鄒承魯先生兩項(xiàng)被收入教科書的研究成果

王志新

（清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084）

1 蛋白質(zhì)功能基團(tuán)修飾及與活性喪失的定量關(guān)系

二十世紀(jì)五、六十年代是酶學(xué)研究的黃金時(shí)期，用化學(xué)修飾的方法研究酶的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系是當(dāng)時(shí)酶學(xué)研究的重要內(nèi)容，這也是鄒承魯先生一直都非常感興趣的領(lǐng)域。早年在劍橋大學(xué)讀研究生時(shí)，鄒先生用蛋白水解酶水解細(xì)胞色素c時(shí)就注意到，構(gòu)成酶活性部位的基團(tuán)雖然在空間結(jié)構(gòu)上聚集在一起，但這些氨基酸在一級(jí)序列上卻并不一定是相鄰的，可以位于肽鏈的不同位置。接下來的問題就是，對(duì)于一個(gè)含有幾百個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)分子來說，究竟哪些基團(tuán)與該蛋白質(zhì)的功能直接相關(guān)？鄒先生通過查閱大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，從20 世紀(jì)30年代開始，就有科學(xué)家用化學(xué)修飾的方法對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系進(jìn)行了研究，且已積累了豐富的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。但是，以往的相關(guān)研究大都停留在定性分析的階段，許多文獻(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的描述都僅限于“某種蛋白質(zhì)在經(jīng)過了某種試劑修飾后其功能就喪失了”。然而，一個(gè)酶分子究竟有多少個(gè)基團(tuán)被修飾了？修飾后酶活性到底喪失了多少？在被修飾的基團(tuán)中有多少個(gè)是酶活性所必需的？這些問題在文獻(xiàn)中基本未予回答。

鄒承魯先生從統(tǒng)計(jì)學(xué)的基本原理出發(fā)，經(jīng)過深入思考，并根據(jù)一些已有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不斷修正自己的思路，最終得出了一個(gè)描述蛋白質(zhì)功能基團(tuán)修飾與活性喪失之間關(guān)系的表達(dá)式：a=xr。下面，我們將給出該公式較詳細(xì)的推導(dǎo)過程。設(shè)體系中有s個(gè)酶分子，共有n個(gè)可以與修飾劑反應(yīng)的基團(tuán)；每個(gè)酶分子有q個(gè)（q=n/s）可反應(yīng)基團(tuán)，其中有r個(gè)是必需的；在這r個(gè)必需基團(tuán)中，只要任何一個(gè)被修飾，酶分子就會(huì)喪失活性。當(dāng)有m個(gè)修飾劑分子與酶分子發(fā)生反應(yīng)時(shí)，酶分子上平均每個(gè)可反應(yīng)基團(tuán)被修飾的分?jǐn)?shù)為m/n。若酶分子中的q個(gè)基團(tuán)與修飾劑反應(yīng)具有相同的速度常數(shù)且相互獨(dú)立，則m/n表示平均一個(gè)可反應(yīng)基團(tuán)被修飾的概率，而（1-m/n）表示一個(gè)基團(tuán)未被修飾的概率（注：在一些酶學(xué)教科書中，也將m/n=(m/s)/(n/s) =z/q表示平均每個(gè)酶分子中有z個(gè)基團(tuán)被修飾。盡管m/n和z/q兩者的數(shù)值相等，但物理意義并不相同。在推導(dǎo)鄒承魯公式時(shí)，采用z/q會(huì)造成一些概念上的混淆）。令A(yù)i（i=1，2，…，r）表示一個(gè)酶分子中第i個(gè)必需基團(tuán)是否被修飾的事件，P(Ai)表示事件Ai出現(xiàn)的概率。若A1，A2，…Ar相互獨(dú)立，則P(A1A2…Ar)=P(A1)P(A2)…P(Ar)。因此，當(dāng)有m個(gè)可反應(yīng)基團(tuán)被修飾后，保持天然活性的酶，只能是那些所有r個(gè)必需基團(tuán)都未被修飾的分子，其概率為必需基團(tuán)剩余分?jǐn)?shù)的r次方。剩余酶活性分?jǐn)?shù)可表示為：

