胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中CD117 的臨床病理意義和KIT突變檢測

沈文艷 周泉 許建秋 胡曉嵐 于亞威

作者單位：314000 嘉興市第二醫(yī)院病理科

神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（neuroendocrine neoplasms，NEN）泛指所有起源于肽能神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，從表現(xiàn)為惰性、緩慢生長的低度惡性到高轉(zhuǎn)移性等明顯惡性的一系列的異質(zhì)性腫瘤。神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞遍布全身各處，因此NEN 可以發(fā)生在體內(nèi)任何部位，在過去10 年中，NEN 的年發(fā)病率已上升至每10 萬人中超過3例，具體取決于原發(fā)部位。其中以胃腸胰NEN（gastroenteropancreatic neuroendocrine neoplasms，GEP-NEN）最常見，約占所有NEN 的2/3[1]。CD117 作為KIT 原癌基因（kit proto-oncogene，KIT）的蛋白表達(dá)產(chǎn)物，是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白。胃腸道間質(zhì)瘤、白血病、黑色素瘤、小細(xì)胞肺癌等多種人類腫瘤組織中均存在CD117 的異常表達(dá)和KIT 基因突變。近年來，許多研究者把CD117 作為分子靶向治療的新課題進(jìn)行研究[2-3]。本研究旨在探討GEP-NEN 中CD117 表達(dá)的臨床病理意義及與預(yù)后的相關(guān)性，通過檢測CD117表達(dá)陽性的GEP-NEN 中KIT 基因突變識別可能存在的突變位點(diǎn)。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2011 年1 月至2019 年12 月嘉興市第二醫(yī)院收治的GEP-NEN 患者111 例，男60 例，女51例；發(fā)病年齡30～67 歲，中位年齡55 歲；腫瘤直徑為1～7 cm，中位數(shù)為2.1 cm。復(fù)習(xí)患者HE 染色切片，并根據(jù)《世界衛(wèi)生組織消化系統(tǒng)腫瘤分類》（第5 版）[4]進(jìn)行分類，其中神經(jīng)內(nèi)分泌瘤（neuroendocrine tumor，NET）G1（核分裂計(jì)數(shù)＜2/10 HPF，Ki-67＜3%）70 例，NET G2[核分裂計(jì)數(shù)（2～20）/10 HPF，Ki-67 3%～20%]14 例，NET G3（核分裂計(jì)數(shù)＞20/10 HPF，Ki-67＞20%）2 例，神經(jīng)內(nèi)分泌癌（neuroendocrine carcinoma，NEC）（分化差，高級別腫瘤）25 例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過（倫理編號：jxey-2017037）。

1.2 主要試劑和儀器 CD117 兔抗人單克隆抗體（批號：YR145）購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；Ki-67 兔抗人單克隆抗體（批號：MyR1-ki67）及p53 鼠抗人單克隆抗體（批號：MyM1-P53）均購自杭州安必平醫(yī)藥科技股份有效公司；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（retinoblastoma，Rb）鼠抗人單克隆抗體（批號：13A10）及生長抑素受體（somatostatin receptor2，SSTR2）兔抗人單克隆抗體（批號：EP149）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；二抗通用試劑及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）（批號：41365748C）試劑均購自丹麥Dako 公司。石蠟組織DNA 提取試劑盒（批號：2020073001）購自基因科技（上海）股份有限公司；PCR 儀（型號：伯樂T1000）購自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；測序儀（ABI 3500XL DX）購自新加坡Life Technologies 公司。

1.3 CD117 表達(dá)檢測 采用免疫組化En Vision 染色法。常規(guī)石蠟包埋組織，3 μm 厚切片，75 ℃烤片1 h，常規(guī)脫蠟脫水后用pH 9.0 的EDTA 作為抗原修復(fù)液，100 ℃煮沸修復(fù)20 min，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶6 min，滴加CD117 一抗室溫孵育2 h，二抗室溫孵育0.5 h，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹脂封固。鑒別NET G3 和NEC 有困難時(shí)加做Ki-67、p53、Rb 和SSTR2檢測。在進(jìn)行CD117 免疫組化染色時(shí)以既往染色陽性的胃腸間質(zhì)腫瘤作為陽性對照，PBS 代替一抗作為空白對照，瘤旁正常組織作為自身正常對照。

