干細胞移植治療睪丸衰老的現狀與思考

莫嘉輝 李欣禹 陳志宏 張敏 鄧春華

隨著全球老齡化進展加速以及國內人口負增長，各種衰老相關慢性疾病以及兩性生育力保護日益引起重視[1]。睪丸衰老（testicular aging）是指睪丸結構和功能隨著年齡增長逐漸衰退的過程[2]，主要特點是睪酮合成能力以及生精功能逐漸下降，不僅影響男性生育力和生育質量，而且影響整體健康狀況[3-4]。盡管關于睪丸衰老的命名與診療標準仍存在爭議，但筆者認為相較遲發(fā)性性腺功能減退癥（late-onset hypogonadism，LOH），睪丸衰老更準確地概括了在衰老過程多因素作用下睪丸生精及內分泌功能發(fā)生的漸進改變與多器官系統(tǒng)效應。因此，延緩睪丸衰老對于改善中老年男性健康和生活質量至關重要。

干細胞是具有強大的自我更新能力和多向分化潛能的細胞群體[5]。自從實現胚胎干細胞分離與體外誘導多能干細胞以來，干細胞的基礎與臨床應用研究不斷深化，推動了細胞療法的發(fā)展[6]。干細胞移植是將干細胞或其衍生物通過特殊技術移植到體內以重建損傷部位和恢復生理功能的細胞療法，目前已被用于治療皮膚、骨關節(jié)、神經、血液及內分泌相關疾病，并在衰老與再生醫(yī)學領域受到廣泛關注[7]。

目前臨床上仍缺乏治療睪丸衰老的理想療法，而干細胞移植可通過定向分化替代衰老細胞，還可通過免疫調節(jié)維持組織微環(huán)境穩(wěn)態(tài)[8]，作為治療睪丸衰老的新策略具有極大潛力。近年來，干細胞移植治療睪丸衰老的研究取得令人興奮的成果。隨著基因工程和生物材料等技術的蓬勃發(fā)展，諸如理化因子預處理、基因修飾及結合仿生材料等新興療效優(yōu)化策略也被廣泛探討[9-10]。本文將闡述當前干細胞移植治療睪丸衰老的相關研究現狀，并探討臨床轉化面臨的瓶頸以及療效優(yōu)化策略，以期為睪丸衰老干細胞療法的研發(fā)及臨床應用提供新思路。

1 干細胞移植治療睪丸衰老的研究進展

睪丸作為男性性腺，具有分泌雄激素（睪酮）和產生精子兩大主要功能[3]。睪丸衰老不僅會導致男性生育力下降，還會破壞內分泌穩(wěn)態(tài)[11]，對機體健康產生多種不良影響。一方面，睪丸是精子產生的場所，睪丸衰老微環(huán)境中積累的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）可能導致老年男性精液質量下降[12-13]，其子代多種疾?。ㄈ鐑和谀[瘤、自閉癥和代謝綜合征等）的患病率增加[14]。另一方面，睪丸間質細胞（Leydig cell，LC）是成年男性睪酮合成的主要場所，衰老導致的睪酮缺乏不僅引起性功能障礙，還與骨質疏松、肌肉萎縮、肥胖、糖尿病、阿爾茲海默癥、心血管疾病等密切相關[11]，嚴重影響老年男性的生活質量和預期壽命。隨著現代文明的發(fā)展，在環(huán)境污染逐漸加重、精神心理壓力增加以及不良生活習慣等多種不利因素的共同影響下，男性睪丸功能衰退呈現年輕化趨勢，因此，防治睪丸衰老對于改善中老年男性健康和生活質量、緩解人口老齡化危機具有重要意義。

目前睪丸衰老的治療策略主要包括內分泌調節(jié)和抗氧化療法等，筆者總結見表1[2,15]，但有效性和安全性有待進一步驗證?，F階段臨床上主要通過直接補充外源性雄激素（睪酮），緩解睪酮水平低下相關的臨床癥狀，稱為睪酮替代療法（testosterone replacement therapy，TRT）[15]。TRT 可提高血清睪酮水平，改善男性性功能、肌力、代謝、骨密度等情況，但仍存在諸多缺陷[16]。一方面，睪丸不僅可分泌睪酮，還可分泌胰島素樣因子（insulin-like factor，INSL）3 和抗苗勒管激素等多種激素，進而調控骨代謝和血管發(fā)育等過程[17]。血清睪酮水平下降是睪丸衰老的表現而非原因，因此單純補充睪酮無法替代睪丸復雜的內分泌功能，更無法延緩睪丸衰老。另一方面，睪酮分泌受到下丘腦-垂體-睪丸軸的精密調控。直接補充外源性睪酮會反饋性抑制LC 的分泌功能，導致內源性睪酮分泌不足，惡化患者的生精功能[18]。此外，TRT還可能加重患者的下尿路梗阻癥狀，增加紅細胞增多癥和前列腺癌等的發(fā)生率[16,18]。

