雞毒支原體PstS蛋白的原核表達(dá)及其定位

宋 春, 楊 美, 岳 筠, 單春蘭, 王開(kāi)功,3, 程振濤,3

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025;2.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,貴州 貴陽(yáng) 5500083;貴州大學(xué)貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550025)

雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum, MG)是雞慢性呼吸道疾病的重要病原,導(dǎo)致雞呼吸困難甚至發(fā)生肺炎,阻礙雞的生長(zhǎng)發(fā)育,降低產(chǎn)蛋量,也會(huì)引起死胚率升高[1-2].養(yǎng)禽業(yè)集約化養(yǎng)殖模式和管理不善等多種原因?qū)е码u毒支原體、傳染性喉氣管炎等呼吸道疾病普遍發(fā)生,多種病原混合感染并長(zhǎng)期存在,嚴(yán)重危害禽業(yè)經(jīng)濟(jì)[3-4].目前,控制MG感染的疫苗主要有滅活疫苗和弱毒疫苗.在一定程度上,滅活疫苗可以控制感染,減少發(fā)病雞的數(shù)量,降低產(chǎn)蛋量損失,但無(wú)法抵抗強(qiáng)毒株的攻擊[5].有研究表明,弱毒疫苗F株、6/85和ts-11可有效控制MG在雞體內(nèi)傳播[6-8].但是弱毒疫苗免疫雞群必須為健康雞群,且蛋雞在產(chǎn)蛋期不宜接種,這限制了弱毒疫苗的使用[9].

雞毒支原體缺乏細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白在其膜表面大量存在,可介導(dǎo)支原體黏附、侵入宿主細(xì)胞等過(guò)程,決定了支原體致病性強(qiáng)弱[10].所以MG膜蛋白篩選及其黏附特性研究是解析MG致病機(jī)理和亞單位疫苗靶標(biāo)的關(guān)鍵.如TM-1蛋白、PvpA蛋白、烯醇化酶、醛縮酶、pMGA蛋白等MG外膜蛋白均有研究報(bào)道[11-12].本試驗(yàn)基于MG F株基因組,分析磷酸鹽ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物結(jié)合蛋白(phosphate ABC transporter substrate-binding protein, PstS)具有跨膜結(jié)構(gòu)和良好的B細(xì)胞抗原表位,可能是MG的膜蛋白.早期研究表明,PstS是結(jié)核分支桿菌的膜蛋白,將其免疫小鼠后,可刺激細(xì)胞產(chǎn)生高水平的特異性抗體和Th1型細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ,具有較強(qiáng)的保護(hù)效率[13].PstS抗原是結(jié)核分支桿菌血清學(xué)診斷的最佳單抗原[14].有研究表明,PstS蛋白參與癌癥、細(xì)菌和病毒感染等許多致病性相關(guān)的過(guò)程[15-16].但關(guān)于PstS蛋白在MG中的生物功能相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道,本試驗(yàn)通過(guò)原核表達(dá)重組蛋白PstS制備多克隆抗體,并應(yīng)用Western blot對(duì)PstS蛋白在MG內(nèi)的分布進(jìn)行定位分析,為進(jìn)一步研究MG PstS蛋白的生物功能提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 菌株

MG F菌株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)監(jiān)察所;感受態(tài)DH5α購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;BL21(DE3)購(gòu)自江蘇科晶生物科技有限公司.

1.2 主要試劑

改良Frey氏培養(yǎng)基購(gòu)自中海生物科技有限公司;pMD-19T載體、pColdⅠ表達(dá)載體由貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院提供.PfuDNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶SalⅠ、BamHⅠ購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購(gòu)自NOVAGEN公司;BCA蛋白定量試劑盒、過(guò)硫酸銨、5×SDS蛋白上樣緩沖液、預(yù)染蛋白Marker、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、DAB顯色液均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;膜蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海貝博生物公司;弗氏佐劑、羊抗兔標(biāo)記抗體(HRP-IgG)均購(gòu)自SIGMA公司.