或

其中x= 1 -(m n)。若以a1i（i=1，2，3，…）對(duì)x作圖，僅當(dāng)i=r時(shí)，相應(yīng)的圖呈線性關(guān)系，由此即可確定一個(gè)酶分子中必需基團(tuán)的數(shù)目。鄒先生還考慮了對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾的6種不同的可能情況，并結(jié)合文獻(xiàn)中已有的大量數(shù)據(jù)，針對(duì)各種不同情況逐一進(jìn)行了分析。他欣喜地發(fā)現(xiàn)全都與自己的理論計(jì)算相符合！鄒承魯先生于1962 年先后在《中國(guó)科學(xué)》上發(fā)表了中、英文論文［1］。隨后，鄒先生與許根俊先生等以木瓜蛋白酶、胰島素、胰蛋白酶等為材料做了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，確定了這些蛋白質(zhì)的必需基團(tuán)數(shù)。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)分子雖然常常含有多個(gè)同類基團(tuán)，但其中僅有少數(shù)為蛋白質(zhì)表現(xiàn)活性所必需。對(duì)于酶分子而言，其活性部位僅處于整個(gè)酶分子中有限的局部區(qū)域。這一結(jié)論改變了當(dāng)時(shí)的流行觀點(diǎn)，并為后來的大量實(shí)驗(yàn)所充分證明。鄒先生的方法在《中國(guó)科學(xué)》上發(fā)表后，并沒有馬上得到國(guó)際同行的重視。直到20 世紀(jì)70 年代，鄒先生的公式和作圖法才得到國(guó)際同行越來越多的引用和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。1979 年，Dixon 和Webb［2］在其著名的酶學(xué)教科書《酶》（第三版）中，詳細(xì)介紹了該方法，并將這一方法稱為“鄒氏作圖法”（Tsou's plot）。同年，英國(guó)著名的酶動(dòng)力學(xué)專家Cornish-Bowden在其專著《酶動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)》中也專門介紹了鄒氏作圖法［3］。2012 年，該書的第四版中依然保留了這一內(nèi)容，并對(duì)鄒承魯先生做了一個(gè)簡(jiǎn)短的介紹：“他在《中國(guó)科學(xué)》上發(fā)表的論文是一個(gè)范例——一個(gè)不能與外界交流的科研工作者是如何在資源匱乏的條件下，運(yùn)用自己的聰明才智取得成就”［4］。鄒先生的這一方法還被收入美、英、日、中等國(guó)的教科書和專著中［5-6］。由于這項(xiàng)工作，鄒先生和許根俊、孫玉琨、杜雨蒼、趙康源、周海夢(mèng)等獲得了1987年國(guó)家自然科學(xué)一等獎(jiǎng)。

我于1982 年初考上了中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所的研究生，師從鄒承魯先生。當(dāng)我在中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)研究生院上課時(shí)，從許根俊先生的《酶作用原理》一書知道了鄒氏公式和鄒氏作圖法。不過，該書中對(duì)于鄒氏公式的介紹很簡(jiǎn)單，沒有給出詳細(xì)推導(dǎo)過程。我到生物物理研究所圖書館查閱了鄒先生的論文和有關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)鄒氏公式僅在修飾反應(yīng)為假一級(jí)反應(yīng)的條件下得到了證明［7-8］，而對(duì)二級(jí)反應(yīng)的情況（如修飾劑滴定實(shí)驗(yàn)）缺少嚴(yán)格證明。我當(dāng)時(shí)正在上《概率論》課，覺得可以用概率論的方法研究這一問題。當(dāng)酶和修飾劑的濃度已知時(shí)，可以通過修飾劑對(duì)酶的滴定實(shí)驗(yàn)，確定酶修飾程度與其剩余活性的關(guān)系。將酶與修飾劑共同保溫一定時(shí)間，當(dāng)有m個(gè)修飾劑分子與酶發(fā)生反應(yīng)時(shí)，沒有失活的酶分子數(shù)是一個(gè)隨機(jī)變量，恰有k個(gè)酶分子沒有失活的概率為：

