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    全長(zhǎng)朊粒蛋白淀粉樣纖維引發(fā)細(xì)胞毒性的機(jī)制研究*

    2023-05-16 07:53:08王利強(qiáng)袁菡燁郝苗苗朱海麗
    關(guān)鍵詞:朊病毒聚集體內(nèi)源

    王利強(qiáng) 袁菡燁 陶 菁 郝苗苗 陳 杰 朱海麗 梁 毅**

    (1)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,武漢大學(xué)泰康生命醫(yī)學(xué)中心,武漢 430072;2)湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,咸寧 437100)

    朊病毒?。╬rion disease),又被稱為傳染性海綿狀腦?。═SEs),是一類由朊粒蛋白(PrP)在神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)生錯(cuò)誤折疊、聚集成具有致病能力的PrPSc誘發(fā)的致死性神經(jīng)退行性疾病。此疾病可在多種哺乳動(dòng)物之間傳播,病死率很高。人類患有朊病毒病的臨床癥狀常常表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)功能障礙、癡呆和腦淀粉樣病變等[1-4]。1997年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主Stanley B. Prusiner 最先描述了朊病毒(prions),即蛋白質(zhì)感染因子[1-2]。常見的朊病毒病包括在牛群中傳播的瘋牛?。╞ovine spongiform encephalopathy,BSE)、羊的瘙癢?。⊿crapie)以及人類之間少量存在的克雅氏病(Creatzfeldt-Jakob disease,CJD)等[1-8]。該疾病的潛伏期很長(zhǎng),一般可達(dá)到數(shù)十年,發(fā)病周期很短,病人一旦發(fā)病,往往在一年內(nèi)死亡。

    盡管朊病毒病是一種罕見的神經(jīng)退行性疾病,但由于它獨(dú)有的生物學(xué)特征及其種間傳播的性質(zhì),一直是近年來研究的熱點(diǎn)[3,9]。朊病毒是一類可以自我復(fù)制、具有感染性的蛋白質(zhì)聚集體,其可在大腦中積累沉淀,影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能,其病變特征包括神經(jīng)元丟失、腦中海綿狀變形及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞病變等[10]。朊病毒病的發(fā)病機(jī)制主要是細(xì)胞型朊粒蛋白(PrPC)發(fā)生構(gòu)象重排,形成具有致病能力的PrPSc,PrPSc可以與PrPC發(fā)生相互作用,緊密結(jié)合在一起,誘導(dǎo)PrPC發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)化,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和聚集的級(jí)聯(lián)反應(yīng),這些特征是朊病毒在宿主間傳播的基礎(chǔ)[1-2,4,11]。

    近年來,隨著冷凍電鏡(cryo-EM)技術(shù)的發(fā)展,科學(xué)家們已逐步揭示了朊病毒的致病構(gòu)象轉(zhuǎn)化機(jī)制[12-13]。本實(shí)驗(yàn)室和中國(guó)科學(xué)院生物與化學(xué)交叉研究中心劉聰教授實(shí)驗(yàn)室合作,利用cryo-EM的方法解析了全長(zhǎng)人野生型朊病毒淀粉樣纖維及其家族遺傳型朊病毒病病理突變體E196K 的淀粉樣纖維結(jié)構(gòu)[12-13],發(fā)現(xiàn)兩種纖維都是由兩根原纖維絲以左手螺旋的方式相互纏繞而成,野生型PrP纖維通過兩對(duì)鹽橋發(fā)生相互作用緊密結(jié)合在一起,PrP C端氨基酸170~229組成PrP纖維核心的6個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)[12],而E196K 兩股原纖維通過4 對(duì)鹽橋發(fā)生相互作用,形成一個(gè)長(zhǎng)的既親水又疏水的原纖維界面,纖維核心由其C端氨基酸175~217組成,包含5個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)[13]。

    體外形成的淀粉樣纖維和PrPSc具有相似特征,如主要具有β 折疊結(jié)構(gòu),并且具有蛋白酶K 抗性等[14-17]。用體外形成的淀粉樣原纖維注入到過表達(dá)人PrP的轉(zhuǎn)基因小鼠活體腦組織中,經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的孵育后,小鼠出現(xiàn)具有朊病毒病特征的神經(jīng)變性,表明其具有潛在的致病能力[18-20],但是,體外形成PrP淀粉樣纖維致病的分子機(jī)制仍不是很清楚。因此,本文利用生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)方法在細(xì)胞和動(dòng)物水平揭示了體外組裝的PrP淀粉樣纖維的細(xì)胞毒性和潛在的感染機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 PrP純化