1.3 PstS蛋白的生物信息學(xué)分析

選擇15株雞毒支原體NC06、NC08、NC95、NC96、VA94、S6、NY01、Str.F、Str.R(high)、Str.R(low)、F、f99lab、NCTC、W101、CA06參考菌株序列, 應(yīng)用相關(guān)軟件[17]分析MG F株P(guān)stS基因(AHB99366.1)的保守性、色氨酸密碼子(TGA),PstS蛋白序列的理化性質(zhì)、親/疏水區(qū)、跨膜區(qū)、信號(hào)肽、B細(xì)胞表位.

1.4 PstS基因的SOE-PCR擴(kuò)增與克隆

MG使用改良Frey氏培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),提取其基因組為模板.PstS基因在210和1 017 bp處存在2個(gè)TGA密碼子,在大腸桿菌中表達(dá)為終止密碼子,本試驗(yàn)利用SOE-PCR將2個(gè)TGA點(diǎn)突變改變?yōu)榫幋a色氨酸的TGG.根據(jù)GenBank上已發(fā)表的雞毒支原體Str.F(CP001873.1)中PstS基因信息,設(shè)計(jì)特異引物(表1),利用PstSp1/p2擴(kuò)增PstS的基因片段231 bp,PstSp3/p4擴(kuò)增849 bp,將2個(gè)TGA突變成TGG,按照條件94 ℃ 3 min、94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min、30個(gè)循環(huán)、72 ℃延伸5 min進(jìn)行PCR反應(yīng).經(jīng)凝膠電泳并回收2個(gè)片段為模板,PstSp1/p4引物擴(kuò)增PstS基因1 065 bp.按照條件94 ℃ 3 min、94 ℃ 30 s、58 ℃ 1 min、72 ℃ 20 s、30個(gè)循環(huán)、72 ℃延伸7 min進(jìn)行PCR擴(kuò)增.擴(kuò)增PstS基因全長(zhǎng)后回收并克隆至pMD-19T載體,構(gòu)建正確的克隆質(zhì)粒pMD-PstS.

表1 PstS基因引物序列1)

1.5 pCold-PstS原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將pMD-PstS、pColdⅠ表達(dá)載體用BamHⅠ、SalⅠ進(jìn)行雙酶切后,經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并膠回收PstS基因和pColdⅠ載體大片段,然后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,于LB固體平板(Amp+)培養(yǎng),挑單菌落于LB液體(Amp+)培養(yǎng),提取重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、雙酶切鑒定后送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,構(gòu)建正確的pCold-PstS表達(dá)載體.

1.6 PstS蛋白的表達(dá)與純化

將pCold-PstS轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,搖床培養(yǎng)至D600 nm為0.6～0.8,加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)誘導(dǎo),將誘導(dǎo)菌液高速離心,收集沉淀,用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)洗滌菌體沉淀并重懸,取4體積菌液和1體積SDS上樣緩沖液混勻并置于沸水中10 min,12%(體積分?jǐn)?shù))SDS-PAGE電泳檢測(cè)PstS蛋白表達(dá).超聲裂解誘導(dǎo)菌體,高速離心后采用SDS-PAGE檢測(cè),分離上清與沉淀.采用親和層析柱法純化PstS蛋白后進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳,然后轉(zhuǎn)印于聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)上,采用QuickBlockTMWestern液封閉1 h,TBST(Tris-HCl, NaCl, Tween20)漂洗3～5次,以His-tag抗體(稀釋比例1∶1 000)為1抗于4 ℃孵育過(guò)夜,漂洗后以辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)羊抗小鼠IgG(稀釋比例1∶5 000)為2抗于37 ℃孵育1 h,漂洗后采用DAB顯色液進(jìn)行顯色,利用Odyssey?紅外掃描儀進(jìn)行掃描以驗(yàn)證PstS蛋白的表達(dá).

1.7 PstS蛋白抗血清制備及效價(jià)測(cè)定

將純化后的PstS蛋白經(jīng)過(guò)弗氏完全(不完全)佐劑等比乳化,通過(guò)皮下多點(diǎn)注射免疫約2 kg的新西蘭大白兔,每只每次400 μg.每隔14 d再次免疫,第4次免疫后的第3天采集心臟血,收集兔抗PstS血清后采用ELISA測(cè)效價(jià).