平均沒有失活的酶分子數(shù)為：

當(dāng)n-m>>r時(shí)，

因此，剩余酶活性分?jǐn)?shù)為：

由此可知，盡管公式（4）看起來非常復(fù)雜，在一般情況下竟然可以神奇地簡(jiǎn)化為鄒氏公式。這一實(shí)例也充分顯示了鄒先生擅長(zhǎng)用簡(jiǎn)單方法解決復(fù)雜問題的卓越才能。為了確認(rèn)所得結(jié)果的正確性，我請(qǐng)給我們上課的數(shù)學(xué)老師（科學(xué)院數(shù)學(xué)所的研究人員）審閱了我的論文。兩個(gè)星期后，老師告訴我——結(jié)果是正確的。1983 年，我從研究生院上完課回所開展研究工作后，向鄒先生提及了這一工作，他讓我先與研究所一位數(shù)學(xué)較好的老師討論一下。由于那位老師比較忙，加之所涉及的數(shù)學(xué)模型比較復(fù)雜，這一事情就被擱置了。1986 年初的一天，鄒先生忽然向我問及相關(guān)文章的情況，我說該論文已請(qǐng)數(shù)學(xué)所的老師看過，應(yīng)該沒有問題。鄒先生便建議我單獨(dú)署名，把論文投到《生物物理學(xué)報(bào)》，但文章投稿一年多，一直沒有得到回復(fù)。1987 年，鄒先生再次問起論文投稿的情況，我告訴鄒先生還沒有收到審稿意見。大概是鄒先生向《生物物理學(xué)報(bào)》編輯部問起此事，幾個(gè)星期后，我收到了《生物物理學(xué)報(bào)》編輯部的回復(fù)及文章修改意見，論文最終于1987 年9 月在《生物物理學(xué)報(bào)》上發(fā)表［9］。后來，我從研究室一位同事那里得知，1987 年國(guó)家自然科學(xué)一等獎(jiǎng)的報(bào)獎(jiǎng)名單中有我，只是在評(píng)獎(jiǎng)時(shí)，評(píng)委認(rèn)為我的文章發(fā)表不滿一年，根據(jù)規(guī)定不能作為得獎(jiǎng)人。此后，我們又將鄒氏作圖法推廣應(yīng)用到確定可逆配體結(jié)合以及蛋白質(zhì)折疊必需基團(tuán)（位點(diǎn)）數(shù)目的研究中，得到了一些有意義的結(jié)果［10-12］。正如一本教科書在介紹鄒氏作圖法時(shí)概括總結(jié)的：鄒氏作圖法確定必需基團(tuán)數(shù)目的意義在于，它不僅為蛋白質(zhì)化學(xué)修飾研究本身由定性描述轉(zhuǎn)入定量研究提供了依據(jù)和計(jì)算方法，而且對(duì)目前日益發(fā)展的蛋白質(zhì)工程來說，用這種簡(jiǎn)單而成熟的方法首先確定蛋白質(zhì)的必需基團(tuán)，也正是蛋白質(zhì)工程設(shè)計(jì)的必要前提和手段之一。

2 酶活性不可逆抑制動(dòng)力學(xué)理論及方法

鄒承魯先生的另一項(xiàng)重要科研成果是酶活性不可逆抑制動(dòng)力學(xué)研究。20 紀(jì)50 年代起，許多蛋白質(zhì)化學(xué)家開始尋找、合成可以專一修飾酶活性中心某些必需基團(tuán)的化合物，酶活性不可逆抑制動(dòng)力學(xué)也因此成為這一時(shí)期的研究熱點(diǎn)。不可逆抑制是指化學(xué)修飾劑與酶的某些必需基團(tuán)形成共價(jià)鍵，導(dǎo)致酶的活性部分或全部喪失，而且酶活性不能通過透析、凝膠過濾等物理手段除去修飾試劑而得到恢復(fù)。酶活性抑制動(dòng)力學(xué)研究對(duì)于闡明酶的作用機(jī)制具有重要意義，但大多數(shù)教科書中僅介紹了可逆抑制動(dòng)力學(xué)，對(duì)于不可逆抑制動(dòng)力學(xué)則很少提及。在完成了蛋白質(zhì)分子必需基團(tuán)修飾和酶活性喪失關(guān)系的理論和實(shí)驗(yàn)研究之后，鄒承魯先生開始思考酶活性的不可逆抑制動(dòng)力學(xué)問題。

