咳嗽變異性哮喘患兒血miR-34a表達(dá)水平與免疫失衡狀態(tài)和炎癥反應(yīng)的關(guān)系研究

黃良龍 張利誠(chéng) 王濤 金曉輝

作者單位：314000 嘉興，中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)海警總隊(duì)醫(yī)院呼吸科

咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）是一種氣道的慢性炎癥反應(yīng)性疾病，屬于常見(jiàn)的非典型哮喘，主要或唯一表現(xiàn)為無(wú)喘息的陣發(fā)性夜間咳嗽[1]。有研究報(bào)道，CVA 在慢性咳嗽病因?qū)W中所占比例最高，為32.6%，是我國(guó)兒童慢性咳嗽最重要的病因之一[2]，有40%～50%的患兒可能進(jìn)展為典型哮喘[3]。CVA的特點(diǎn)是隱發(fā)、病程長(zhǎng)、反復(fù)發(fā)作，直接影響患者的學(xué)習(xí)、生活、工作、睡眠質(zhì)量，給患者及其家屬帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。近年來(lái)，miRNA 參與氣道疾病發(fā)病過(guò)程的研究受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)一些miRNA 參與哮喘、慢性阻塞性肺疾病等疾病的氣道慢性炎癥過(guò)程[4]，而其過(guò)程多由于Thl/Th2 免疫失衡導(dǎo)致相應(yīng)炎癥因子分泌變化[5]。研究報(bào)道，miR-34 家族與各種肺部疾病密切相關(guān)，miR-34a 參與哮喘過(guò)程，但目前研究鮮有探討miR-34a 與CVA 的關(guān)系[6]。因此，本研究以CVA 患兒和健康兒童為研究對(duì)象，探討血miR-34a 表達(dá)水平與CVA 患者免疫失衡狀態(tài)和炎癥反應(yīng)的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2019 年1 月至2021 年12 月中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)海警總隊(duì)醫(yī)院呼吸科收治的CVA 患兒92 例為研究對(duì)象（CVA 組），其中男48 例，女44 例；年齡4～14（8.04±1.93）歲；有家族過(guò)敏史43 例；有個(gè)人過(guò)敏史61 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《中國(guó)兒童慢性咳嗽診斷與治療指南（2013 年修訂）》[6]中CVA 的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）納入研究前患兒未經(jīng)系統(tǒng)治療；（3）血液標(biāo)本采樣前48 h 未使用激素類(lèi)、支氣管擴(kuò)張劑、白三烯受體拮抗劑、抗組胺類(lèi)等藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他嚴(yán)重肺部疾病；（2）合并其余部位感染；（3）合并其他免疫性疾?。唬?）合并其他腫瘤；（5）嚴(yán)重肝、腎功能損害。另選取同期在本院健康體檢的兒童86 名為健康組，其中男45 名，女41 名；年齡4～13（7.89±2.06）歲；有家族過(guò)敏史4 名；有個(gè)人過(guò)敏史3 名。兩組研究對(duì)象性別和年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），但家族過(guò)敏史和個(gè)人過(guò)敏史比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)，所有患兒監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法 （1）取入院當(dāng)天兩組研究對(duì)象清晨空腹外周靜脈血5 ml，將獲取的血液標(biāo)本置于EDTA 抗凝管中，搖晃混勻后靜置20 min，以5 000 r/min 轉(zhuǎn)速、3.5 cm半徑、4 ℃環(huán)境離心處理15 min，分層后吸取上層血清裝于EP 管中，在-80 ℃低溫冰箱中貯存待測(cè)。（2）血miR-34a 表達(dá)水平檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)血miR-34a 表達(dá)水平。使用Trizol 試劑（批號(hào)：R0016，上海Beyotime 公司）從血中提取總RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：D7180M，上海Beyotime 公司）將提取的總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，后PCR 擴(kuò)增儀（湖南圣洲生物科技有限公司，湘械注準(zhǔn)20212220277，型號(hào)：Cycler Z200）中擴(kuò)增，反應(yīng)體系20 μl，反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃30 s，95 ℃5 s，擴(kuò)增60 ℃44 s，40 個(gè)循環(huán)。U6 小核RNA（U6 small nuclear ribonucleoprotein particle，U6snRNA）引物序列，上游：5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3'，下游：5'-AAAATATGGAACGCTTCACGA-3'；miR-34a 引物序列，上游：5'-CGGTATCATTTGGCAGTGTCT-3', 下游：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。以U6snRNA 為內(nèi)參，以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-34a 相對(duì)表達(dá)水平。（3）使用全自動(dòng)血液分析儀（北京指真生物科技有限公司，京械注準(zhǔn)20192220036，型號(hào)：C511）檢測(cè)血嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophil，EOS）水平。（4）使用FACSVerse流式細(xì)胞儀（常州必達(dá)科生物科技有限公司，蘇械注準(zhǔn)20222221435，型號(hào)：BeamCyte-1025M）檢測(cè)Th1、Th2比例并計(jì)算兩者比值，具體方法參考文獻(xiàn)[7]。（5）血炎癥因子TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10 水平檢測(cè)：采用ELISA 法。ELISA 試劑盒（批號(hào)分別為20180701、20180506、20180805、20180305、20180302、20180603）購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，酶標(biāo)儀為邁瑞MR-96A 酶標(biāo)儀全自動(dòng)酶標(biāo)儀，嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson 相關(guān)分析CVA組患兒miR-34a 表達(dá)水平與EOS 水平、Th1/Th2 比值及炎癥因子水平的相關(guān)性；采用二元logistic 回歸分析影響CVA 發(fā)生的因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對(duì)象miR-34a表達(dá)水平比較 CVA組患兒血miR-34a 表達(dá)水平為0.56±0.21，明顯低于對(duì)照組的1.11±0.38，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.054，P＜0.01）。