    編碼全長(zhǎng)人源PrP(23~231)的質(zhì)粒是中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所肖庚富博士贈(zèng)送。利用載體pET-30a(+)表達(dá)PrP 23~231序列,將載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞(Novagen,Merck,Darmstadt,Germany)中進(jìn)行培養(yǎng),用終濃度為1 mmol/L 的IPTG 溶液誘導(dǎo)PrP 表達(dá),收集菌體,用裂解緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl, 2 mmol/L EDTA, 0.1% TritonX-100,pH 7.4)裂解菌體并進(jìn)行超聲破碎,將裂解液在17 000g條件下離心30 min,棄上清,收集包涵體沉淀,將包涵體用緩沖液1(10 mmol/L Tris-HCl,0.5% Triton X-100,pH 7.4)、緩沖液2(10 mmol/L Tris-HCl, 2 mol/L NaCl, pH 7.4)、 緩 沖 液3(10 mmol/L Tris-HCl,2 mol/L Urea,pH 7.4)依次洗滌,并使用包涵體溶解液(10 mmol/L Tris-HCl,100 mmol/L Na2HPO4·12H2O, 8 mol/L Urea,pH 7.4)溶解包涵體。使用Ni-Sepharose 純化,獲得純度較高PrP 蛋白,將PrP 蛋白在蛋白質(zhì)復(fù)性緩沖 液(100 mmol/L Tris-HCl,6 mol/L Urea,pH 8.0)中透析過夜,然后采用高效液相色譜C4 柱(Shimadzu,Kyoto,Japan)純化,可獲得高純度PrP 蛋白[12,16,21]。將重組的PrP 在5 mmol/L Tris-HCl 緩沖液(pH 7.4)中透析,濃縮后于-80℃保存。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和質(zhì)譜分析證實(shí),純化的人源PrP純度較高,且具有完整的二硫鍵。使用NanoDrop One 微體積紫外可見分光光度計(jì)(Thermo Scientific,Waltham,MA)測(cè)其在280 nm處的吸光度,根據(jù)蛋白質(zhì)組成計(jì)算的摩爾消光系數(shù)(2.535)(http://web.expasy.org/protparam/) 來計(jì)算獲得人PrP的濃度。

    1.2 PrP纖維種子的制備

    將120 μmol/L全長(zhǎng)重組人源PrP在含有2 mol/L鹽酸胍(GdnHCl)和20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液(pH 7.4) 中孵育,在37°C 下180 r/min 振蕩9~11 h,收集PrP 原纖維。使用細(xì)胞破碎儀低功率條件超聲使纖維片段化形成種子,超聲5 s停5 s,超聲5 min。然后將纖維在5 mmol/L NaAc 緩沖液(pH 5.0) 中透析去除鹽酸胍。使用NanoDrop OneC微體積紫外可見分光光度計(jì)測(cè)量其在280 nm處的吸光度,然后根據(jù)PrP組成計(jì)算的摩爾消光系數(shù)(2.535)(http://web.expasy.org/protparam/)來測(cè)定PrP原纖維的濃度。

    1.3 透射電鏡觀察PrP纖維形態(tài)

    將10 μl的PrP纖維樣品(~13 μmol/L)滴在銅網(wǎng)上,孵育30 s,用濾紙吸走,再用H2O洗滌10 s。然后用2%(w/v)醋酸鈾酰染色30 s,在25°C的空氣中干燥。負(fù)染樣品使用JEM-1400 Plus 透射電子顯微鏡(JEOL,東京,日本)進(jìn)行觀察。

    1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

    HEK-293T 細(xì) 胞、 RK13 細(xì) 胞 和SH-SY5Y細(xì)胞使用Dulbecco's modified Eagle's medium(Gibco,Invitrogen,Mulgrave,VIC,Australia)培養(yǎng)基培養(yǎng),在培養(yǎng)基中添加10%(v/v)胎牛血清(Gibco)、100 U/ml 鏈霉素和100 U/ml 青霉素。然后將細(xì)胞放入含5% CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。利用慢病毒載體表達(dá)系統(tǒng)(pHAGE-puro)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)帶FLAG標(biāo)簽的全長(zhǎng)人PrP的HEK-293T細(xì)胞系和穩(wěn)定表達(dá)全長(zhǎng)人PrP 的SH-SY5Y 細(xì)胞系。將目標(biāo)cDNA 片段插入慢病毒載體,將含有目標(biāo)cDNA、pVSVG和p976的質(zhì)粒用Lipofectamine?2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)按2∶1∶1 的比例包裝在HEK-293T 細(xì)胞中。脂質(zhì)體與DNA 的比例為2∶1。轉(zhuǎn)染48 h后,收獲并過濾病毒,用包裝好的慢病毒分別感染HEK-293T 和SH-SY5Y 細(xì)胞2 次,每次感染12 h,間隔12 h。為了建立穩(wěn)定的細(xì)胞系,用嘌呤霉素篩選過表達(dá)細(xì)胞。蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢測(cè)各蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。