1964 年夏天，鄒承魯先生在中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所做客座教授時(shí)，找到了解決該問題的關(guān)鍵。其核心思想是將酶、抑制劑和底物共同保溫，通過測(cè)定抑制劑存在時(shí)酶催化底物反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)過程，測(cè)定酶與抑制劑作用的動(dòng)力學(xué)參數(shù)及反應(yīng)機(jī)制。在抑制劑存在時(shí)，酶催化底物反應(yīng)可表示為：

其中E、I、S、P、ES、EI、EIS分別代表酶、抑制劑、底物、產(chǎn)物以及相應(yīng)的復(fù)合物。k+0和k'+0分別表示抑制劑與酶和酶-底物復(fù)合物作用的正向反應(yīng)速度常數(shù)，k-0和k'-0則表示相應(yīng)的逆向反應(yīng)速度常數(shù)。需要指出的是，這一機(jī)制與通常教科書中的可逆抑制反應(yīng)動(dòng)力學(xué)機(jī)制相同，只是用抑制劑與酶作用的反應(yīng)速度常數(shù)k+0和k-0代替了抑制常數(shù)KI（KI=k-0/k+0），用k'+0和k'-0代替了K'I。由于酶催化反應(yīng)的穩(wěn)態(tài)在毫秒或更短的時(shí)間內(nèi)即可建立，而對(duì)于不可逆抑制反應(yīng)來說，酶與抑制劑發(fā)生化學(xué)修飾反應(yīng)的過程通常在秒、分甚至更長(zhǎng)的時(shí)間范圍內(nèi)完成。如果我們假定：a. 在抑制劑存在時(shí)，酶催化反應(yīng)很快達(dá)到穩(wěn)態(tài)，而酶與抑制劑反應(yīng)為相對(duì)較慢的過程；b. 抑制劑濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶濃度（假一級(jí)反應(yīng)條件）；c. 在整個(gè)反應(yīng)過程中，底物濃度基本保持不變（初速度條件）。在同時(shí)滿足這些條件時(shí)，酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物生成與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系為：

其中：

A、B分別表示抑制劑與酶反應(yīng)的表觀正向速度常數(shù)和表觀逆向速度常數(shù)。對(duì)于不可逆抑制劑，B=0，公式（7）可簡(jiǎn)化為：