表1 睪丸衰老的內分泌及抗氧化治療策略Table 1 Strategies of endocrinotherapy and antioxidant treatment for testicular aging

總之，目前針對睪丸衰老的治療方法仍不理想，亟需探索延緩睪丸衰老的新策略。干細胞移植為治療創(chuàng)傷、腫瘤和衰老等疾病帶來了革命性的變化，是當今醫(yī)學研究最前沿的方向之一。從首次提出“干細胞”的概念到如今干細胞治療臨床轉化與應用，許多里程碑事件推動著干細胞研究領域的發(fā)展，筆者總結見圖1[6,19-20]。2018年全球首例通過臍血間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）治療的卵巢早衰患者成功分娩[21]，標志著干細胞治療生殖衰老難題取得重大進展，說明其作為治療睪丸衰老的新策略具有廣闊的應用前景。目前干細胞移植治療睪丸衰老的研究主要集中在恢復睪丸生精功能和改善睪酮分泌兩個方面。

圖1 干細胞移植研究歷程的重要進展Figure 1 The major scientific advances during the history of stem cell transplantation research

1.1 干細胞移植促進生精功能恢復

干細胞來源廣泛、種類繁多，圍繞恢復生精功能的干細胞研究主要包括精原干細胞（spermatogonial stem cell，SSC）、睪丸間質干細胞（stem Leydig cell，SLC）和MSC。

1.1.1 精原干細胞移植促進生精功能恢復 SSC 是位于睪丸生精小管基底膜上的成體干細胞，是維持精子發(fā)生和男性生育力的基礎[22]。生理狀態(tài)下，SSC 能夠自我更新以維持干細胞庫的穩(wěn)定，也可通過分化產生成熟精子。SSC 移植療法，即分離患者的自體SSC，經體外培養(yǎng)擴增后移植到患者的輸出小管、生精小管或睪丸網（rete testis）[9]，理論上可以補充精子發(fā)生的“種子”來源，恢復損傷或衰老睪丸的生精功能。Brinster 等[23]最早在不育小鼠中通過SSC 移植成功恢復精子發(fā)生并產生存活后代，證實了同種異體SSC 移植后分化產生功能精子和恢復生育力的可行性。隨后，SSC 移植在其他哺乳動物的研究中得到了廣泛探索，包括大鼠、犬、豬、牛、食蟹猴等[9]。由于不同物種存在睪丸結構差異，這些研究實際上為SSC 移植積累了寶貴的技術經驗。Hermann 等[24]首次在非人靈長類動物中證實了SSC 移植后可產生功能精子，為SSC移植的臨床轉化奠定了堅實基礎。截止至投稿日，僅1 項利用自體SSC 或自體睪丸組織移植恢復生精功能的注冊臨床試驗（NCT04452305），該試驗處于招募受試者階段，尚未有在人體進行自體睪丸組織移植或SSC 移植成功產生功能精子的相關報道。此外，自體SSC 的來源有限，異體SSC 移植面臨倫理問題，均限制了SSC 移植在睪丸衰老防治的應用。目前主要認為基于SSC 的療法（包括自體睪丸組織移植、SSC 移植和體外精子發(fā)生）可作為接受性腺功能損傷治療的青春期前患者保存生育力的基礎策略[25]，但相信隨著對精子發(fā)生機制和生精小管微環(huán)境（niche）的認識不斷深入，自體SSC 移植有望成為睪丸衰老的治療策略。

