沉淀，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，其病變特征包括神經(jīng)元丟失、腦中海綿狀變形及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞病變等［10］。朊病毒病的發(fā)病機(jī)制主要是細(xì)胞型朊粒蛋白（PrPC）發(fā)生構(gòu)象重排，形成具有致病能力的PrPSc，PrPSc可以與PrPC發(fā)生相互作用，緊密結(jié)合在一起，誘導(dǎo)PrPC發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和聚集的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這些特征是朊病毒在宿主間傳播的基礎(chǔ)［1-2，4，11］。

近年來，隨著冷凍電鏡（cryo-EM）技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們已逐步揭示了朊病毒的致病構(gòu)象轉(zhuǎn)化機(jī)制［12-13］。本實(shí)驗(yàn)室和中國(guó)科學(xué)院生物與化學(xué)交叉研究中心劉聰教授實(shí)驗(yàn)室合作，利用cryo-EM的方法解析了全長(zhǎng)人野生型朊病毒淀粉樣纖維及其家族遺傳型朊病毒病病理突變體E196K 的淀粉樣纖維結(jié)構(gòu)［12-13］，發(fā)現(xiàn)兩種纖維都是由兩根原纖維絲以左手螺旋的方式相互纏繞而成，野生型PrP纖維通過兩對(duì)鹽橋發(fā)生相互作用緊密結(jié)合在一起，PrP C端氨基酸170~229組成PrP纖維核心的6個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)［12］，而E196K 兩股原纖維通過4 對(duì)鹽橋發(fā)生相互作用，形成一個(gè)長(zhǎng)的既親水又疏水的原纖維界面，纖維核心由其C端氨基酸175~217組成，包含5個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)［13］。

體外形成的淀粉樣纖維和PrPSc具有相似特征，如主要具有β 折疊結(jié)構(gòu)，并且具有蛋白酶K 抗性等［14-17］。用體外形成的淀粉樣原纖維注入到過表達(dá)人PrP的轉(zhuǎn)基因小鼠活體腦組織中，經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的孵育后，小鼠出現(xiàn)具有朊病毒病特征的神經(jīng)變性，表明其具有潛在的致病能力［18-20］，但是，體外形成PrP淀粉樣纖維致病的分子機(jī)制仍不是很清楚。因此，本文利用生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)方法在細(xì)胞和動(dòng)物水平揭示了體外組裝的PrP淀粉樣纖維的細(xì)胞毒性和潛在的感染機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 PrP純化

編碼全長(zhǎng)人源PrP（23~231）的質(zhì)粒是中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所肖庚富博士贈(zèng)送。利用載體pET-30a（+）表達(dá)PrP 23~231序列，將載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）細(xì)胞（Novagen，Merck，Darmstadt，Germany）中進(jìn)行培養(yǎng)，用終濃度為1 mmol/L 的IPTG 溶液誘導(dǎo)PrP 表達(dá)，收集菌體，用裂解緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl， 2 mmol/L EDTA， 0.1% TritonX-100，pH 7.4）裂解菌體并進(jìn)行超聲破碎，將裂解液在17 000g條件下離心30 min，棄上清，收集包涵體沉淀，將包涵體用緩沖液1（10 mmol/L Tris-HCl，0.5% Triton X-100，pH 7.4）、緩沖液2（10 mmol/L Tris-HCl， 2 mol/L NaCl， pH 7.4）、 緩 沖 液3（10 mmol/L Tris-HCl，2 mol/L Urea，pH 7.4）依次洗滌，并使用包涵體溶解液（10 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L Na2HPO4·12H2O， 8 mol/L Urea，pH 7.4）溶解包涵體。使用Ni-Sepharose 純化，獲得純度較高PrP 蛋白，將PrP 蛋白在蛋白質(zhì)復(fù)性緩沖 液（100 mmol/L Tris-HCl，6 mol/L Urea，pH 8.0）中透析過夜，然后采用高效液相色譜C4 柱（Shimadzu，Kyoto，Japan）純化，可獲得高純度PrP 蛋白［12，16，21］。將重組的PrP 在5 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 7.4）中透析，濃縮后于-80℃保存。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和質(zhì)譜分析證實(shí)，純化的人源PrP純度較高，且具有完整的二硫鍵。使用NanoDrop One 微體積紫外可見分光光度計(jì)（Thermo Scientific，Waltham，MA）測(cè)其在280 nm處的吸光度，根據(jù)蛋白質(zhì)組成計(jì)算的摩爾消光系數(shù)（2.535）（http://web.expasy.org/protparam/） 來計(jì)算獲得人PrP的濃度。

