馬口魚源鮰愛德華氏菌的分離鑒定及耐藥性

吳 斌

(福建省淡水水產(chǎn)研究所,福建 福州 350002)

馬口魚(Opsariichthysbidens)俗稱花杈魚、桃花魚、寬口等,隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)馬口魚屬(Opsariichthys),廣泛分布于我國的江河干、支流和湖泊中,是一種小型雜食偏肉魚類[1-2].馬口魚較易捕撈,其肉質(zhì)鮮美,營養(yǎng)價值高,頗受消費者青睞,并且在南方1冬齡即性成熟,人工養(yǎng)殖潛力巨大[3].目前,馬口魚的研究主要集中在規(guī)模化人工繁殖技術[4-6]、細胞遺傳[7-8]、親緣地理[9]、營養(yǎng)成分[10]、食性[11]等方面,對于養(yǎng)成過程中的病害防控研究還未見報道.

2021年,福建省南平市某淡水魚養(yǎng)殖場養(yǎng)殖的馬口魚出現(xiàn)攝食能力減弱現(xiàn)象,患病魚頭部、鰭條根部、口腔內(nèi)部黏膜存在出血癥狀,解剖發(fā)現(xiàn)肝臟為土黃色,脾臟腫大,出現(xiàn)血樣腹水,個別魚出現(xiàn)一側(cè)或兩側(cè)眼球凸起,有身體異常彎曲和打轉(zhuǎn)的癥狀.1～2齡親魚的死亡率小于10%,2～3 cm小苗的死亡率高達80%.本試驗從患病魚的肝、腎、脾、腦組織中均可分離到菌落特征相同的優(yōu)勢菌株,選擇腦中分離的菌株,對其進行生理生化特征研究以及耐藥性分析,再利用形態(tài)學觀察與分子技術構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,以期為該病的防治提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 回歸感染用健康馬口魚,體質(zhì)量25～30 g,體長12～14 cm,均來自順昌縣兆興魚種養(yǎng)殖有限公司.

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 腦心浸液培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂、革蘭氏染色液均購自北京陸橋技術有限責任公司;藥敏紙片和細菌微量生化反應管均購于杭州微生物試劑有限公司;Taq PCR Master Mix(2×, blue dye)購自BBI生命科學有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA Marker DL2000、Nucleic Acid Dye購自天根生化科技(北京)有限公司;16S rDNA通用引物(27F和1492R)合成、測序均由上海生物工程技術有限公司完成.

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化與保存 取患病馬口魚,觀察、記錄發(fā)病環(huán)境、臨床癥狀和解剖癥狀,選擇具有典型發(fā)病癥狀的病魚腦組織進行細菌分離,腦心浸液瓊脂平板劃線分離細菌,28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后,挑取形態(tài)大小、顏色等特征基本一致的優(yōu)勢菌落重復純化2次,然后接種于腦心浸液培養(yǎng)基,在28 ℃、200 r·min-1搖床中培養(yǎng)12 h,加入無菌甘油,使菌液和甘油的比例為7∶3(體積比),混勻后分裝于無菌凍存管中,先放置在-20 ℃冰箱2 h,后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱內(nèi)長期保存.

1.2.2 回歸感染試驗 取體質(zhì)量約25 g健康馬口魚暫養(yǎng)于150 L玻璃缸中,連續(xù)曝氣,水溫25～27 ℃,每日投喂2次,投喂30 min后換水,每次換全水體的30%,暫養(yǎng)7 d使其穩(wěn)定,試驗前停食24 h后用于回歸感染試驗.

將-80 ℃條件下保存的菌株接種于腦心浸液瓊脂平板,28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)12 h,無菌生理鹽水沖洗平板獲得細菌懸液,根據(jù)預試驗結(jié)果,采用無菌生理鹽水10倍稀釋法,將細菌懸液稀釋成5個合適的濃度備用.回歸感染試驗分為肌肉注射法和腹腔注射法.肌肉注射法:隨機撈取健康馬口魚60尾,分6組,每組10尾,背部肌肉注射,試驗組每尾注射細菌懸液0.1 mL,對照組注射0.1 mL無菌生理鹽水.腹腔注射法:隨機撈取健康馬口魚72尾,每組12尾,注射部位為腹腔,其他步驟同肌肉注射法.暫養(yǎng)期間連續(xù)曝氣,不投餌,水溫26～28 ℃,每日換水1次,每次換水30%.觀察記錄各組發(fā)病情況,及時撈除死亡馬口魚,連續(xù)觀察10 d,對瀕臨死亡、癥狀顯著的馬口魚進行細菌的再次分離、純化和保種.