2.2 兩組研究對(duì)象EOS 水平、Th1 及Th2 比例和Th1/Th2 比值比較 與健康組比較，CVA 組患兒血EOS 水平和Th2 比例明顯升高，Th1 比例和Th1/Th2 比值明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 兩組研究對(duì)象EOS水平、Th1及Th2比例和Th1/Th2比值比較

2.3 兩組研究對(duì)象炎癥因子水平比較 與健康組比較，CVA 組患兒血TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10 水平明顯升高，IFN-γ 和IL-2 水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 兩組研究對(duì)象炎癥因子水平比較（μg/L）

2.4 CVA 組患兒miR-34a 表達(dá)水平與EOS 水平、Th1/Th2 比值及炎癥因子水平的相關(guān)性分析 CVA組患兒血miR-34a 表達(dá)水平與Th1/Th2 比值呈正相關(guān)（r=0.663，P＜0.01），與EOS、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10 水平均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.606、-0.578、-0.490、-0.817、-0.787，均P＜0.01），而與IFN-γ、IL-2 均無(wú)相關(guān)性（r=0.046、0.137，均P＞0.05）。

2.5 影響CVA發(fā)生的因素分析 以miR-34a（具體檢測(cè)值）、EOS升高（＜0.50×109/L=0，＞0.50×109/L=1）、Th1/Th2 比值（具體檢測(cè)比值）、IL-6 降低（＞67.3 μg/L=0，＜67.3 μg/L=1）、IL-2（具體檢測(cè)值）、TNF-α（具體檢測(cè)值）、IFN-γ（具體檢測(cè)值）、IL-10（具體檢測(cè)值）、家族哮喘史（無(wú)=0，有=1）、個(gè)人過(guò)敏史（無(wú)=0，有=1）、家族過(guò)敏史（無(wú)=0，有=1）為自變量，以是否發(fā)生CAV 為因變量（發(fā)生=1，未發(fā)生=0），進(jìn)行二元logistic 回歸分析，結(jié)果顯示miR-34a 表達(dá)水平、Th1/Th2 比值均是影響CAV發(fā)生的獨(dú)立保護(hù)因素（均P＜0.05），而EOS水平升高、個(gè)人過(guò)敏史、IL-6 水平降低均是影響CAV 發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 影響CVA發(fā)生的二元logistic回歸分析

3 討論

CVA 是由免疫、遺傳和環(huán)境等多因素導(dǎo)致多種細(xì)胞和細(xì)胞因子受累的特殊的慢性復(fù)發(fā)性氣道疾病，其發(fā)病機(jī)制與典型哮喘相似，且抗生素對(duì)其無(wú)效。EOS、T 細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞及炎癥介質(zhì)參與CVA 患者的氣道慢性炎癥反應(yīng)，持續(xù)的炎癥損傷可加劇氣道高反應(yīng)性，患者通常在早晨和夜間咳嗽加劇，這對(duì)患者的日常生活和心理造成極大的影響[8]。miRNA 為長(zhǎng)度在19～30 個(gè)核苷酸之間的非編碼RNA，參與細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝、信號(hào)傳導(dǎo)和凋亡及與癌癥和炎癥相關(guān)的疾病過(guò)程[9]。有研究表明miR-34a 參與肺的發(fā)育和部分疾病的發(fā)生[10]。朱萍等[11]研究顯示，支氣管哮喘患者的血miR-34a 與氣道炎癥顯著相關(guān)。