1.4 免疫組化染色判讀標(biāo)準(zhǔn) CD117 表達(dá)是否陽性需要在高倍鏡（400 倍）下觀察細(xì)胞著色程度，陽性細(xì)胞的細(xì)胞膜及胞質(zhì)為棕黃色，高倍鏡下取4 個(gè)不同視野各計(jì)數(shù)200 個(gè)癌細(xì)胞，按陽性細(xì)胞所占百分比分為陰性（不顯色或陽性細(xì)胞所占百分比＜10%）和陽性（陽性細(xì)胞所占百分比≥10%）[5]。Rb 以胞核著色為陽性。SSTR2 以細(xì)胞膜染色強(qiáng)度分為陰性（無染色）、弱陽性（黃色）、中等陽性（棕黃色）和強(qiáng)陽性（棕褐色），以胞膜線性中等強(qiáng)度以上染色為陽性著色。Ki-67 陽性指數(shù)挑選表達(dá)最強(qiáng)的區(qū)域計(jì)數(shù)500～2 000 個(gè)細(xì)胞，再計(jì)算出陽性百分比[6]；p53 蛋白彌漫細(xì)胞核著色（≥75%）或完全陰性定義為突變型表達(dá)。

1.5 KIT 基因突變檢測 由杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心對CD117 表達(dá)陽性的1 例NET G3 和10 例NEC 標(biāo)本的KIT 基因外顯子9、11、13、17 進(jìn)行突變檢測。按照石蠟組織DNA 提取試劑盒中相關(guān)說明仔細(xì)提取蠟塊組織的DNA，以PCR 擴(kuò)增KIT 基因中的外顯子9、11、13、17。PCR 反應(yīng)體系（50 μl）：甜菜堿5 μl，5×Go Taq Buffer 10 μl,MgCl26 μl,dNTP 1 μl,P1 0.5 μl,P2 0.5 μl,Go Taq 酶0.2 μl,ddH2O 24.8 μl,DNA 2 μl。反應(yīng)條件：95 ℃變性3 min；95 ℃15 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，循環(huán)40 次，最后72 ℃5 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳確定后，然后進(jìn)行Sanger 測序，用ABI 3500XL DX 測序儀進(jìn)行序列分析，有突變的標(biāo)本再進(jìn)行反向測序證實(shí)，確定基因突變類型。

1.6 隨訪 通過電話對患者進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間從確診之日算起，截止日期為2020 年12 月31 日，在隨訪期內(nèi)出現(xiàn)患者死亡則終止隨訪。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線，并行l(wèi)og-rank 檢驗(yàn)和多因素Cox 回歸分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GEP-NEN 患者CD117 的表達(dá) CD117 主要表達(dá)于GEP-NEN 細(xì)胞膜，也可表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中（圖1）。GEP-NEN 患者CD117 陽性表達(dá)率為18.9%（21/111），其中NET 和NEC 患者CD117 陽性表達(dá)率分別為12.8%（11/86）和40.0%（10/25），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.659，P＜0.01）。NET 患者中，G1、G2 和G3 患者CD117 陽性表達(dá)率分別為7.1%（5/70）、35.7%（5/14）和50.0%（1/2），3 者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.033，P＜0.01）。

2.2 NET G3 的免疫組化結(jié)果 2019《世界衛(wèi)生組織消化系統(tǒng)腫瘤分類》對消化系統(tǒng)NEN 分類進(jìn)行了更新，GEP-NEN 的主要變動是G1 級的Ki-67 陽性指數(shù)的界值由＜2%調(diào)整到＜3%，并且提出了“NET G3”的概念[4-7]。本組病例G1 重新劃分后變化不大，而2 例過去分類有爭議的NEN 被歸入了NET G3。NET G3 表達(dá)Rb 和SSTR2，Ki-67 約25%，p53 野生型（圖2）。其中1例NET G3 表達(dá)CD117（圖1C-D），并且在后續(xù)的KIT基因分析中檢測到突變。