1.2.3 菌株鑒定

1.2.3.1 形態(tài)特征觀察 將分離純化得到的菌株接種于普通腦心浸液瓊脂平板上,28 ℃培養(yǎng)14～16 h,觀察菌落形態(tài)特征,挑取單菌落,革蘭氏染色,在光學顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征.

1.2.3.2 分子生物學鑒定 將保存菌株接種于腦心浸液培養(yǎng)基中,200 r·min-1搖床(28 ℃)中培養(yǎng)12 h后,12 000 r·min-1離心10 min后收集菌體,使用天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌全基因組DNA.16S rDNA引物序列:上游引物(27F)為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,下游引物(1492R)為5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′.PCR反應體系50 μL,其中,Taq PCR Master Mix(2×blue dye)25 μL,上下游引物各2 μL(10 μmol·L-1),DNA模板1 μL,ddH2O 20 μL.反應條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min.PCR反應產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠(質(zhì)量分數(shù)為1.0%)中電泳(120 V)25 min,采用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并送上海生物工程技術有限公司測序,獲得的測序序列采用NCBI中的nucleotide blast進行序列同源性分析,利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹.

1.2.3.3 生化鑒定 取分離保存的菌株接種于腦心浸液瓊脂平板上,28 ℃培養(yǎng)48 h備用,分別按照各細菌微量生化管試劑盒說明書進行后續(xù)試驗,系統(tǒng)地鑒定該菌株的生化特性和生物學特性.

1.2.3.4 藥物敏感性試驗 將首次分離保存的菌株接種于腦心浸液培養(yǎng)基,200 r·min-1搖床(28 ℃)中培養(yǎng)12 h,調(diào)整菌液濃度至108cfu·mL-1.取100 μL調(diào)整后的細菌懸液,均勻涂布于腦心浸液瓊脂平板上,適度干燥后用無菌鑷子將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面,28 ℃培養(yǎng)24 h后分別測量各種抗生素紙片抑菌圈的直徑,根據(jù)產(chǎn)品說明書判別結(jié)果.

1.2.3.5 組織病理觀察 迅速解剖健康對照組、自然發(fā)病組和病原菌回歸感染120 h后的馬口魚做組織病理切片,取其鰓、肝、脾、腎、腸、腦、心組織塊,用體積分數(shù)4%的中性甲醛溶液固定24 h后,保存于4 ℃冰箱.按照常規(guī)方法制作石蠟切片,H-E染色,中性樹膠封片,Olympus CX41型顯微鏡觀察并照相.

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的回歸感染

從自然患病魚腦部分離純化獲得1株細菌,命名為ObB210709B1,分別采用腹腔注射和肌肉注射的方法感染健康的魚(表1、表2).兩種回歸方法中高濃度組死亡均集中在前3 d,低濃度組死亡集中在4～7 d,所有試驗組的魚最終均死亡,表明這株菌的毒力很強;回歸魚均能表現(xiàn)出鰭條根部、頭部、口腔黏膜出血,脾臟腫大,血樣腹水等自然發(fā)病癥狀;回歸魚無眼睛凸起、打轉(zhuǎn)的癥狀,但該癥狀在自然發(fā)病中也只有個別魚存在.綜上可知,該菌為馬口魚的致病菌.

表1 ObB210709B1腹腔注射回歸感染試驗

表2 ObB210709B1肌肉注射回歸感染試驗

2.2 細菌的形態(tài)學特征

分離菌最適培養(yǎng)基為腦心浸液培養(yǎng)基,但在腦心浸液瓊脂平板上生長速度仍然較慢,菌落小,28 ℃條件下生長4 d直徑為2～4 mm,菌落形態(tài)相似,圓形,黃白色半透明,表面光滑濕潤,邊緣整齊(圖1A).菌體革蘭氏染色陰性,兩端鈍圓,短桿狀,菌體大小(0.5～1.0)μm×(1.0～3.0)μm,無芽胞(圖1B).

A:菌落;B:革蘭氏染色

2.3 生化鑒定

通過細菌微量生化管對ObB210709B1進行生化鑒定(表3).分離菌生化活性較弱,只能利用葡萄糖、麥芽糖、果糖,不能分解其他糖類,且其他生化試驗結(jié)果也多為陰性,參考《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》[12],發(fā)現(xiàn)分離菌的生化特性與鮰愛德華氏菌最相似,初步確定該菌為鮰愛德華氏菌.