1.2 PrP纖維種子的制備

將120 μmol/L全長(zhǎng)重組人源PrP在含有2 mol/L鹽酸胍（GdnHCl）和20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 7.4） 中孵育，在37°C 下180 r/min 振蕩9~11 h，收集PrP 原纖維。使用細(xì)胞破碎儀低功率條件超聲使纖維片段化形成種子，超聲5 s停5 s，超聲5 min。然后將纖維在5 mmol/L NaAc 緩沖液（pH 5.0） 中透析去除鹽酸胍。使用NanoDrop OneC微體積紫外可見分光光度計(jì)測(cè)量其在280 nm處的吸光度，然后根據(jù)PrP組成計(jì)算的摩爾消光系數(shù)（2.535）（http://web.expasy.org/protparam/）來測(cè)定PrP原纖維的濃度。

1.3 透射電鏡觀察PrP纖維形態(tài)

將10 μl的PrP纖維樣品（~13 μmol/L）滴在銅網(wǎng)上，孵育30 s，用濾紙吸走，再用H2O洗滌10 s。然后用2%（w/v）醋酸鈾酰染色30 s，在25°C的空氣中干燥。負(fù)染樣品使用JEM-1400 Plus 透射電子顯微鏡（JEOL，東京，日本）進(jìn)行觀察。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

HEK-293T 細(xì) 胞、 RK13 細(xì) 胞 和SH-SY5Y細(xì)胞使用Dulbecco's modified Eagle's medium（Gibco，Invitrogen，Mulgrave，VIC，Australia）培養(yǎng)基培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中添加10%（v/v）胎牛血清（Gibco）、100 U/ml 鏈霉素和100 U/ml 青霉素。然后將細(xì)胞放入含5% CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。利用慢病毒載體表達(dá)系統(tǒng)（pHAGE-puro）構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)帶FLAG標(biāo)簽的全長(zhǎng)人PrP的HEK-293T細(xì)胞系和穩(wěn)定表達(dá)全長(zhǎng)人PrP 的SH-SY5Y 細(xì)胞系。將目標(biāo)cDNA 片段插入慢病毒載體，將含有目標(biāo)cDNA、pVSVG和p976的質(zhì)粒用Lipofectamine?2000（Invitrogen，Carlsbad，CA）按2∶1∶1 的比例包裝在HEK-293T 細(xì)胞中。脂質(zhì)體與DNA 的比例為2∶1。轉(zhuǎn)染48 h后，收獲并過濾病毒，用包裝好的慢病毒分別感染HEK-293T 和SH-SY5Y 細(xì)胞2 次，每次感染12 h，間隔12 h。為了建立穩(wěn)定的細(xì)胞系，用嘌呤霉素篩選過表達(dá)細(xì)胞。蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）檢測(cè)各蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn)

將穩(wěn)定表達(dá)帶FLAG 標(biāo)簽的全長(zhǎng)人PrP 的HEK-293T細(xì)胞接種在96孔板中。培養(yǎng)24 h后，將PrP 纖維種子（溶解于pH 5.0 的5 mmol/L NaAc 緩沖液中，母液濃度為100 μmol/L）以終濃度為0.01、0.1、1、10 μmol/L的濃度加入培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。將MTT 原液（5 g/L）用PBS 稀釋后加入孔中孵育4 h，直至細(xì)胞內(nèi)形成甲酰胺。MTT終濃度為0.5 g/L。最后，用二甲亞砜溶解深藍(lán)色甲醛晶體，然后使用Thermo Multiskan MK3 微孔板閱讀器（Thermo Scientific，Waltham，MA）測(cè)量其在492 nm處的吸光度。細(xì)胞活力用含有PrP纖維處理過的樣品吸光度除以5 mmol/L NaAc 緩沖液（pH 5.0）處理過的樣品吸光度得到的百分比表示。其最終數(shù)據(jù)用5 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)所得值的平均值±SD（標(biāo)準(zhǔn)差）表示。