    1.5 MTT實(shí)驗(yàn)

    將穩(wěn)定表達(dá)帶FLAG 標(biāo)簽的全長(zhǎng)人PrP 的HEK-293T細(xì)胞接種在96孔板中。培養(yǎng)24 h后,將PrP 纖維種子(溶解于pH 5.0 的5 mmol/L NaAc 緩沖液中,母液濃度為100 μmol/L)以終濃度為0.01、0.1、1、10 μmol/L的濃度加入培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。將MTT 原液(5 g/L)用PBS 稀釋后加入孔中孵育4 h,直至細(xì)胞內(nèi)形成甲酰胺。MTT終濃度為0.5 g/L。最后,用二甲亞砜溶解深藍(lán)色甲醛晶體,然后使用Thermo Multiskan MK3 微孔板閱讀器(Thermo Scientific,Waltham,MA)測(cè)量其在492 nm處的吸光度。細(xì)胞活力用含有PrP纖維處理過的樣品吸光度除以5 mmol/L NaAc 緩沖液(pH 5.0)處理過的樣品吸光度得到的百分比表示。其最終數(shù)據(jù)用5 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)所得值的平均值±SD(標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

    1.6 Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PrP聚集

    穩(wěn)定表達(dá)帶FLAG 標(biāo)簽的全長(zhǎng)人PrP 的HEK-293T細(xì)胞培養(yǎng)1 d后,加入1~10 μmol/L PrP原纖維種子(溶解于pH 5.0 的5 mmol/L NaAc 緩沖液中,母液濃度為100 μmol/L)孵育2 d。收集HEK-293T細(xì)胞,在含有1% Triton X-100、50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L 苯甲磺酰氟和蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液(pH 7.6)中重懸細(xì)胞半小時(shí)。將細(xì)胞裂解液10 000g離心10 min。留出一半上清,另一半上清與1% 十二烷基肌氨酸鈉(Sarkosyl)在37℃下孵育半小時(shí)。然后將混合物在150 000g下超離心半小時(shí),并用PBS(pH 7.4)洗滌沉淀一次。將Sarkosyl 不溶性蛋白在SDSPAGE 上樣緩沖液中煮沸15 min,另一半上清作為總蛋白質(zhì)樣品,也在SDS-PAGE上樣緩沖液中煮沸15 min。樣品用12.5% SDS-PAGE 分離,然后進(jìn)行Western blot。用抗FLAG單克隆抗體對(duì)這些細(xì)胞的Sarkosyl 不溶性PrP 聚集體進(jìn)行檢測(cè),并用抗FLAG和抗β-actin抗體對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行檢測(cè)。使用BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒(Beyotime)將細(xì)胞裂解液進(jìn)行定量。為了計(jì)算Sarkosyl 不溶性PrP 的數(shù)量,使用ImageJ 軟件(NIH,Bethesda,MD)確定PrP 條帶的密度,進(jìn)而計(jì)算Sarkosyl 不溶性PrP聚集體占總蛋白質(zhì)的比例。Sarkosyl不溶性實(shí)驗(yàn)由3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)獲得的平均值±SD表示。

    1.7 Western blot檢測(cè)小鼠前額葉組織中PrP聚集

    選取7~14 d的新生小鼠,斷頸處死,放入75%乙醇中浸泡消毒,迅速分離全腦。在預(yù)冷的培養(yǎng)基中分離前額葉,使用McIlwain 組織切片機(jī)將分離的前額葉進(jìn)行橫斷切片,厚度固定為400 μm,將切好腦片置于Millicell-Cell Culture Inserts微孔膜上(0.4 μm,Millipore),放入6 孔板中,然后加入1 ml包含2% B27、98% Neurobasal-A Medium(Thermo scientific,Rockford,IL,USA)以及100 U/ml 青霉 素 和 100 mg/L鏈霉素 (Gibco (Thermo scientific),Rockford,IL,USA)的培養(yǎng)基,腦片不需要其他處理,2 d 后,更換新鮮培養(yǎng)基。向腦片上接種10 μl、1 μmol/L PrP 纖維種子(溶解于pH 5.0 的5 mmol/L NaAc 緩沖液中),繼續(xù)培養(yǎng)5 d。取出腦切片,在含有1% Triton X-100、50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L 苯甲磺酰氟和蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液(pH 7.6)中重懸細(xì)胞半小時(shí),使用超聲進(jìn)一步破碎細(xì)胞。10 000g的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心10 min 處理,將裂解液的上清小心用移液槍吸出保留,組織中不溶性沉淀遺棄。在上清中取出150 μl 用于測(cè)定內(nèi)源PrP 表達(dá)量,剩余細(xì)胞裂解液加入終濃度為1% Sarkosyl,室溫靜置30 min,在4℃下10 000g的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心10 min,收集上清。將上清在4℃下150 000g條件下超速離心30 min,吸去上清,將沉淀用PBS重懸,在4℃下150 000g再次離心30 min。沉淀中含有PrP 聚集體,用60 μl SDS-PAGE 上樣緩沖液重懸。在預(yù)留的細(xì)胞裂解液中加入5×SDS-PAGE 上樣緩沖液,和重懸的沉淀一起煮沸10 min,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。配置12.5%的SDS-PAGE變性膠,利用電泳分離蛋白質(zhì)樣品。使用抗8H4 抗體(Sigma-Aldrich)探測(cè)小鼠前額葉中Sarkosyl 不溶性PrP 蛋白。之后的轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育抗體等步驟和1.6相同。