圖1 GEP-NEN 中CD117 的免疫組化表達(dá)結(jié)果（A:CD117 表達(dá)陰性，En Vision 染色，×100；B:CD117 表達(dá)陰性，En Vision 染色，×400；C:CD117 表達(dá)陽性，En Vision 染色，×100；D:CD117 表達(dá)陽性，En Vision 染色，×400）

圖2 NET G3 的組織學(xué)形態(tài)和免疫組織化學(xué)表現(xiàn)（A: 腫瘤細(xì)胞排列呈實(shí)性巢狀，小梁狀，腺管樣伴有纖細(xì)血管網(wǎng)，HE 染色，×100；B:直腸NET G3 腫瘤細(xì)胞Rb 表達(dá)陽性，En Vision 染色，×100；C：直腸NET G3 腫瘤細(xì)胞SSTR2 表達(dá)強(qiáng)陽性，En Vision 染色，×100；D：直腸NET G3 腫瘤細(xì)胞，熱點(diǎn)區(qū)Ki-67 陽性指數(shù)約25%，En Vision 染色，×100；E：直腸NET G3 腫瘤細(xì)胞p53 蛋白呈局灶弱陽性表達(dá)，En Vision 染色，×100）

2.3 不同臨床病理特征GEP-NEN 患者CD117 陽性表達(dá)率的比較 不同性別和年齡患者CD117 陽性表達(dá)率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），但不同腫瘤直徑、腫瘤分級和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者CD117陽性表達(dá)率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1 不同臨床病理特征GEP-NEN患者CD117陽性表達(dá)率的比較[例(%)]

2.4 CD117 陽性表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 GEP-NEN組中，CD117 陽性表達(dá)和陰性表達(dá)患者的中位生存時(shí)間分別為60 和68 個(gè)月，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（log-rankχ2=0.797，P＞0.05），見圖3。NEC 組中，CD117 陽性表達(dá)和陰性表達(dá)患者的中位生存時(shí)間分別為24 和29 個(gè)月，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（logrankχ2=0.144，P＞0.05），見圖4。NET 組中，CD117 陽性表達(dá)和陰性表達(dá)患者的中位生存時(shí)間分別為70 和68 個(gè)月，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（log-rankχ2=0.634，P＞0.05），見圖5。多因素Cox 回歸分析顯示性別、年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CD117 表達(dá)與GEPNEN 患者生存時(shí)間均無關(guān)（均P＞0.05），見表2。

圖3 CD117陽性表達(dá)和陰性表達(dá)的GEP-NEN患者的生存曲線

表2 影響GEP-NEC患者生存時(shí)間的多因素Cox回歸分析

圖4 CD117 陽性表達(dá)和陰性表達(dá)的NEC 患者的生存曲線

2.5 突變檢測 1 例NET G3 患者的KIT 17 號外顯子H790Y（CAC＞TAC）突變，c 部分突變成t，是錯(cuò)義突變（雜合突變），推薦藥物為格列衛(wèi)和舒尼替尼，見圖5（封三）。10 例NEC 患者未能檢測到KIT基因突變。

圖5 1 例直腸NET G3 患者的KIT 突變測序圖譜，可見H790Y（CAC＞TAC）突變

3 討論

本研究中，NET 和NEC 患者CD117 陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，NET 的3 個(gè)級別之間比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且表達(dá)率隨著腫瘤級別的升高而上升。Erler 等[8]發(fā)現(xiàn)CD117 在高級別的NEC 中表達(dá)也明顯升高。Kn?sel 等[9]發(fā)現(xiàn)高CD117 表達(dá)與較高的WHO分級有關(guān)（低級別9%，中級別14%，高級別28%），葉郁紅等[10]亦發(fā)現(xiàn)了類似趨勢。CD117 的表達(dá)和NEN 分級有關(guān)聯(lián)，提示對于形態(tài)上介于高、低級別之間的NEN，CD117 的表達(dá)可能成為分級的輔助手段。