1.8 Western blot鑒定PstS蛋白的定位

取40 mL 108CCU(color change unit,顏色變化單位)的MG液體培養(yǎng)物,4 ℃、12 000 r·min-1離心30 min,棄上清.沉淀中加1 mL Western及IP細(xì)胞裂解液,混勻后冰上裂解2～10 min,離心得到上清為MG總蛋白.再取40 mL MG液體培養(yǎng)物,參考膜蛋白提取試劑盒說(shuō)明書對(duì)MG膜蛋白、胞漿蛋白進(jìn)行提取.將3種蛋白用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜,PVDF膜用QuickBlockTMWestern液封閉1 h,TBST漂洗3～5次,加1∶800稀釋的PstS兔抗血清37 ℃孵育2 h,漂洗,再用HRP-山羊抗兔IgG(1∶5 000)孵育1 h,漂洗,于DAB顯色液中顯色后利用Odyssey?紅外掃描儀進(jìn)行掃描.

2 結(jié)果與分析

2.1 PstS蛋白的生物信息學(xué)分析

對(duì)GenBank中15株MGPstS基因核苷酸序列進(jìn)行分析,PstS基因同源性為97.5%～100%,PstS基因在210和1 017 bp處存在TGA密碼子,需要人工突變?yōu)樯彼嵬x密碼子TGG.經(jīng)預(yù)測(cè),其蛋白分子式為C1919H3001N499O583S7,pI=5.11,分子質(zhì)量42.6 ku,為親水性蛋白.9～31區(qū)域有跨膜區(qū),1～28區(qū)域有信號(hào)肽.在83～89、95～105、121～127、194～201、297～303、319～328、352～358具有豐富的B細(xì)胞表位,很可能是雞毒支原體的優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)域.

2.2 PstS基因的SOE-PCR擴(kuò)增及克隆

以MG F株的DNA為模板,用突變引物PCR擴(kuò)增出231和849 bpPstS基因片段,后經(jīng)SOE-PCR擴(kuò)增PstS基因全長(zhǎng)1 065 bp,均得到符合預(yù)期的目的片段(圖1).將PstS基因全長(zhǎng)膠回收后克隆至pMD19-T中,構(gòu)建正確的pMD-PstS.

M:DL 2 000 Marker;1:陰性對(duì)照;2:PstS基因片段1擴(kuò)增產(chǎn)物;3:PstS基因片段2擴(kuò)增產(chǎn)物;4～5:陰性對(duì)照;6:PstS基因全長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物.

2.3 重組表達(dá)載體pCold-PstS的構(gòu)建

重組表達(dá)載體pCold-PstS經(jīng)PCR和BamHⅠ/SalⅠ雙酶切鑒定,獲得1 065 bp的目的基因條帶,與預(yù)期相符(圖2).重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果表明,已將PstS基因成功亞克隆至表達(dá)載體pColdⅠ.

1:DL 2 000 Marker;2-3:pCold-PstS重組質(zhì)粒;4:陰性對(duì)照;5:DL 5 000 Marker;6:pCold-PstS重組質(zhì)粒;7:pColdⅠ空載體.

2.4 PstS蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

pCold-PstS的陽(yáng)性克隆菌經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo),對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳,利用考馬斯亮藍(lán)染色并脫色后,凝膠上呈現(xiàn)出43 ku的目的蛋白條帶(圖3A),誘導(dǎo)菌液超聲裂解后,對(duì)上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳,可見(jiàn)融合蛋白PstS在上清中高效表達(dá)(圖3B),主要為可溶性表達(dá).融合蛋白PstS純化后,采用Western blot檢測(cè),在43 ku處有顯色條帶(圖3C),說(shuō)明純化的融合蛋白PstS能與His標(biāo)簽單抗發(fā)生特異性反應(yīng).

M:Marker;1:空載體誘導(dǎo);2:重組菌誘導(dǎo);3:重組菌未誘導(dǎo);4:重組菌誘導(dǎo)沉淀;5:重組菌誘導(dǎo)上清;6～7:純化蛋白.

2.5 兔抗PstS血清效價(jià)測(cè)定

ELISA方法測(cè)得制備的兔抗PstS血清效價(jià)為1∶25 600(圖4).制備的兔抗血清與免疫原呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng),且效價(jià)較高,說(shuō)明融合PstS蛋白具有較好的免疫原性.

