高胰島素血癥/高氨血癥綜合征一家系的遺傳學(xué)研究

321000 金華市婦幼保健院兒內(nèi)科第3病區(qū)

賴盼建 李小兵 王大燕 梅金枝

高胰島素血癥/高氨血癥（hyperinsulinism- hyperammonemia，HI/HA）綜合征是一種遺傳異質(zhì)性疾病，是引起先天性高胰島素血癥（congenitalhyperinsulinism，CHI）的第2 種常見病因[1-2]。目前已發(fā)現(xiàn)14 種相關(guān)基因變異會(huì)引起CHI，包括ABCC8、KCNJ11、GLUD1、GCK、HADH、SLC16A1、UCP2、HNF4A、HNF1A、HK1、PGM1、PPM2、CACNA1D、FOXA2[3]。不同類型CHI 患兒的臨床特征、治療方案及預(yù)后不盡相同[3-6]。HI/HA綜合征是GLUD1 基因突變引起的[7]。該基因位于染色體10q23.3 上，編碼線粒體谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GDH）[7]。GLUD1 基因突變降低了GDH 對(duì)三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）變構(gòu)抑制的敏感性，從而導(dǎo)致其活性異常增高[7]。HI/HA 綜合征的特點(diǎn)是反復(fù)發(fā)作、癥狀頻繁的低血糖和持續(xù)的輕度血氨濃度升高。本研究報(bào)道一個(gè)HI/HA 綜合征家系，通過全外顯子組測(cè)序（whole-exome sequencing，WES）鑒定出1 個(gè)GLUD1[c.1466C＞T（p.P489L）]雜合錯(cuò)義突變，并探討該變異位點(diǎn)所致疾病的臨床特點(diǎn)，以期提高對(duì)HI/HA 綜合征的認(rèn)識(shí)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 先證者，女，11 個(gè)月。因“反復(fù)低血糖2 個(gè)月，抽搐2次”于2020年4月13日至金華市婦幼保健院治療。測(cè)得最低血糖1.89 mmol/L，血胰島素21.73 mU/L，血C-肽3.75 nmol/L，血氨81 μmol/L，生長(zhǎng)激素、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、皮質(zhì)醇、促腎上腺素皮質(zhì)激素水平均在正常范圍內(nèi)。腹部CT 檢查未見胰腺影像學(xué)異常。血、尿有機(jī)酸代謝檢測(cè)均正常。腦電圖及頭顱MRI 檢查均未見異常。肝、腎功能檢查正常?；純合底阍缕蕦m產(chǎn)，出生體重3.0 kg，出生身高50 cm，Apgar 評(píng)分5、10 min 均為10 分。家族史：先證者父親喝啤酒后容易誘發(fā)低血糖，表現(xiàn)為四肢乏力、頭暈，既往認(rèn)為醉酒現(xiàn)象，未重視；先證者祖母有一次輸液時(shí)出現(xiàn)低血糖發(fā)作，表現(xiàn)為乏力、頭暈、面色蒼白，當(dāng)時(shí)測(cè)血糖2.1 mmol/L，平素偶有低血糖發(fā)作表現(xiàn)，補(bǔ)充糖分、進(jìn)食后能緩解，未治療。先證者祖母兄長(zhǎng)及其女兒也有類似低血糖發(fā)作，但家屬不愿意提供具體資料，拒絕基因檢測(cè)。患兒家系圖見圖1。

圖1 患兒家系圖

1.2 DNA 提取 在簽署知情同意書后，抽取先證者及其家系成員外周靜脈血各2 ml，置入EDTA 抗凝采血管。采用DNA 提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取血液樣本的基因組DNA，并用Qubit 2.0 型熒光計(jì)及0.8%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)所提供的DNA 樣本進(jìn)行質(zhì)檢，-20 ℃保存待用。

1.3 人全基因組異常的DNA 拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）檢測(cè) 利用提取好的DNA 構(gòu)建DNA 小片段文庫(kù)，利用Illumina NovaSeq 6000 測(cè)序儀（美國(guó)Illumina 公司）進(jìn)行高通量測(cè)序，使用Burrows-Wheeler Aligner（BWA）軟件將通過質(zhì)控的DNA 片段與參考序列（參考基因?yàn)閔g19 基因）進(jìn)行比對(duì)。數(shù)據(jù)質(zhì)控通過之后上傳智因診斷云平臺(tái)，對(duì)100 kb 及以上區(qū)間大小的CNV 進(jìn)行分析，分析CNV 區(qū)間所包括的基因，關(guān)聯(lián)Decipher、ClinVar、OMIM、DGV、ClinGen、ISCA等相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，分析注釋已報(bào)道的致病片段。