表3 分離菌株ObB210709B1生理生化特征1)

2.4 16S rDNA序列分析

PCR擴增ObB210709B1菌株的16S rDNA基因并測序,獲得序列采用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹.PCR擴增產(chǎn)物約為1 500 bp的特異性條帶,經(jīng)測序獲得基因片段序列,與GenBank中已有的核酸序列進行BLAST分析,結(jié)果表明,該序列與EdwardsiellaictaluriMs12(GeneBank登錄號KC112992.1)的16S rDNA基因序列同源性為99.50%.系統(tǒng)進化樹分析表明,分離菌株與鮰愛德華氏菌屬同一分支(圖2).結(jié)合形態(tài)學和生理生化特征,將所分離菌株鑒定為鮰愛德華氏菌.

圖2 菌株ObB210709B1的系統(tǒng)進化樹

2.5 藥物敏感性

菌株ObB210709B1對24種藥物的敏感性試驗(表4)結(jié)果表明:該菌株對參與試驗的氨基糖苷類藥物、喹諾酮類藥物、四環(huán)素類藥物、氯霉素藥物、多粘菌素類藥物及β-內(nèi)酰胺類的氨芐西林、羧芐西林、阿莫西林均高度敏感;對β-內(nèi)酰胺類的青霉素、苯唑西林,大環(huán)內(nèi)脂類的紅霉素,糖肽類的萬古霉素,磺胺類的復方新諾明均耐受.綜上可知,該菌的耐藥性低,臨床治療藥物的選擇種類較多.

表4 菌株ObB210709B1的藥物敏感性1)

2.6 組織病理

2.6.1 臨床癥狀 患病馬口魚魚體充血、出血,腹部膨脹,鰭條根部出血嚴重,肛門紅腫,腹部及尾部壞死形成潰爛(圖3A);眼球出血、突出(圖3B);解剖腹腔內(nèi)充滿大量血腹水(圖3C);肝臟血管擴張淤血,腫大,呈土黃色;脾臟腫脹,淤血呈暗紅色(圖4F).

A:魚體狀態(tài);B:眼部;C:腹腔;D:肝脾部.“←”指病變位置.

2.6.2 病理變化 健康對照組的鰓、肝、脾、腎、腸、腦、心的組織切片見圖4a1-4a7.自然發(fā)病組和病原菌回歸感染120 h后組織病理學變化主要表現(xiàn)為鰓增生粘連,最后鰓絲崩解(圖4b1、圖4c1);肝細胞細胞核消失,空泡變性嚴重,灶性壞死,淋巴細胞、巨噬細胞浸潤(圖4b2、圖4c2);脾淋巴細胞減少,灶性壞死,脾血竇淤血(圖4b3、圖4c3);腎小球血管內(nèi)皮細胞腫脹,腎小囊內(nèi)大量蛋白滲出染成紅色,腎小球上皮細胞變性、壞死(圖4b4、圖4c4);腸道黏膜上皮壞死,脫落,固有膜內(nèi)大量炎癥細胞浸潤,有大量細菌團塊(圖4b5、圖4c5);腦外膜脫落,出血、炎性細胞浸潤(圖4b6、圖4c6);肌間隙增寬、水腫,心肌纖維變性、壞死,有細菌團塊(圖4b7、圖4c7).感染組的組織病變情況要比自然發(fā)病組嚴重.

a(對照組):a1:鰓;a2:肝;a3:脾;a4:腎;a5:腸;a6:腦;a7:心肌;b(自然發(fā)病組):b1:鰓增生粘連;b2:肝細胞空泡變性,灶性壞死;b3:脾淋巴細胞減少,灶性壞死,脾血竇淤血;b4:腎小球血管內(nèi)皮細胞腫脹,腎小管內(nèi)大量蛋白滲出;b5:腸道黏膜上皮壞死,脫落,固有膜內(nèi)有大量細菌團塊;b6:腦出血,白細胞浸潤;b7:心肌纖維間隙增寬、水腫;c(回歸感染組):c1:鰓絲崩解;c2:肝細胞細胞核消失,空泡變性嚴重,壞死,淋巴細胞、巨噬細胞浸潤;c3:脾淋巴細胞減少,淤血;c4:腎小球血管內(nèi)皮細胞腫脹、出血、壞死,腎小管上皮細胞破壞;c5:腸道黏膜上皮粘連,有大量細菌團塊,固有膜內(nèi)大量炎癥細胞浸潤;c6:腦外膜脫落,出血、炎性細胞浸潤; c7:心肌纖維水腫、變性、壞死,肌間隙增寬,有細菌團塊.“←”指病變位置.