圖4 PstS抗血清的效價(jià)測(cè)定

2.6 MG總蛋白、胞漿蛋白和膜蛋白的提取

提取MG總蛋白、胞漿蛋白和膜蛋白進(jìn)行濃度測(cè)定及SDS-PAGE電泳(圖5)檢測(cè),在約43 ku的位置處均可見(jiàn)目的蛋白條帶,且膜蛋白在總蛋白中的占比較低.

2.7 PstS融合蛋白在雞毒支原體中的亞細(xì)胞定位

將MG總蛋白、胞漿蛋白和膜蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,分別用兔抗PstS血清孵育,通過(guò)Western blot檢測(cè)均可呈現(xiàn)出43 ku的免疫印跡條帶(圖6).說(shuō)明PstS存在于細(xì)胞膜組分和胞漿組分中,是雞毒支原體的膜蛋白,也是MG的胞漿蛋白.

M:Marker;1:膜蛋白;2:胞漿蛋白;3:總蛋白.

3 討論

磷以磷酸鹽的形式存在于生物體中,在菌體組成結(jié)構(gòu)、能量代謝、信號(hào)傳遞等方面發(fā)揮重要作用.磷酸鹽特殊轉(zhuǎn)運(yùn)(phosphate specific transport, Pst)系統(tǒng)是細(xì)菌中磷酸鹽吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵系統(tǒng),PstS蛋白在Pst系統(tǒng)中主要負(fù)責(zé)外界磷酸鹽的攝取,是ABC磷酸鹽攝取機(jī)制中的結(jié)合元件[18-19].有研究表明,在膜表面,具有表達(dá)PstS蛋白的細(xì)胞,其捕獲磷酸鹽的能力更強(qiáng)[20].而大腸桿菌過(guò)表達(dá)溶磷菌PstS蛋白后,對(duì)磷酸鹽的吸收也顯著增加[21].Zaborina et al[22]從腸上皮組織分離出富含PstS蛋白的高毒力銅綠假單胞菌,證明了PstS蛋白參與腸上皮細(xì)胞的黏附過(guò)程并破壞細(xì)胞完整性.此外,PstS蛋白還通過(guò)影響細(xì)菌生物被膜的形成,介導(dǎo)細(xì)菌耐藥[23].有研究表明,PstS蛋白可以增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)青霉素、氟喹諾酮類等抗生素的耐藥性[24-25].因此,膜表面的PstS蛋白在原核生物中具有重要的生物學(xué)意義.

支原體缺乏細(xì)胞壁,其表面膜蛋白與致病過(guò)程和免疫應(yīng)答密切相關(guān)[26].跨膜區(qū)是膜受體蛋白、離子通道蛋白或膜錨定蛋白的重要特征,常用來(lái)預(yù)測(cè)是否為膜蛋白[27-28].Western blot是進(jìn)行膜定位的常用方法[29-31],本試驗(yàn)采用Western blot對(duì)雞毒支原體PstS蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析,結(jié)果表明,PstS蛋白既存在于細(xì)胞膜上,也存在于胞漿中.這種多分布、多功能特性在支原體膜蛋白定位研究中均有報(bào)道[32-33],可能是因?yàn)橹гw作為最小的原核微生物,其基因組有限的編碼能力決定了支原體系統(tǒng)中蛋白的多功能兼職性[34],所以相同蛋白在胞漿中發(fā)揮生理功能的同時(shí)也會(huì)分泌到膜表面參與病原菌黏附、入侵等過(guò)程.而PstS蛋白作為磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的關(guān)鍵成員,其生理作用決定了其同時(shí)存在于膜蛋白和胞漿蛋白中.

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)分析揭示MG PstS蛋白具有跨膜結(jié)構(gòu)和良好的抗原表位特征,并在原核表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)了MG PstS蛋白(約43 ku).通過(guò)Western blot證實(shí)PstS蛋白同時(shí)存在于MG膜組分和胞漿組分中,屬于雞毒支原體的膜蛋白,為后續(xù)MG致病機(jī)理、耐藥性機(jī)制和基因工程疫苗研究提供了依據(jù).