CD117 是一種與癌癥進(jìn)展相關(guān)的酪氨酸激酶受體。本研究發(fā)現(xiàn)CD117 表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)，這與葉郁紅等[10]的研究結(jié)果類似，提示CD117在GEP-NEN 侵襲轉(zhuǎn)移中起著一定作用。但本研究發(fā)現(xiàn)CD117 與GEP-NEN、NET、NEC 患者預(yù)后均無關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道對此存在爭議，Akintola-Ogunrem 等[11]發(fā)現(xiàn)CD117 在結(jié)直腸NEC 中的表達(dá)和患者預(yù)后無關(guān)；與之相反，Kn?sel 等[9]發(fā)現(xiàn)CD117 的高表達(dá)與較短的疾病特異性生存期有關(guān)，可作為預(yù)后指標(biāo)；Son 等[12]發(fā)現(xiàn)CD117 表達(dá)與胰腺NET 患者的生存率降低有關(guān)，但不是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素。這些研究結(jié)果的不一致可能是由于腫瘤分類（WHO 診斷標(biāo)準(zhǔn)的變遷）、CD117 表達(dá)的評分參數(shù)、腫瘤位置這些因素的不統(tǒng)一造成的。

Perkins 等[13]運(yùn)用靶向測序法在1 例伴有肝轉(zhuǎn)移的胰腺NEN 中檢測到KIT 第11 外顯子的突變，運(yùn)用伊馬替尼治療后肝臟轉(zhuǎn)移灶體積顯著縮小。Neychev 等[14]對晚期GEP-NEN 患者進(jìn)行包括KIT 在內(nèi)的基因突變檢測，然后使用舒尼替尼或依維莫司靶向治療，并觀察是否可以改變無病生存期。這些實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鼓勵本研究小組對CD117 陽性的NET G3 和NEC 進(jìn)行KIT 突變檢測，最終在1 例直腸NET G3 檢出了17 號外顯子的新突變，為錯(cuò)義突變，即第790 處氨基酸由His 突變成Tyr（H790Y）。通過COSMIC 數(shù)據(jù)庫搜索KIT“H790Y”突變位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)Sharpe 等[15]對基底細(xì)胞癌患者進(jìn)行全外顯子篩查的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中有相同的突變位點(diǎn)。但是在NEN 并無相同位點(diǎn)的報(bào)道，這是首次在直腸的NET G3 中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的突變位點(diǎn)，具體功能有待進(jìn)一步的研究。目前，GEP-NEN G3 腫瘤的臨床研究非常有限，現(xiàn)在一般認(rèn)為NET G3 患者比NEC 患者有更長的生存時(shí)間[16-17]。藥物治療方面，NET G3 對以鉑類為基礎(chǔ)的化療不敏感，可采用生長抑素類似物、靶向藥物、核素治療和替莫唑胺為基礎(chǔ)的化療；而NEC 對以鉑類為基礎(chǔ)的一線化療靈敏度較高[18-19]。類似這樣的NET G3, KIT 突變檢測發(fā)現(xiàn)17 號外顯子突變，是否可以予以用酪氨酸激酶抑制劑治療，有待進(jìn)一步研究。加深對NET G3 的認(rèn)識，能幫助臨床正確選擇治療策略并準(zhǔn)確評估患者預(yù)后。

綜上所述，GEP-NEC 中CD117 表達(dá)水平高于GEP-NET，可對分級起到輔助診斷的作用。CD117 表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)，但與患者預(yù)后無關(guān)，不是一個(gè)有效的預(yù)后標(biāo)志物。此外，本研究發(fā)現(xiàn)1個(gè)直腸NET G3 新的KIT 突變位點(diǎn)，這為NET G3 患者治療開辟了新途徑，為GEP-NEN 中突變分析的治療重要性提供了證據(jù)。