1.6 Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PrP聚集

穩(wěn)定表達(dá)帶FLAG 標(biāo)簽的全長(zhǎng)人PrP 的HEK-293T細(xì)胞培養(yǎng)1 d后，加入1~10 μmol/L PrP原纖維種子（溶解于pH 5.0 的5 mmol/L NaAc 緩沖液中，母液濃度為100 μmol/L）孵育2 d。收集HEK-293T細(xì)胞，在含有1% Triton X-100、50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L 苯甲磺酰氟和蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液（pH 7.6）中重懸細(xì)胞半小時(shí)。將細(xì)胞裂解液10 000g離心10 min。留出一半上清，另一半上清與1% 十二烷基肌氨酸鈉（Sarkosyl）在37℃下孵育半小時(shí)。然后將混合物在150 000g下超離心半小時(shí)，并用PBS（pH 7.4）洗滌沉淀一次。將Sarkosyl 不溶性蛋白在SDSPAGE 上樣緩沖液中煮沸15 min，另一半上清作為總蛋白質(zhì)樣品，也在SDS-PAGE上樣緩沖液中煮沸15 min。樣品用12.5% SDS-PAGE 分離，然后進(jìn)行Western blot。用抗FLAG單克隆抗體對(duì)這些細(xì)胞的Sarkosyl 不溶性PrP 聚集體進(jìn)行檢測(cè)，并用抗FLAG和抗β-actin抗體對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行檢測(cè)。使用BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒（Beyotime）將細(xì)胞裂解液進(jìn)行定量。為了計(jì)算Sarkosyl 不溶性PrP 的數(shù)量，使用ImageJ 軟件（NIH，Bethesda，MD）確定PrP 條帶的密度，進(jìn)而計(jì)算Sarkosyl 不溶性PrP聚集體占總蛋白質(zhì)的比例。Sarkosyl不溶性實(shí)驗(yàn)由3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)獲得的平均值±SD表示。

1.7 Western blot檢測(cè)小鼠前額葉組織中PrP聚集

選取7~14 d的新生小鼠，斷頸處死，放入75%乙醇中浸泡消毒，迅速分離全腦。在預(yù)冷的培養(yǎng)基中分離前額葉，使用McIlwain 組織切片機(jī)將分離的前額葉進(jìn)行橫斷切片，厚度固定為400 μm，將切好腦片置于Millicell-Cell Culture Inserts微孔膜上（0.4 μm，Millipore），放入6 孔板中，然后加入1 ml包含2% B27、98% Neurobasal-A Medium（Thermo scientific，Rockford，IL，USA）以及100 U/ml 青霉 素 和 100 mg/L鏈霉素 （Gibco （Thermo scientific），Rockford，IL，USA）的培養(yǎng)基，腦片不需要其他處理，2 d 后，更換新鮮培養(yǎng)基。向腦片上接種10 μl、1 μmol/L PrP 纖維種子（溶解于pH 5.0 的5 mmol/L NaAc 緩沖液中），繼續(xù)培養(yǎng)5 d。取出腦切片，在含有1% Triton X-100、50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L 苯甲磺酰氟和蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液（pH 7.6）中重懸細(xì)胞半小時(shí)，使用超聲進(jìn)一步破碎細(xì)胞。10 000g的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心10 min 處理，將裂解液的上清小心用移液槍吸出保留，組織中不溶性沉淀遺棄。在上清中取出150 μl 用于測(cè)定內(nèi)源PrP 表達(dá)量，剩余細(xì)胞裂解液加入終濃度為1% Sarkosyl，室溫靜置30 min，在4℃下10 000g的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心10 min，收集上清。將上清在4℃下150 000g條件下超速離心30 min，吸去上清，將沉淀用PBS重懸，在4℃下150 000g再次離心30 min。沉淀中含有PrP 聚集體，用60 μl SDS-PAGE 上樣緩沖液重懸。在預(yù)留的細(xì)胞裂解液中加入5×SDS-PAGE 上樣緩沖液，和重懸的沉淀一起煮沸10 min，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。配置12.5%的SDS-PAGE變性膠，利用電泳分離蛋白質(zhì)樣品。使用抗8H4 抗體（Sigma-Aldrich）探測(cè)小鼠前額葉中Sarkosyl 不溶性PrP 蛋白。之后的轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育抗體等步驟和1.6相同。

1.8 原子力顯微鏡（AFM）觀察PrP淀粉樣纖維的形態(tài)