    1.8 原子力顯微鏡(AFM)觀察PrP淀粉樣纖維的形態(tài)

    取10 μl 人野生型PrP 纖維樣品滴入云母片表面上孵育2 min,然后用10 μl 純凈水沖洗3次以去除未結(jié)合的原纖維,并在室溫下干燥。采用AFM(Bruker)的scanassist 模式在空氣中對(duì)云母表面的原纖維進(jìn)行探測(cè)。測(cè)量采用SCANASYST-AIR 探針。以1 Hz的掃描速率獲得固定分辨率(256×256數(shù) 據(jù) 點(diǎn)) 的AFM 圖 像, 并 使 用NanoScope Analysis 2.0軟件(Bruker)進(jìn)行分析。

    1.9 線粒體超薄切片

    選取沒有內(nèi)源PrP 表達(dá)的RK13 細(xì)胞研究PrP纖維對(duì)線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響,將構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)外源PrP 的RK13 細(xì)胞平鋪在6 孔板中培養(yǎng)1 d,然后加入0或10 μmol/L野生型PrP纖維種子(溶解于pH 5.0 的5 mmol/L NaAc 緩沖液中,母液濃度為100 μmol/L)共同培養(yǎng)3 d,用加入含有5 mmol/L NaAc 緩沖液(pH 5.0)的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。在用含3%多聚甲醛和1.5%戊二醛的PBS(pH 7.4)溶液固定后,收獲細(xì)胞,用1%鋨酸冰浴固定1 h,然后將樣品在分級(jí)丙酮中脫水,并包埋在812樹脂中。使用Leica Ultracut S 顯微鏡制備細(xì)胞超薄切片,并用2%醋酸鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行陰性染色。使用JEM-1400 Plus透射電子顯微鏡(JEOL)觀察細(xì)胞超薄切片中線粒體形狀、線粒體嵴完整性以及是否存在空泡化等。所有實(shí)驗(yàn)均通過生物重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

    1.10 細(xì)胞氧化壓力實(shí)驗(yàn)

    穩(wěn)定表達(dá)全長(zhǎng)人PrP的SH-SY5Y細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)1 d,然后加入終濃度為10 μmol/L PrP 纖維種子(溶解于pH 5.0 的5 mmol/L NaAc 緩沖液中,母液濃度為100 μmol/L)孵育2 d,利用活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒(碧云天,南通,中國(guó))檢測(cè)細(xì)胞ROS水平。具體過程如下:用PBS洗滌細(xì)胞2次,將ROS 試劑盒中DCFH-DA 探針用培養(yǎng)基稀釋,比例為1∶2 000,然后加入到細(xì)胞中,放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置20 min。吸去含有ROS 探針的上清,在細(xì)胞中加入培養(yǎng)基,進(jìn)行短暫孵育,用移液槍吸走,重復(fù)該步驟3 次。在細(xì)胞中加入胰酶消化,用滅菌的PBS將細(xì)胞進(jìn)行重懸處理,使用低轉(zhuǎn)速1 000g離心收集在離心管底部的細(xì)胞沉淀。在EPICS XL-MCL流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)上使用EXPO32 MultiComp 軟件(Beckman Coulter)測(cè)定含有ROS 的細(xì)胞總數(shù)(~10 000)的百分比(ROS水平)。以用5 mmol/L NaAc緩沖液(pH 5.0)孵育的穩(wěn)定表達(dá)全長(zhǎng)人PrP 的SH-SY5Y 細(xì)胞為對(duì)照。ROS水平表示為3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)所得值的平均值±SD。