鄒承魯先生發(fā)現(xiàn)，在可逆抑制動(dòng)力學(xué)方面廣泛應(yīng)用的底物與抑制劑之間相互競(jìng)爭(zhēng)的概念，對(duì)不可逆抑制動(dòng)力學(xué)也同樣適用。不同的是，在可逆反應(yīng)中，底物對(duì)酶與抑制劑結(jié)合常數(shù)的影響決定了競(jìng)爭(zhēng)類型，而在不可逆反應(yīng)中，則是底物對(duì)抑制劑修飾酶的反應(yīng)速度常數(shù)的影響決定了競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。此外，鄒先生還對(duì)絡(luò)合型不可逆抑制動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了討論。1965 年，鄒先生在《生物化學(xué)和生物物理學(xué)報(bào)》上發(fā)表了他的研究結(jié)果［13-14］。就在鄒承魯先生準(zhǔn)備用實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證他的理論時(shí)，一場(chǎng)持續(xù)了十多年的政治運(yùn)動(dòng)迫使他中斷了這項(xiàng)研究。直到“文革”后，已經(jīng)調(diào)到中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所工作的鄒承魯先生才有機(jī)會(huì)繼續(xù)他對(duì)酶活性不可逆抑制動(dòng)力學(xué)的研究。1982 年，他的研究生田維熙用胰凝乳蛋白酶對(duì)17 年前提出的理論進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)表在美國(guó)《生物化學(xué)》（Biochemistry）雜志上，鄒先生1965 年提出的模型和動(dòng)力學(xué)方程則作為該論文的附錄［15］。鄒承魯先生與田維熙的論文發(fā)表后，很快得到了國(guó)際同行的注意，到2023 年，該論文已被引用超過400次，不但是鄒先生本人被引用最多的科研成果，也是那個(gè)年代中國(guó)科學(xué)家在國(guó)內(nèi)做出的最受關(guān)注的工作之一。20 世紀(jì)80 年代，鄒先生領(lǐng)導(dǎo)的研究組對(duì)酶活性不可逆抑制動(dòng)力學(xué)理論和實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了深入研究，包括乙酰膽堿脂酶的不可逆抑制及其重活化動(dòng)力學(xué)、雙底物酶活性不可逆抑制動(dòng)力學(xué)、胰蛋白酶慢可逆抑制動(dòng)力學(xué)等［16-20］。1988年，鄒承魯先生應(yīng)邀為國(guó)際重要酶學(xué)叢書《酶學(xué)進(jìn)展》撰寫了綜述文章［21］，他是第一位在該叢書上發(fā)表綜述的大陸科學(xué)家。1993 年，鄒先生的這項(xiàng)工作獲得了國(guó)家自然科學(xué)二等獎(jiǎng)。

我在讀研究生的時(shí)候，就開始參與這項(xiàng)研究工作。大約在1986 年夏天，鄒先生說，他的一位美國(guó)朋友詢問，酶活性不可逆抑制動(dòng)力學(xué)方法是否可以用到較復(fù)雜的酶催化反應(yīng)系統(tǒng)，由此啟發(fā)我們將該動(dòng)力學(xué)方法推廣應(yīng)用到雙底物酶催化反應(yīng)及其他復(fù)雜酶反應(yīng)系統(tǒng)。我們很快就推導(dǎo)出了幾種常見的雙底物酶反應(yīng)機(jī)制的抑制動(dòng)力學(xué)公式，并以肌酸激酶為例，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了我們的理論［18-19］。鄒先生對(duì)這一研究結(jié)果非常重視，專門邀請(qǐng)湯佩松先生來生物物理研究所聽我做報(bào)告。湯先生當(dāng)時(shí)已經(jīng)80 多歲了，走路還不太方便。聽完報(bào)告后，湯先生對(duì)我說這個(gè)問題他們已經(jīng)考慮了很多年，很高興我們解決了這一問題。此后，我們還將這一方法推廣應(yīng)用到其他較復(fù)雜的情況，包括慢緊結(jié)合抑制動(dòng)力學(xué)、變性劑對(duì)酶失活的影響、酶激活（復(fù)活）動(dòng)力學(xué)、酶解離-聚合動(dòng)力學(xué)等［22-33］。經(jīng)過鄒承魯先生研究組以及國(guó)內(nèi)外同行的共同努力，酶活性不可逆抑制動(dòng)力學(xué)已經(jīng)形成了一個(gè)完整的理論體系，許多酶學(xué)教科書都以較大篇幅介紹了這一研究成果［5，34-35］。

酶抑制動(dòng)力學(xué)的研究，無論是對(duì)酶作用機(jī)制、新陳代謝途徑等基礎(chǔ)研究，還是對(duì)藥物、毒理等應(yīng)用研究，都有非常重要的意義。許多常用藥物實(shí)際上就是酶抑制劑，而且不少還是不可逆抑制劑，鄒承魯先生的理論和方法為酶抑制劑類藥物的篩選提供了方便且有效的手段［36-39］。希望通過本文的介紹，能引起酶學(xué)領(lǐng)域同行的興趣，并將鄒先生的理論和方法應(yīng)用到自己的教學(xué)和研究工作中。