1.1.2 睪丸間質干細胞移植促進生精功能恢復 SLC 是位于睪丸生精小管及血管周圍間隙的組織特異性成體干細胞，可定向分化為LC[26]。LC既是睪丸內分泌細胞，也是生精微環(huán)境的重要組成部分，因為生理狀態(tài)下睪丸的生精功能和睪酮合成功能并非完全獨立的兩個過程[27]，生理濃度的睪酮對于維持正常的精子發(fā)生起著重要作用。SLC 的自我更新與定向分化有助于維持睪丸間質微環(huán)境中LC 的健康狀態(tài)，在睪丸損傷修復反應中發(fā)揮重要作用，為“種子”的重新萌發(fā)提供良好的“土壤”環(huán)境。二甲基磺酸乙烷（ethane dimethane sulfonate，EDS）可特異性誘導大鼠LC 凋亡，使睪丸喪失睪酮分泌功能并導致生精功能損傷[26]。內源性SLC 可分化并替代EDS 損傷的LC，Ge 等[28]研究證明在大鼠中移植CD140a+的SLC可部分挽救精子發(fā)生，重建睪丸組織穩(wěn)態(tài)。目前國內外尚未開展SLC 移植治療不育癥的臨床試驗，但隨著SLC 的分離鑒定、體外擴增以及工程化改造體系的逐漸完善，SLC 移植有望成為恢復睪丸生精功能、延緩睪丸衰老的重要策略。

1.1.3 間充質干細胞移植促進生精功能恢復 MSC 是廣泛來源于多種組織（骨髓、脂肪、臍帶、胎盤、牙髓等）的多能干細胞[8]，具有對組織微環(huán)境獨特的感知與調控功能[29]。隨著衰老過程不斷積累損傷因素，生精細胞的凋亡比例逐漸增加[30]。此外，衰老過程高水平的氧化應激可引起DNA 損傷、端?？s短，導致睪丸生精功能降低[12]。MSC 可能主要通過減少生精細胞凋亡和減少氧化應激以促進生精功能的恢復。Hsiao 等[31]研究表明小鼠睪丸原位注射脂肪組織來源的MSC 能夠明顯減少生精細胞的凋亡，進而改善精子質量。Sherif 等[32]研究發(fā)現小鼠靜脈注射骨髓來源的MSC 不僅能夠緩解順鉑誘導的睪丸毒性以及睪丸氧化應激，同時可降低睪丸局部炎癥因子水平，進而恢復生精，提示MSC 移植在促進生精方面具有巨大潛力。目前共有6 項利用MSC 治療無精子或少精子的臨床研究（NCT02025270、NCT02641769、NCT02008799、NCT02041910、NCT05158114、NCT02414295），其中僅1 項選取了臍血來源的MSC（NCT05158114），其余均選取了骨髓來源的MSC，遞送方法主要為原位注射或睪丸血管內注射，但尚未有公開的結果報道。值得肯定的是，MSC 移植后對局部微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調控作用將使其成為促進睪丸生精功能恢復的重要候選細胞。

1.2 干細胞移植促進睪酮合成分泌

睪酮合成主要發(fā)生在LC，因此LC 衰老是導致睪丸衰老過程睪酮分泌減少的重要原因。理論上，LC 移植是治療睪酮分泌減少的最佳選擇，但LC 是無增殖能力的終末分化細胞[33]，實際上難以獲得適用于體內移植的LC。通過移植干細胞定向分化為LC以改善睪酮合成功能具有極大的應用潛力，目前成功實現Leydig 樣細胞定向分化的干細胞類型包括成體SLC、MSC 和誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）。

1.2.1 睪丸間質干細胞移植促進睪酮合成分泌 人類和非人靈長類動物的LC 發(fā)育經歷了3 個階段，包括胎兒期、新生兒期和成年期，其中成年期LC 是在青春期由SLC 定向分化而來[33]，因此SLC 對維持成年階段LC 的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用。目前認為SLC 移植是針對睪酮分泌減少或LOH 的細胞治療首選方案[34]。早在2004年，Lo 等[35]將SLC 移植到促黃體生成素受體敲除小鼠中，發(fā)現循環(huán)睪酮水平顯著提高，但無法確定移植小鼠中分化為Leydig 樣細胞的干細胞譜系來源。隨后國內外研究者分別在大鼠和人類中證明了生精小管管周SLC 是成年階段LC 的來源，并成功使用特定表達標記（CD51 和CD90）從大鼠及非人靈長類動物睪丸中分離SLC[34,36]。此外，項鵬教授團隊陸續(xù)發(fā)現神經絲蛋白（nestin）、p75 和endosialin 可作為鑒定和分離人類SLC 的特異標記[37-39]，推動了SLC鑒定、分離與體外培養(yǎng)擴增體系的建立；并證明了nestin 陽性SLC 移植后可分化為LC，提高EDS 處理大鼠模型的血清睪酮水平和生精能力[37]。