    1.11 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

    穩(wěn)定表達(dá)全長(zhǎng)人PrP的SH-SY5Y細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)1 d,然后加入終濃度為10 μmol/L PrP 纖維種子(溶解于pH 5.0 的5 mmol/L NaAc 緩沖液中,母液濃度為100 μmol/L)孵育2 d。使用Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Beyotime)染色后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞。用2.5 g/L 胰蛋白酶(Promega,Madison,WI)消化后收獲細(xì)胞,在4°C下用PBS洗滌,并用185 μl的結(jié)合緩沖液重懸。然后將樣品與5 μl 的Annexin V-FITC 和10 μl 的PI 在4°C 的黑暗中孵育10 min。使用EPICS XL-MCL 流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter,F(xiàn)ullerton,CA)分析Annexin V 的結(jié)合,收集~2×104個(gè)細(xì)胞,計(jì)算凋亡細(xì)胞的百分比。以用5 mmol/L NaAc 緩沖液(pH 5.0)孵育的穩(wěn)定表達(dá)全長(zhǎng)人PrP 的SH-SY5Y細(xì)胞為對(duì)照。凋亡細(xì)胞百分比用3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD表示。

    1.12 數(shù)據(jù)分析

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±SD 表示,P值采用Student'st檢驗(yàn)確定。P<0.05 為具有顯著性差異。以下標(biāo)準(zhǔn)貫穿全文:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1 PrP纖維對(duì)內(nèi)源PrP聚集的影響

    將全長(zhǎng)人野生型PrP 與含有2 mol/L 鹽酸胍的20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液(pH 7.4)中共同孵育,放入在37℃搖床中振蕩9~11 h,獲得平臺(tái)期的PrP淀粉樣纖維。利用透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)PrP形成的淀粉樣纖維無明顯分叉和聚集現(xiàn)象,纖維長(zhǎng)而直(圖1a)。進(jìn)一步利用AFM輕敲模式檢測(cè)了人野生型PrP淀粉樣纖維的結(jié)構(gòu),從圖中可以明顯看出PrP 形成了均一性和分散性較好的纖維樣聚集體(圖2)。圖2b 是2a 中方框區(qū)域局部放大圖像,從中可以看到大部分纖維都是以左手螺旋的方式纏繞生長(zhǎng),纖維長(zhǎng)而直,并未有分叉現(xiàn)象,這種特征和利用透射電子顯微鏡觀察的結(jié)果相吻合。

    為了研究PrP淀粉樣纖維的致病機(jī)制,本文構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)含有FLAG 標(biāo)簽的PrP HEK-293T 細(xì)胞系,通過MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了外源加入PrP 纖維對(duì)穩(wěn)定表達(dá)PrP 的HEK-293T 細(xì)胞活力的影響。加入0.01~10 μmol/L PrP 纖維處理后的細(xì)胞活性與對(duì)照細(xì)胞的活性比值依次為94.54%、93.87%、89.32%和66.02%(圖1b)。通過顯著性定量分析發(fā)現(xiàn),在0.1 μmol/L 和1 μmol/L PrP 纖維處理?xiàng)l件下,細(xì)胞活性與對(duì)照組相比降低約10%,而10 μmol/L PrP纖維處理使得細(xì)胞活力降低約30%,表明PrP纖維可以降低細(xì)胞活力,且其影響具有濃度依賴效應(yīng),即濃度越高引起的細(xì)胞毒性越強(qiáng)(圖1b)。接著,用變性劑Sarkosyl溶解細(xì)胞中的PrP單體和寡聚體,通過超速離心分離細(xì)胞中Sarkosyl 不溶性聚集體,進(jìn)一步使用Western blot定量檢測(cè)了各PrP纖維處理?xiàng)l件下細(xì)胞中聚集體的含量,發(fā)現(xiàn)在HEK-293T細(xì)胞中,1 μmol/L PrP 纖維處理?xiàng)l件下PrP 聚集體相對(duì)含量和不加PrP纖維條件相比沒有明顯差異,而10 μmol/L PrP纖維處理則使得細(xì)胞內(nèi)PrP聚集體顯著增多(圖1c)。通過顯著性分析發(fā)現(xiàn),10 μmol/L PrP 纖維處理?xiàng)l件下形成的PrP 聚集體相對(duì)含量為對(duì)照組的2.7倍(圖1e)。這些實(shí)驗(yàn)表明,PrP纖維具有和PrPSc類似的性質(zhì),引起細(xì)胞毒性,同時(shí)誘導(dǎo)內(nèi)源PrP發(fā)生錯(cuò)誤折疊,形成聚集體。