取10 μl 人野生型PrP 纖維樣品滴入云母片表面上孵育2 min，然后用10 μl 純凈水沖洗3次以去除未結(jié)合的原纖維，并在室溫下干燥。采用AFM（Bruker）的scanassist 模式在空氣中對(duì)云母表面的原纖維進(jìn)行探測(cè)。測(cè)量采用SCANASYST-AIR 探針。以1 Hz的掃描速率獲得固定分辨率（256×256數(shù) 據(jù) 點(diǎn)） 的AFM 圖 像， 并 使 用NanoScope Analysis 2.0軟件（Bruker）進(jìn)行分析。

1.9 線粒體超薄切片

選取沒有內(nèi)源PrP 表達(dá)的RK13 細(xì)胞研究PrP纖維對(duì)線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，將構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)外源PrP 的RK13 細(xì)胞平鋪在6 孔板中培養(yǎng)1 d，然后加入0或10 μmol/L野生型PrP纖維種子（溶解于pH 5.0 的5 mmol/L NaAc 緩沖液中，母液濃度為100 μmol/L）共同培養(yǎng)3 d，用加入含有5 mmol/L NaAc 緩沖液（pH 5.0）的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。在用含3%多聚甲醛和1.5%戊二醛的PBS（pH 7.4）溶液固定后，收獲細(xì)胞，用1%鋨酸冰浴固定1 h，然后將樣品在分級(jí)丙酮中脫水，并包埋在812樹脂中。使用Leica Ultracut S 顯微鏡制備細(xì)胞超薄切片，并用2%醋酸鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行陰性染色。使用JEM-1400 Plus透射電子顯微鏡（JEOL）觀察細(xì)胞超薄切片中線粒體形狀、線粒體嵴完整性以及是否存在空泡化等。所有實(shí)驗(yàn)均通過生物重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

1.10 細(xì)胞氧化壓力實(shí)驗(yàn)

穩(wěn)定表達(dá)全長(zhǎng)人PrP的SH-SY5Y細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)1 d，然后加入終濃度為10 μmol/L PrP 纖維種子（溶解于pH 5.0 的5 mmol/L NaAc 緩沖液中，母液濃度為100 μmol/L）孵育2 d，利用活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒（碧云天，南通，中國(guó)）檢測(cè)細(xì)胞ROS水平。具體過程如下：用PBS洗滌細(xì)胞2次，將ROS 試劑盒中DCFH-DA 探針用培養(yǎng)基稀釋，比例為1∶2 000，然后加入到細(xì)胞中，放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置20 min。吸去含有ROS 探針的上清，在細(xì)胞中加入培養(yǎng)基，進(jìn)行短暫孵育，用移液槍吸走，重復(fù)該步驟3 次。在細(xì)胞中加入胰酶消化，用滅菌的PBS將細(xì)胞進(jìn)行重懸處理，使用低轉(zhuǎn)速1 000g離心收集在離心管底部的細(xì)胞沉淀。在EPICS XL-MCL流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter）上使用EXPO32 MultiComp 軟件（Beckman Coulter）測(cè)定含有ROS 的細(xì)胞總數(shù)（~10 000）的百分比（ROS水平）。以用5 mmol/L NaAc緩沖液（pH 5.0）孵育的穩(wěn)定表達(dá)全長(zhǎng)人PrP 的SH-SY5Y 細(xì)胞為對(duì)照。ROS水平表示為3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)所得值的平均值±SD。

1.11 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

穩(wěn)定表達(dá)全長(zhǎng)人PrP的SH-SY5Y細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)1 d，然后加入終濃度為10 μmol/L PrP 纖維種子（溶解于pH 5.0 的5 mmol/L NaAc 緩沖液中，母液濃度為100 μmol/L）孵育2 d。使用Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Beyotime）染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞。用2.5 g/L 胰蛋白酶（Promega，Madison，WI）消化后收獲細(xì)胞，在4°C下用PBS洗滌，并用185 μl的結(jié)合緩沖液重懸。然后將樣品與5 μl 的Annexin V-FITC 和10 μl 的PI 在4°C 的黑暗中孵育10 min。使用EPICS XL-MCL 流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter，F(xiàn)ullerton，CA）分析Annexin V 的結(jié)合，收集~2×104個(gè)細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞的百分比。以用5 mmol/L NaAc 緩沖液（pH 5.0）孵育的穩(wěn)定表達(dá)全長(zhǎng)人PrP 的SH-SY5Y細(xì)胞為對(duì)照。凋亡細(xì)胞百分比用3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD表示。