本研究中，與健康組比較，CVA 組患兒血miR-34a表達(dá)水平降低、EOS 水平升高，與朱萍等[11]研究結(jié)果相似。與健康組比較，CVA 組患兒Th1 比例、Th1/Th2 比值、IFN-γ、IL-2 水平降低，EOS 水平、Th2 比例、TNFα、IL-4、IL-6、IL-10 水平升高，與王志剛等[12]、陳巧俊等[13]研究結(jié)果相近。CVA 患者的氣道慢性炎癥表現(xiàn)為EOS 水平升高、Th2 活化甚至Th1/Th2 免疫失衡，是導(dǎo)致哮喘的重要發(fā)病機(jī)制[14]。EOS 為反映氣道炎癥活動(dòng)的重要指標(biāo)，可分泌IL、細(xì)胞因子和EOS 陽(yáng)離子蛋白。當(dāng)EOS 過(guò)度活化時(shí)，EOS 陽(yáng)離子蛋白可引起肥大細(xì)胞大量釋放組胺，與IL、細(xì)胞因子等炎癥介質(zhì)共同損害氣道上皮細(xì)胞，暴露氣道內(nèi)皮下的刺激感受器，導(dǎo)致氣道高反映性[15]。Th1通過(guò)分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α等介質(zhì)調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫，Th2 則通過(guò)分泌IL-4、IL-6、IL-10等介質(zhì)介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。Th1、Th2 在正常機(jī)體內(nèi)中維持動(dòng)態(tài)平穩(wěn)，失衡則表示機(jī)體免疫功能紊亂[16]。

相關(guān)分析結(jié)果顯示，CVA 組患兒血miR-34a 與Th1/Th2 比值呈正相關(guān),與EOS、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10 水平均呈負(fù)相關(guān)；二元logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)miR-34a、Th1/Th2 比值均是影響CAV 發(fā)生的獨(dú)立保護(hù)因素，而EOS 水平升高、個(gè)人過(guò)敏史、IL-6 降低均是影響CAV 發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。提示miR-34a、Th1/Th2 比值、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10 均參與氣道炎癥的發(fā)生，且miR-34a 下降、Th1/Th2 比值下降、EOS 水平升高、IL-6 降低及個(gè)人過(guò)敏史會(huì)增加兒童發(fā)生CVA 的風(fēng)險(xiǎn)，可以作為診斷CVA 的指標(biāo)。有研究報(bào)道，IL-2、IL-4、IL-6 及IFN-γ 為調(diào)節(jié)Th1/Th2 平衡的關(guān)鍵，IL-2 可誘導(dǎo)Th0 細(xì)胞向Thl 細(xì)胞分化，IL-4、IL-6 可誘導(dǎo)Th0 細(xì)胞向Th2 細(xì)胞分化，IFN-γ則可抑制IL-4誘導(dǎo)T細(xì)胞分化[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-34a下降可導(dǎo)致CAV發(fā)生，結(jié)合上述研究，機(jī)制可能是miR-34 的下調(diào)導(dǎo)致EOS、IL-4、IL-6、IL-10 升高，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，且通過(guò)IL-4、IL-6誘導(dǎo)Th2 的分化，使Th1/Th2 比值降低，致免疫失衡，體液免疫增強(qiáng)，Th2 分泌的炎癥因子增多、惡性循環(huán)加重患者的氣道炎癥反應(yīng)和高反應(yīng)性。據(jù)目前研究報(bào)道，miR-34a 可通過(guò)介導(dǎo)MAPK 信號(hào)通路、Notch 信號(hào)通路及影響自噬，致炎癥因子增加，從而影響支氣管哮喘、過(guò)敏性鼻炎患者氣道炎癥反應(yīng)，但以上機(jī)制是否與CVA 氣道炎癥的發(fā)生相關(guān)還有待研究[11,19]。

綜上所述，CVA 患兒血miR-34a 表達(dá)下調(diào)，可能通過(guò)上調(diào)EOS 水平和下調(diào)Th1/Th2 比例，促進(jìn)IL-6 分泌，進(jìn)而誘發(fā)CVA。本研究不足之處在于無(wú)法判斷這些影響因素的因果關(guān)系，需進(jìn)一步對(duì)CVA 與miR-34a 研究。