    Fig. 1 PrP fibrils are cytotoxic,and transmissible to induce the misfolding of endogenous PrPC in cells and in the frontal cortices of infant mice

    Fig. 2 High-resolution AFM images of PrP fibrils

    2.2 PrP纖維對(duì)小鼠前額葉內(nèi)源PrP聚集的影響

    在細(xì)胞水平,實(shí)驗(yàn)表明PrP纖維具有和PrPSc類似的性質(zhì),可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)PrP發(fā)生錯(cuò)誤折疊,形成聚集體,那么在更復(fù)雜的腦組織中PrP纖維是否會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)源PrP 聚集?研究發(fā)現(xiàn),使用variant CJD病人的PrPSc感染小鼠過程中,PrPSc在小鼠前額葉皮層中會(huì)有大量積聚[22],因此本文選擇分離新生小鼠前額葉皮層進(jìn)行研究。

    使用去垢劑Sarkosyl 溶解前額葉中的PrP 單體和寡聚體,通過超速離心分離細(xì)胞中Sarkosyl不溶性聚集體,進(jìn)一步使用Western blot 定量檢測(cè)前額葉細(xì)胞中PrP 聚集體的含量。發(fā)現(xiàn)在前額葉皮層中,1 μmol/L PrPC處理?xiàng)l件下PrP 聚集體相對(duì)含量與對(duì)照組相比無明顯差異,而1 μmol/L PrP纖維處理則使得前額葉皮層中PrP 聚集體顯著增多(圖1d),通過顯著性分析發(fā)現(xiàn),1 μmol/L PrP纖維處理?xiàng)l件下形成的PrP聚集體相對(duì)含量為對(duì)照組的1.4倍(圖1f,P=0.018),這表明PrP纖維可以誘導(dǎo)小鼠前額葉皮層中內(nèi)源PrP的聚集。

    2.3 PrP纖維對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化壓力和細(xì)胞凋亡的影響

    研究表明,蛋白質(zhì)在細(xì)胞中發(fā)生錯(cuò)誤折疊、聚集會(huì)引起線粒體中氧化壓力的升高,進(jìn)而影響細(xì)胞功能使其紊亂,引起神經(jīng)元死亡[23-25]。那么外源加入PrP纖維是否會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)氧化壓力升高呢?本文利用DCFH-DA 活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)了PrP 纖維對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化壓力水平的影響,DCFH-DA 是一種ROS探針,在細(xì)胞內(nèi)被分解為DCFH,進(jìn)而可以與細(xì)胞中的活性氧反應(yīng)產(chǎn)生具有熒光的DCF。

    選用穩(wěn)定表達(dá)外源人PrP 的SH-SY5Y 細(xì)胞進(jìn)行氧化壓力測(cè)定,SH-SY5Y細(xì)胞是神經(jīng)母瘤細(xì)胞,其神經(jīng)細(xì)胞的特征使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更可信。在細(xì)胞中加入終濃度為10 μmol/L PrP 纖維處理細(xì)胞48 h(圖3b),對(duì)照組加入等體積的5 mmol/L NaAc(pH 5.0)(圖3a),利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧化壓力。發(fā)現(xiàn)PrP纖維處理的實(shí)驗(yàn)組和5 mmol/L NaAc(pH 5.0)處理的對(duì)照組相比,細(xì)胞內(nèi)氧化壓力值從2.12%(圖3a)上升至64.46%(圖3b),細(xì)胞內(nèi)氧化壓力顯著升高(P=0.000 41)(圖3c)。這些結(jié)果表明,PrP纖維可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)源PrP發(fā)生聚集,進(jìn)一步誘導(dǎo)引起的細(xì)胞內(nèi)氧化壓力升高。

    本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),PrP 纖維可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)較高氧化壓力水平,過高的ROS 對(duì)細(xì)胞造成的損傷可能會(huì)通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡水平來反映,因此,進(jìn)一步檢測(cè)了PrP 纖維對(duì)穩(wěn)定表達(dá)外源人PrP 的SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡水平的影響。在SH-SY5Y 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中加入終濃度為10 μmol/L PrP 纖維處理48 h后,細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡和總凋亡水平依次為2.96%、 10.00% 和12.96% (圖3e), 相 較 于5 mmol/L NaAc(pH 5.0)處理的對(duì)照組細(xì)胞(分別為3.20%、2.34%和5.54%)(圖3d),其晚期凋亡水平顯著升高(P=0.000 13)(圖3f)。

    Fig. 3 PrP fibrils induce severe ROS production(P=0.000 41)and late apoptosis(P=0.000 13)in cells stably expressing PrPC