1.12 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±SD 表示，P值采用Student'st檢驗(yàn)確定。P<0.05 為具有顯著性差異。以下標(biāo)準(zhǔn)貫穿全文：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 PrP纖維對(duì)內(nèi)源PrP聚集的影響

將全長(zhǎng)人野生型PrP 與含有2 mol/L 鹽酸胍的20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 7.4）中共同孵育，放入在37℃搖床中振蕩9~11 h，獲得平臺(tái)期的PrP淀粉樣纖維。利用透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)PrP形成的淀粉樣纖維無明顯分叉和聚集現(xiàn)象，纖維長(zhǎng)而直（圖1a）。進(jìn)一步利用AFM輕敲模式檢測(cè)了人野生型PrP淀粉樣纖維的結(jié)構(gòu)，從圖中可以明顯看出PrP 形成了均一性和分散性較好的纖維樣聚集體（圖2）。圖2b 是2a 中方框區(qū)域局部放大圖像，從中可以看到大部分纖維都是以左手螺旋的方式纏繞生長(zhǎng)，纖維長(zhǎng)而直，并未有分叉現(xiàn)象，這種特征和利用透射電子顯微鏡觀察的結(jié)果相吻合。

為了研究PrP淀粉樣纖維的致病機(jī)制，本文構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)含有FLAG 標(biāo)簽的PrP HEK-293T 細(xì)胞系，通過MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了外源加入PrP 纖維對(duì)穩(wěn)定表達(dá)PrP 的HEK-293T 細(xì)胞活力的影響。加入0.01~10 μmol/L PrP 纖維處理后的細(xì)胞活性與對(duì)照細(xì)胞的活性比值依次為94.54%、93.87%、89.32%和66.02%（圖1b）。通過顯著性定量分析發(fā)現(xiàn)，在0.1 μmol/L 和1 μmol/L PrP 纖維處理?xiàng)l件下，細(xì)胞活性與對(duì)照組相比降低約10%，而10 μmol/L PrP纖維處理使得細(xì)胞活力降低約30%，表明PrP纖維可以降低細(xì)胞活力，且其影響具有濃度依賴效應(yīng)，即濃度越高引起的細(xì)胞毒性越強(qiáng)（圖1b）。接著，用變性劑Sarkosyl溶解細(xì)胞中的PrP單體和寡聚體，通過超速離心分離細(xì)胞中Sarkosyl 不溶性聚集體，進(jìn)一步使用Western blot定量檢測(cè)了各PrP纖維處理?xiàng)l件下細(xì)胞中聚集體的含量，發(fā)現(xiàn)在HEK-293T細(xì)胞中，1 μmol/L PrP 纖維處理?xiàng)l件下PrP 聚集體相對(duì)含量和不加PrP纖維條件相比沒有明顯差異，而10 μmol/L PrP纖維處理則使得細(xì)胞內(nèi)PrP聚集體顯著增多（圖1c）。通過顯著性分析發(fā)現(xiàn)，10 μmol/L PrP 纖維處理?xiàng)l件下形成的PrP 聚集體相對(duì)含量為對(duì)照組的2.7倍（圖1e）。這些實(shí)驗(yàn)表明，PrP纖維具有和PrPSc類似的性質(zhì)，引起細(xì)胞毒性，同時(shí)誘導(dǎo)內(nèi)源PrP發(fā)生錯(cuò)誤折疊，形成聚集體。

Fig. 1 PrP fibrils are cytotoxic，and transmissible to induce the misfolding of endogenous PrPC in cells and in the frontal cortices of infant mice

Fig. 2 High-resolution AFM images of PrP fibrils

2.2 PrP纖維對(duì)小鼠前額葉內(nèi)源PrP聚集的影響

在細(xì)胞水平，實(shí)驗(yàn)表明PrP纖維具有和PrPSc類似的性質(zhì)，可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)PrP發(fā)生錯(cuò)誤折疊，形成聚集體，那么在更復(fù)雜的腦組織中PrP纖維是否會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)源PrP 聚集？研究發(fā)現(xiàn)，使用variant CJD病人的PrPSc感染小鼠過程中，PrPSc在小鼠前額葉皮層中會(huì)有大量積聚［22］，因此本文選擇分離新生小鼠前額葉皮層進(jìn)行研究。