1.4 WES 采用美國(guó)IDT 公司的xGen?Exome Research Panel v1.0 捕獲探針與gDNA 文庫(kù)序列進(jìn)行液體雜交，富集外顯子，部分內(nèi)含子及部分非編碼區(qū)域，構(gòu)建整個(gè)外顯子文庫(kù)。利用Illumina NovaSeq 6000 測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序，目標(biāo)序列測(cè)序覆蓋度不低于99%。原始數(shù)據(jù)經(jīng)去除接頭、低質(zhì)量測(cè)序片段等質(zhì)控后得到干凈數(shù)據(jù)。使用BWA 軟件將測(cè)序序列與參考基因hg19 進(jìn)行比對(duì)，使用GATK 軟件對(duì)單核苷酸多態(tài)性和插入缺失突變（indels）（＜50 bp）等數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并使用SIFT 篩選次要等位基因頻率＜5%的非同義變異。所有變異和相關(guān)疾病均使用dbSNP、1000 基因組項(xiàng)目、ExAC、ESP、OMIM、Swiss var、HGMD、ClinVar SNP等疾病數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋。此外，Provean、SIFT、Polyphen2-HVAR、Polyphen2-HDIV 和Mutationtster 軟件包用于預(yù)測(cè)所有檢測(cè)到的變異的功能變化，MaxEntScan軟件用于評(píng)估剪接位點(diǎn)變異的影響。

1.5 Sanger 測(cè)序驗(yàn)證 采用Sanger 測(cè)序?qū)ο茸C者及其父母利用全外顯子組測(cè)序篩選出的候選基因進(jìn)行驗(yàn)證。引物設(shè)計(jì)采用Primer 6 軟件針對(duì)GLUD1 基因c.1466（exon11）C＞T（p.P489L）突變?cè)O(shè)計(jì)引物，上游為5'-TCATTGGCTCCTCACTTCCT-3'，下游為5'-TTGCCAGTCCAAACCCATG-3'，T 值為60 ℃。擴(kuò)增中所用試劑為Goldstar Taq mix，反應(yīng)體系為50 μl，使用儀器為ABI PCR擴(kuò)增儀。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃40 s，共30 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。對(duì)所得的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)行鑒定，然后對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行一代測(cè)序（ABI 3730 一代測(cè)序儀），獲得數(shù)據(jù)后采用DNASTAR軟件進(jìn)行序列分析和比對(duì)，排除掉二代測(cè)序中假陽(yáng)性的位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 高通量測(cè)序測(cè)CNV 的結(jié)果 先證者未檢測(cè)出染色體非整倍體或100 kb以上的已知基因組CNV，見圖2。2.2 WES 及Sanger 測(cè)序結(jié)果 WES 結(jié)果顯示，先證者存在GLUD1 基因的1 個(gè)變異c.1466（exon11）C＞T 雜合突變，p.P489L（p.Pro489Leu）（NM_005271）。Sanger 測(cè)序結(jié)果提示，先證者存在GLUD1 基因c.1466（exon11）C＞T雜合突變，其父親和祖母均存在該突變，而母親正常，見圖3。

圖2 患者DNA 拷貝數(shù)變異測(cè)序結(jié)果

圖3 患兒家系GLUD1 基因測(cè)序結(jié)果

2.3 突變位點(diǎn)致病性分析預(yù)測(cè)結(jié)果 先證者目標(biāo)區(qū)域平均測(cè)序深度155.33X，目標(biāo)區(qū)域覆蓋度達(dá)到99.70%，其中目標(biāo)區(qū)域達(dá)到20 以上的區(qū)域占全部芯片目標(biāo)捕獲區(qū)域的98.67%，芯片對(duì)目標(biāo)區(qū)域覆蓋良好。經(jīng)過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)GLUD1 基因的1 個(gè)變異c.1466（exon11）C＞T，p.P489L（p.Pro489Leu）（NM_005271）雜合錯(cuò)義突變。生物學(xué)致病等級(jí)：根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)指南（2019 年），變異為可能致病。綜合臨床分析，最終確定該突變?yōu)樵摷蚁档目梢芍虏⊥蛔儭?/p>

2.4 臨床治療及隨訪 先證者因2 個(gè)月內(nèi)抽搐發(fā)作2 次，飲食控制后血糖監(jiān)測(cè)頻繁低于3 mmol/L，故加用二氮嗪[5 mg/（kg·d）]口服治療，空腹血糖維持在3.9 mmol/L 以上，無(wú)抽搐發(fā)作。父親和祖母低血糖發(fā)作不頻繁，予飲食控制后無(wú)低血糖發(fā)作。祖孫3 人的血生化及血氨基酸檢測(cè)結(jié)果見表1。