    2.4 PrP纖維對(duì)線粒體損傷的影響

    蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的異常聚集會(huì)引起細(xì)胞中氧化壓力應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致大量的氧自由基產(chǎn)生,會(huì)造成細(xì)胞中線粒體的損傷誘發(fā)一系列疾病的發(fā)生[26]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PrP 纖維可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)PrP 發(fā)生錯(cuò)誤折疊形成聚集體,同時(shí)誘導(dǎo)氧化壓力增強(qiáng),那么其對(duì)線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)是否會(huì)有影響?使用超薄切片技術(shù)結(jié)合透射電子顯微鏡觀察檢測(cè)了PrP纖維引起的線粒體損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,對(duì)照組人野生型PrP穩(wěn)轉(zhuǎn)RK13細(xì)胞中(圖4a,b),大部分線粒體呈現(xiàn)管狀或球形,線粒體嵴較完整(白色箭頭標(biāo)注)。而當(dāng)用10 μmol/L PrP 纖維處理細(xì)胞后(圖4c,d),線粒體損傷水平較對(duì)照組明顯增多(圖4e),形成多種形態(tài),線粒體內(nèi)的嵴發(fā)生斷裂,且排列錯(cuò)亂,逐步出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象(黃色箭頭標(biāo)注)(圖4c,d)。

    Fig. 4 PrP fibrils induce severe mitochondrial damage in cells stably expressing PrPC

    3 討 論

    蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊引起的神經(jīng)退行性疾病一直是近幾十年的研究熱點(diǎn),但是對(duì)于體內(nèi)相關(guān)樣本的采集和研究一直存在著各種各樣的制約因素,對(duì)于朊病毒病,由于PrPSc高度傳染性,使得研究其致病機(jī)制和解析其三維結(jié)構(gòu)的危險(xiǎn)系數(shù)大大增加,因此在體外模擬PrP 的聚集過程,研究PrP 纖維的致病機(jī)制是十分有必要的。諾貝爾獎(jiǎng)得主Prusiner教授課題組進(jìn)行了一系列研究,發(fā)現(xiàn)在過表達(dá)PrP的轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中接種PrP纖維,在經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的孵育后,轉(zhuǎn)基因小鼠會(huì)表現(xiàn)出朊病毒病相關(guān)的神經(jīng)退行性癥狀[18-20]。不同之處為病理?xiàng)l件下的PrPSc比體外形成PrP 纖維具有更強(qiáng)的致病性[3-4]。在前期的研究中,利用Cryo-EM 的方法,本課題組解析了高分辨率PrP纖維的三維結(jié)構(gòu),揭示了PrPC發(fā)生錯(cuò)誤折疊聚集形成PrP纖維過程中其構(gòu)象的轉(zhuǎn)化分子機(jī)制,在這個(gè)過程中PrPCC 端的α2 和α3 發(fā)生構(gòu)象重新折疊,形成6個(gè)β 折疊結(jié)構(gòu),分子內(nèi)的二硫鍵(Cys179 和Cys214 之間)可以穩(wěn)定PrP 纖維結(jié)構(gòu)形態(tài)[12]。那么體外組裝形成的PrP纖維是否可以誘導(dǎo)內(nèi)源PrP聚集?是否具有細(xì)胞毒性?這些問題都值得探索。因此,本文進(jìn)一步深入到細(xì)胞水平和動(dòng)物水平研究PrP 纖維對(duì)細(xì)胞內(nèi)源PrP 積聚的影響,揭示PrP纖維誘導(dǎo)內(nèi)源PrP積聚和毒性的機(jī)制。

    首先,利用超速離心結(jié)合Western blot 實(shí)驗(yàn)研究PrP 纖維對(duì)內(nèi)源PrP 聚集能力的影響,朊病毒假說認(rèn)為,PrPSc可以作為模板誘導(dǎo)細(xì)胞型PrPC發(fā)生錯(cuò)誤折疊,形成PrPSc[1-2,4,11]。實(shí)驗(yàn)選用穩(wěn)定表達(dá)含F(xiàn)lag標(biāo)簽的人野生型PrP HEK-293T細(xì)胞進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)10 μmol/L PrP纖維處理都使得細(xì)胞內(nèi)PrP聚集體顯著增多,PrP 聚集體相對(duì)含量為對(duì)照組的3 倍左右,表明PrP纖維具有和PrPSc類似的性質(zhì),可以誘導(dǎo)內(nèi)源PrP發(fā)生錯(cuò)誤折疊,形成聚集體。