使用去垢劑Sarkosyl 溶解前額葉中的PrP 單體和寡聚體，通過超速離心分離細(xì)胞中Sarkosyl不溶性聚集體，進(jìn)一步使用Western blot 定量檢測(cè)前額葉細(xì)胞中PrP 聚集體的含量。發(fā)現(xiàn)在前額葉皮層中，1 μmol/L PrPC處理?xiàng)l件下PrP 聚集體相對(duì)含量與對(duì)照組相比無明顯差異，而1 μmol/L PrP纖維處理則使得前額葉皮層中PrP 聚集體顯著增多（圖1d），通過顯著性分析發(fā)現(xiàn)，1 μmol/L PrP纖維處理?xiàng)l件下形成的PrP聚集體相對(duì)含量為對(duì)照組的1.4倍（圖1f，P=0.018），這表明PrP纖維可以誘導(dǎo)小鼠前額葉皮層中內(nèi)源PrP的聚集。

2.3 PrP纖維對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化壓力和細(xì)胞凋亡的影響

研究表明，蛋白質(zhì)在細(xì)胞中發(fā)生錯(cuò)誤折疊、聚集會(huì)引起線粒體中氧化壓力的升高，進(jìn)而影響細(xì)胞功能使其紊亂，引起神經(jīng)元死亡［23-25］。那么外源加入PrP纖維是否會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)氧化壓力升高呢？本文利用DCFH-DA 活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)了PrP 纖維對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化壓力水平的影響，DCFH-DA 是一種ROS探針，在細(xì)胞內(nèi)被分解為DCFH，進(jìn)而可以與細(xì)胞中的活性氧反應(yīng)產(chǎn)生具有熒光的DCF。

選用穩(wěn)定表達(dá)外源人PrP 的SH-SY5Y 細(xì)胞進(jìn)行氧化壓力測(cè)定，SH-SY5Y細(xì)胞是神經(jīng)母瘤細(xì)胞，其神經(jīng)細(xì)胞的特征使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更可信。在細(xì)胞中加入終濃度為10 μmol/L PrP 纖維處理細(xì)胞48 h（圖3b），對(duì)照組加入等體積的5 mmol/L NaAc（pH 5.0）（圖3a），利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧化壓力。發(fā)現(xiàn)PrP纖維處理的實(shí)驗(yàn)組和5 mmol/L NaAc（pH 5.0）處理的對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)氧化壓力值從2.12%（圖3a）上升至64.46%（圖3b），細(xì)胞內(nèi)氧化壓力顯著升高（P=0.000 41）（圖3c）。這些結(jié)果表明，PrP纖維可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)源PrP發(fā)生聚集，進(jìn)一步誘導(dǎo)引起的細(xì)胞內(nèi)氧化壓力升高。

本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，PrP 纖維可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)較高氧化壓力水平，過高的ROS 對(duì)細(xì)胞造成的損傷可能會(huì)通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡水平來反映，因此，進(jìn)一步檢測(cè)了PrP 纖維對(duì)穩(wěn)定表達(dá)外源人PrP 的SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡水平的影響。在SH-SY5Y 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中加入終濃度為10 μmol/L PrP 纖維處理48 h后，細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡和總凋亡水平依次為2.96%、 10.00% 和12.96% （圖3e）， 相 較 于5 mmol/L NaAc（pH 5.0）處理的對(duì)照組細(xì)胞（分別為3.20%、2.34%和5.54%）（圖3d），其晚期凋亡水平顯著升高（P=0.000 13）（圖3f）。

Fig. 3 PrP fibrils induce severe ROS production（P=0.000 41）and late apoptosis（P=0.000 13）in cells stably expressing PrPC

2.4 PrP纖維對(duì)線粒體損傷的影響

蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的異常聚集會(huì)引起細(xì)胞中氧化壓力應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致大量的氧自由基產(chǎn)生，會(huì)造成細(xì)胞中線粒體的損傷誘發(fā)一系列疾病的發(fā)生［26］。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PrP 纖維可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)PrP 發(fā)生錯(cuò)誤折疊形成聚集體，同時(shí)誘導(dǎo)氧化壓力增強(qiáng)，那么其對(duì)線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)是否會(huì)有影響？使用超薄切片技術(shù)結(jié)合透射電子顯微鏡觀察檢測(cè)了PrP纖維引起的線粒體損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組人野生型PrP穩(wěn)轉(zhuǎn)RK13細(xì)胞中（圖4a，b），大部分線粒體呈現(xiàn)管狀或球形，線粒體嵴較完整（白色箭頭標(biāo)注）。而當(dāng)用10 μmol/L PrP 纖維處理細(xì)胞后（圖4c，d），線粒體損傷水平較對(duì)照組明顯增多（圖4e），形成多種形態(tài)，線粒體內(nèi)的嵴發(fā)生斷裂，且排列錯(cuò)亂，逐步出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象（黃色箭頭標(biāo)注）（圖4c，d）。