3 討論

GLUD1 基因編碼線粒體GDH，它的激活突變引起HI/HA 綜合征[7]。GDH 在肝臟、胰腺β 細(xì)胞、腎臟和大腦中高度表達(dá)[8]。GDH 可以催化谷氨酸的氧化脫氫反應(yīng)生成a-酮戊二酸和氨。在胰腺β 細(xì)胞中，a-酮戊二酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)使ATP/二磷酸腺苷（ADP）升高，鉀離子通道關(guān)閉引起胰島素釋放。GDH 被亮氨酸變構(gòu)激活，并且被GTP 抑制[9]。GLUD1 基因的火花突變降低了該酶對(duì)GTP 變構(gòu)抑制的敏感性[10]。GTP 抑制作用喪失導(dǎo)致亮氨酸誘導(dǎo)的谷氨酸氧化為a-酮戊二酸，同時(shí)肝內(nèi)GHD 活性增加可引起血氨增加，并破壞尿素循環(huán)，使得血氨代謝途徑受損，導(dǎo)致血氨升高[11]。因此，高蛋白食物進(jìn)食后誘發(fā)低血糖發(fā)作，亮氨酸敏感性是該類疾病的特征。HI/HA 綜合征患者的血氨水平常常處于正常水平的3～5 倍，并且很難通過治療降至正常，持續(xù)HA 的機(jī)制目前尚未完全了解。

與ABCC8、KCNJ11 基因突變引起的CHI 相比，GLUD1 突變引起的CHI 癥狀通常較輕，出生時(shí)沒有巨大兒表現(xiàn)，低血糖發(fā)作年齡多在嬰兒晚期，大多數(shù)患者在2 歲前出現(xiàn)首發(fā)癥狀，平均5～6 個(gè)月[12-15]。HI/HA綜合征幾乎都伴有HA[16]，只有少數(shù)GLUD1 突變的患者血氨水平?jīng)]有升高[12，17]。其血氨水平很難通過治療降至正常，但臨床上不會(huì)出現(xiàn)HA 的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，如嗜睡、嘔吐、頭痛或急性高氨危象。持續(xù)HA 的機(jī)制：（1）GDH活性增強(qiáng)，使得谷氨酸產(chǎn)生氨增加；（2）谷氨酸的消耗增多，N-乙酰谷氨酸的產(chǎn)生減少，后者是血氨解毒第一步所必需的變構(gòu)活化劑[12]。癲癇常被報(bào)道與HI/HA綜合征有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，50%～80%的HI/HA綜合征患者會(huì)出現(xiàn)其他神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)，如精神發(fā)育遲緩和學(xué)習(xí)障礙[13，18]，大多數(shù)為癲癇患者。除少數(shù)患者外，HI/HA綜合征患者的神經(jīng)影像學(xué)表現(xiàn)正常。癲癇的風(fēng)險(xiǎn)與HA 無(wú)關(guān)，但推測(cè)可能是大腦GDH 活性改變導(dǎo)致[19]，它導(dǎo)致谷氨酸池的耗竭和谷氨酸與γ-氨基丁酸之間的失衡[13，18]。到目前為止，突變已被描述在GDH的變構(gòu)區(qū)編碼氨基酸的外顯子6、7、10、11和12中[16]。據(jù)報(bào)道，癲癇更頻繁地與外顯子6和7的突變相關(guān)[13]。

根據(jù)美國(guó)內(nèi)分泌學(xué)會(huì)2009 年成人低血糖癥診治指南[20]，患者血糖＜3 mmol/L 時(shí)，如同步的胰島素≥3 mU/L、C-肽≥0.20 nmol/L（0.6 ng/ml）、胰島素原≥47.17 ng/L（5 pmol/L），考慮為高胰島素性低血糖癥。本組家系3 例患者低血糖發(fā)作時(shí)，血胰島素、血C-肽檢測(cè)均高于正常值，血氨亦超出正常范圍，故臨床診斷符合HI/HA 綜合征。該組家系GLUD1 第11 外顯子區(qū)域c.1466C＞T（p.P489L）雜合錯(cuò)義突變，雖已有相關(guān)病例報(bào)道[12]，但為中國(guó)HI/HA 綜合征首次報(bào)道。Stanley[16]對(duì)c.1466（exon11）C＞T（p.P489L）位點(diǎn)突變可引起GDH 功能改變進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示基礎(chǔ)GDH 活性正常，但GTP 的半數(shù)最大抑制濃度比對(duì)照組高470%，提示GDH 活性過高。

綜上所述，患兒嬰兒期起病，存在低血糖家族史，需警惕CHI，并且對(duì)該類患者需常規(guī)進(jìn)行血氨測(cè)定，早期基因診斷，早期建立最佳的血糖控制，從而預(yù)防以后的神經(jīng)功能障礙。本組家系同樣的基因突變，但是子代低血糖癥狀比父代重，可能存在家族基因累積效應(yīng)，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。