3 討論

愛德華氏菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中較常見的條件致病菌,由其所引起的魚類疾病,通常稱為魚類的愛德華氏菌病.魚類致病性愛德華氏菌共有3種,即遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)、鮰愛德華氏菌和?？茞鄣氯A氏菌(E.hoshinae),其中,前兩種在魚類病害中最常見[12].鮰愛德華氏菌通常感染鯰形目的一些魚類,例如,斑點叉尾鮰(Parasilirusasotus)[13]、黃顙魚(yellow catfish)[14]、白鯰魚(white catfish)[15]、蟾胡子鯰(walking catfish)[16]、鮭鱒(Oncorhynchusmykiss)[17]、云斑鮰(brown bullhead)[18]等.其中,E.ictaluri最易感染斑點叉尾鮰并形成斑點叉尾鮰腸型敗血癥,具有感染速度快、發(fā)病率和死亡率高等特點,對斑點叉尾鮰的養(yǎng)殖具有嚴重影響[19].此外,E.ictaluri也可感染非鯰形目的一些魚類,如藍色弓背魚(green knife fish)、斑馬魚(bengal danio)、日本鰻鱺(Japanese eel)[20-21].此外,E.ictaluri也可引起大鯢發(fā)病[22].本試驗從福建自然發(fā)病的馬口魚體內(nèi)分離到E.ictaluri,并通過人工感染試驗證實其是病原菌,E.ictaluri在自然狀態(tài)下也能感染馬口魚致病,提示其感染宿主的范圍進一步擴大,也為防控馬口魚養(yǎng)殖可能發(fā)生的疾病提供依據(jù).進化樹分析表明,該菌與其他來源的鮰愛德華氏菌有一定的遺傳距離,可能由于感染不同宿主,即使是同一種病原菌,在感染力、毒力上也會存在差異,這種差異造成菌株之間的遺傳距離.這種遺傳距離的存在提示應該根據(jù)分離菌株的宿主、分離時間與區(qū)域等信息,繼續(xù)進一步分析該菌種的種群進化關系,以揭示該菌種的分子流行病學特征.

本試驗發(fā)現(xiàn)鮰愛德華氏菌感染馬口魚的組織病理損傷主要表現(xiàn)為肝空泡壞死,脾出血、壞死,腎小球出血與腎小管破裂,多組織器官均有細菌團塊的聚集,腸道尤為嚴重,與吳中明等[22]的研究結(jié)果一致.鮰愛德華氏菌可在馬口魚體內(nèi)多組織、多器官定殖,引起病理損傷,甚至導致死亡,該菌對機體的損傷與炎癥反應,尤其是肝、脾、腎和腸的病理損傷最為嚴重.馬口魚在臨床上出現(xiàn)明顯的腹水與全身性出血等臨床特征,肝、腎的結(jié)構(gòu)損傷較嚴重,從而引起蛋白合成障礙、腎小球濾過性增強、腎小管重吸收能力降低等,導致血管內(nèi)外液體交換及球-管失衡,鈉、水在體內(nèi)潴留出現(xiàn)水腫[23].

養(yǎng)殖魚暴發(fā)疾病后應盡快進行藥敏試驗,選擇合適的敏感藥物進行治療.此次分離的E.ictaluri對恩諾沙星、氟苯尼考等高度敏感,耐藥程度較低.該菌株是第1次從養(yǎng)殖發(fā)病的馬口魚分離獲得,且該養(yǎng)殖場養(yǎng)殖的馬口魚親魚均來源于野生捕撈并由養(yǎng)殖場人工繁育子一代或子二代,因此,推測該病原菌株的耐藥性較低,可能是因為菌株還未受到疾病治療過程中相關藥物的影響,仍未形成廣泛耐藥性.藥敏試驗結(jié)果與國內(nèi)外相關研究結(jié)果[24-27]基本一致,為臨床治療中提供可參考使用藥物.E.ictaluri對磺胺類藥物復方新諾明表現(xiàn)強耐藥,提示需科學合理使用抗生素藥物,避免單一、超劑量和長期用藥而導致耐藥性.此外,中草藥是一種天然環(huán)保的藥物,具有安全、有效、殘留少、價格低廉等優(yōu)點,已有研究表明,連翹、大黃、蒲公英、金銀花、黃柏等中草藥制劑對E.ictaluri均有抑菌作用,抑菌圈平均直徑大于20 mm[28],也為鮰愛德華氏菌病的防治提供了一種途徑.