    其次,利用MTT、流式細(xì)胞技術(shù)和細(xì)胞超薄切片等方法研究了PrP 纖維誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)氧化壓力、細(xì)胞凋亡水平和線粒體損傷的影響。選用了RK13 細(xì)胞、SH-SY5Y 細(xì)胞和HEK-293T 細(xì)胞進(jìn)行PrP 纖維引起的細(xì)胞毒性方面的研究發(fā)現(xiàn),PrP 纖維可以誘導(dǎo)SH-SY5Y 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中氧化壓力升高;通過流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PrP纖維可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡;通過細(xì)胞超薄切片結(jié)合透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),PrP纖維可以引起細(xì)胞中線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的異常,空泡化嚴(yán)重,這可能會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞功能體系異常,引起代謝功能紊亂。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PrP纖維可以通過誘導(dǎo)內(nèi)源PrP的聚集,引起細(xì)胞內(nèi)氧化壓力的升高和線粒體損傷,同時(shí)PrP纖維還可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。但是,對(duì)于PrP纖維誘導(dǎo)細(xì)胞氧壓升高和凋亡的機(jī)制仍不清楚。

    最后,在動(dòng)物水平研究了PrP纖維對(duì)前額葉皮層內(nèi)源PrP聚集的影響。朊病毒病的病理特征為腦組織出現(xiàn)海綿樣病變,其主要發(fā)病部位會(huì)隨著疾病的不同而發(fā)生改變,如對(duì)于CJD、格斯特曼氏綜合征(Gerstmann-Str?ussler-Scheinker,GSS)病和人的庫(kù)魯病(Kuru),PrPSc主要位于海馬和大腦皮層,相比之下,致死性家族性失眠(fatal familial insomnia,F(xiàn)FI)中PrPSc主要集中在丘腦[3]。研究人員用人源的Kuru和vCJD疾病的PrPSc去感染穩(wěn)定表達(dá)人野生型PrP 的小鼠,發(fā)現(xiàn)PrPSc在前額葉皮層、海馬組織的丘腦中有大量沉積[22]。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇分離新生小鼠前額葉作為研究對(duì)象,因?yàn)樾律∈蟮纳窠?jīng)元尚未完全分化,較敏感,相對(duì)容易被感染。將新生小鼠前額葉皮層進(jìn)行橫斷切片,接種PrP 纖維進(jìn)行培養(yǎng),通過超速離心結(jié)合Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PrP纖維可以誘導(dǎo)新生小鼠前額葉中內(nèi)源PrP 的聚集,具有類似于PrPSc的性質(zhì)。

    研究表明,PrPC主要定位于細(xì)胞膜上,細(xì)胞膜上的PrPC可以通過其N 端的柔性區(qū)域KKRPKP 與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1 (low-density lipoprotein receptor-related protein 1,LPR1)發(fā)生相互作用,通過內(nèi)吞途徑進(jìn)入胞質(zhì)[27-28]。體外重組的PrP 纖維和PrPSc的N 端柔性區(qū)域KKRPKP 具有和PrPC相似的特征,都可以通過其N端的柔性序列KKRPKP與LPR1發(fā)生相互作用,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)吞,進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[12-13,29-32]。本文中,體外組裝的人源PrP纖維結(jié)構(gòu)表明,其N端的KKRPKP處于無序結(jié)構(gòu)游離在纖維表面[12],因此接種在腦片上的PrP 纖維和接種于細(xì)胞中的PrP 纖維種子都可以通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),進(jìn)而誘導(dǎo)內(nèi)源PrP發(fā)生聚集,引起細(xì)胞毒性。

    本文的研究結(jié)果從細(xì)胞和動(dòng)物兩個(gè)層面證明了PrP 纖維可以誘導(dǎo)內(nèi)源PrP 的聚集。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本文提出了一種PrP 纖維致病機(jī)制的模型:PrP 纖維通過與細(xì)胞內(nèi)源PrP 相互作用,誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)PrP 發(fā)生錯(cuò)誤折疊,形成聚集體,PrP 纖維聚集體可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化壓力升高和細(xì)胞凋亡,同時(shí)引起線粒體損傷,這會(huì)進(jìn)一步誘發(fā)細(xì)胞代謝功能紊亂,引發(fā)一系列朊病毒病相關(guān)臨床癥狀(圖5)。

    Fig. 5 PrP fibrils prepared in vitro exhibit cytotoxicity to mammalian cells and are transmissible to induce the misfolding of endogenous PrPC

    4 結(jié) 論

    本文在細(xì)胞和動(dòng)物水平證實(shí)體外組裝的PrP淀粉樣纖維具有細(xì)胞毒性和潛在的感染性。這些淀粉樣纖維不僅可以在細(xì)胞水平誘導(dǎo)PrP發(fā)生錯(cuò)誤折疊,還可以誘導(dǎo)新生小鼠前額葉內(nèi)源PrP發(fā)生錯(cuò)誤折疊。

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