Fig. 4 PrP fibrils induce severe mitochondrial damage in cells stably expressing PrPC

3 討 論

蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊引起的神經(jīng)退行性疾病一直是近幾十年的研究熱點(diǎn)，但是對(duì)于體內(nèi)相關(guān)樣本的采集和研究一直存在著各種各樣的制約因素，對(duì)于朊病毒病，由于PrPSc高度傳染性，使得研究其致病機(jī)制和解析其三維結(jié)構(gòu)的危險(xiǎn)系數(shù)大大增加，因此在體外模擬PrP 的聚集過程，研究PrP 纖維的致病機(jī)制是十分有必要的。諾貝爾獎(jiǎng)得主Prusiner教授課題組進(jìn)行了一系列研究，發(fā)現(xiàn)在過表達(dá)PrP的轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中接種PrP纖維，在經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的孵育后，轉(zhuǎn)基因小鼠會(huì)表現(xiàn)出朊病毒病相關(guān)的神經(jīng)退行性癥狀［18-20］。不同之處為病理?xiàng)l件下的PrPSc比體外形成PrP 纖維具有更強(qiáng)的致病性［3-4］。在前期的研究中，利用Cryo-EM 的方法，本課題組解析了高分辨率PrP纖維的三維結(jié)構(gòu)，揭示了PrPC發(fā)生錯(cuò)誤折疊聚集形成PrP纖維過程中其構(gòu)象的轉(zhuǎn)化分子機(jī)制，在這個(gè)過程中PrPCC 端的α2 和α3 發(fā)生構(gòu)象重新折疊，形成6個(gè)β 折疊結(jié)構(gòu)，分子內(nèi)的二硫鍵（Cys179 和Cys214 之間）可以穩(wěn)定PrP 纖維結(jié)構(gòu)形態(tài)［12］。那么體外組裝形成的PrP纖維是否可以誘導(dǎo)內(nèi)源PrP聚集？是否具有細(xì)胞毒性？這些問題都值得探索。因此，本文進(jìn)一步深入到細(xì)胞水平和動(dòng)物水平研究PrP 纖維對(duì)細(xì)胞內(nèi)源PrP 積聚的影響，揭示PrP纖維誘導(dǎo)內(nèi)源PrP積聚和毒性的機(jī)制。

首先，利用超速離心結(jié)合Western blot 實(shí)驗(yàn)研究PrP 纖維對(duì)內(nèi)源PrP 聚集能力的影響，朊病毒假說認(rèn)為，PrPSc可以作為模板誘導(dǎo)細(xì)胞型PrPC發(fā)生錯(cuò)誤折疊，形成PrPSc［1-2，4，11］。實(shí)驗(yàn)選用穩(wěn)定表達(dá)含F(xiàn)lag標(biāo)簽的人野生型PrP HEK-293T細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)10 μmol/L PrP纖維處理都使得細(xì)胞內(nèi)PrP聚集體顯著增多，PrP 聚集體相對(duì)含量為對(duì)照組的3 倍左右，表明PrP纖維具有和PrPSc類似的性質(zhì)，可以誘導(dǎo)內(nèi)源PrP發(fā)生錯(cuò)誤折疊，形成聚集體。

其次，利用MTT、流式細(xì)胞技術(shù)和細(xì)胞超薄切片等方法研究了PrP 纖維誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)氧化壓力、細(xì)胞凋亡水平和線粒體損傷的影響。選用了RK13 細(xì)胞、SH-SY5Y 細(xì)胞和HEK-293T 細(xì)胞進(jìn)行PrP 纖維引起的細(xì)胞毒性方面的研究發(fā)現(xiàn)，PrP 纖維可以誘導(dǎo)SH-SY5Y 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中氧化壓力升高；通過流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PrP纖維可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡；通過細(xì)胞超薄切片結(jié)合透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，PrP纖維可以引起細(xì)胞中線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的異常，空泡化嚴(yán)重，這可能會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞功能體系異常，引起代謝功能紊亂。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PrP纖維可以通過誘導(dǎo)內(nèi)源PrP的聚集，引起細(xì)胞內(nèi)氧化壓力的升高和線粒體損傷，同時(shí)PrP纖維還可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。但是，對(duì)于PrP纖維誘導(dǎo)細(xì)胞氧壓升高和凋亡的機(jī)制仍不清楚。

最后，在動(dòng)物水平研究了PrP纖維對(duì)前額葉皮層內(nèi)源PrP聚集的影響。朊病毒病的病理特征為腦組織出現(xiàn)海綿樣病變，其主要發(fā)病部位會(huì)隨著疾病的不同而發(fā)生改變，如對(duì)于CJD、格斯特曼氏綜合征（Gerstmann-Str?ussler-Scheinker，GSS）病和人的庫(kù)魯病（Kuru），PrPSc主要位于海馬和大腦皮層，相比之下，致死性家族性失眠（fatal familial insomnia，F(xiàn)FI）中PrPSc主要集中在丘腦［3］。研究人員用人源的Kuru和vCJD疾病的PrPSc去感染穩(wěn)定表達(dá)人野生型PrP 的小鼠，發(fā)現(xiàn)PrPSc在前額葉皮層、海馬組織的丘腦中有大量沉積［22］。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇分離新生小鼠前額葉作為研究對(duì)象，因?yàn)樾律∈蟮纳窠?jīng)元尚未完全分化，較敏感，相對(duì)容易被感染。將新生小鼠前額葉皮層進(jìn)行橫斷切片，接種PrP 纖維進(jìn)行培養(yǎng)，通過超速離心結(jié)合Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PrP纖維可以誘導(dǎo)新生小鼠前額葉中內(nèi)源PrP 的聚集，具有類似于PrPSc的性質(zhì)。

研究表明，PrPC主要定位于細(xì)胞膜上，細(xì)胞膜上的PrPC可以通過其N 端的柔性區(qū)域KKRPKP 與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1 （low-density lipoprotein receptor-related protein 1，LPR1）發(fā)生相互作用，通過內(nèi)吞途徑進(jìn)入胞質(zhì)［27-28］。體外重組的PrP 纖維和PrPSc的N 端柔性區(qū)域KKRPKP 具有和PrPC相似的特征，都可以通過其N端的柔性序列KKRPKP與LPR1發(fā)生相互作用，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)吞，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)［12-13，29-32］。本文中，體外組裝的人源PrP纖維結(jié)構(gòu)表明，其N端的KKRPKP處于無序結(jié)構(gòu)游離在纖維表面［12］，因此接種在腦片上的PrP 纖維和接種于細(xì)胞中的PrP 纖維種子都可以通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而誘導(dǎo)內(nèi)源PrP發(fā)生聚集，引起細(xì)胞毒性。

本文的研究結(jié)果從細(xì)胞和動(dòng)物兩個(gè)層面證明了PrP 纖維可以誘導(dǎo)內(nèi)源PrP 的聚集。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本文提出了一種PrP 纖維致病機(jī)制的模型：PrP 纖維通過與細(xì)胞內(nèi)源PrP 相互作用，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)PrP 發(fā)生錯(cuò)誤折疊，形成聚集體，PrP 纖維聚集體可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化壓力升高和細(xì)胞凋亡，同時(shí)引起線粒體損傷，這會(huì)進(jìn)一步誘發(fā)細(xì)胞代謝功能紊亂，引發(fā)一系列朊病毒病相關(guān)臨床癥狀（圖5）。

Fig. 5 PrP fibrils prepared in vitro exhibit cytotoxicity to mammalian cells and are transmissible to induce the misfolding of endogenous PrPC

4 結(jié) 論

本文在細(xì)胞和動(dòng)物水平證實(shí)體外組裝的PrP淀粉樣纖維具有細(xì)胞毒性和潛在的感染性。這些淀粉樣纖維不僅可以在細(xì)胞水平誘導(dǎo)PrP發(fā)生錯(cuò)誤折疊，還可以誘導(dǎo)新生小鼠前額葉內(nèi)源PrP發(fā)生錯(cuò)誤折疊。