SLC移植不僅能夠提高LC損傷動物的睪酮水平，還可恢復隨著衰老發(fā)生的LC 衰老或耗竭。2020年，項鵬教授團隊發(fā)現自體SLC 移植可提高老年食蟹猴的血清睪酮水平和生精能力，并緩解脂肪堆積和骨質疏松等睪酮缺乏所致的全身癥狀[40]。然而，直接將SLC移植到人類睪丸中進行臨床治療仍存在較多困難。人類睪丸可分為200～300 個睪丸小葉，在成人睪丸組織內實現SLC 均勻和反復移植目前技術上尚不可行，且受者依從性低。此外，在老年男性的睪丸微環(huán)境中常見的巨噬細胞募集和炎癥反應激活，包括白細胞介素（interleukin，IL）-1β 等炎癥因子水平與ROS 產生增加，可能導致移植后SLC 損傷、衰老甚至耗竭[41]。因此，目前國內外尚未開展SLC 移植治療男性性腺功能減退或睪丸衰老的臨床試驗，迫切需要探索工程化改造SLC 的策略以推動SLC 移植治療睪丸衰老相關疾病的臨床轉化。

1.2.2 間充質干細胞移植促進睪酮合成分泌 MSC 因其高度的體外擴增能力和可塑性成為了體外誘導分化獲取LC 最廣泛使用的細胞來源。2006年，Yazawa等[42]發(fā)現大鼠骨髓來源的MSC 移植到睪丸后可分化為Leydig 樣細胞，而同樣誘導條件下人類骨髓來源MSC 則分化為腎上腺樣細胞。直到2016年，Hou等[43]結合促性腺激素等因子誘導才在體外首次成功將人類骨髓MSC 誘導為Leydig 樣細胞。目前暫未有研究報道在體內實現人源性MSC 向LC 分化。2021年，Nguyen 等[44]報道了關于靜脈輸注自體脂肪來源MSC 的臨床Ⅰ/Ⅱa 期試驗，該研究發(fā)現MSC移植后患者的睪酮水平顯著提高，并在6 個月內保持高水平，在12 個月后才出現下降，同時患者的性生活滿意度也明顯增加。這些研究提示MSC 可能通過旁分泌細胞因子或系統(tǒng)免疫調控的作用恢復LC 功能，表明MSC 在恢復睪酮分泌方面具有巨大的潛力。

1.2.3 誘導多能干細胞移植促進睪酮合成分泌 iPSC 是通過導入特定轉錄因子將終末分化的體細胞重編程形成的多能干細胞，因其來源方便及分化潛能高成為了體外誘導分化獲取LC 的替代選擇。2019年，Li 等[45]和Chen等[46]分別報道了基于病毒轉染處理和基于小分子化合物預處理策略在體外獲取人類iPSC 衍生的Leydig樣細胞，并進一步證明了iPSC 分化的Leydig 樣細胞移植到大鼠體內后可恢復血清睪酮水平和增加睪丸重量。iPSC 衍生的Leydig 樣細胞在體內的存活情況以及遠期睪酮生物合成能力仍有待進一步評估[34]。然而，iPSC 在體外長期培養(yǎng)過程中累積的自發(fā)突變及基因組不穩(wěn)定性可能降低其分化效率和治療效果。此外，由于iPSC 無限增殖的特性，移植后可能形成畸胎瘤樣腫瘤[34]，進一步阻礙了其臨床應用。降低甚至消除iPSC致瘤性仍是iPSC 移植向臨床轉化面臨的主要挑戰(zhàn)。

2 干細胞移植治療睪丸衰老的挑戰(zhàn)

盡管干細胞移植在恢復生精功能和睪酮分泌方面展現出巨大的潛力，但與內分泌療法相比，防治睪丸衰老的細胞療法仍處于起步階段。與SSC、SLC 等組織特異性干細胞相關的許多基礎問題亟需解決，包括影響干細胞移植后存活和歸巢能力的關鍵調控分子、受體免疫微環(huán)境（生態(tài)位）與供體干細胞的相互作用關系、向人體移植干細胞的數量和給藥方式等[47-48]。

同時，干細胞移植的臨床轉化仍面臨諸多挑戰(zhàn)[49]。第一個挑戰(zhàn)是需要找到更多合適的標記以高效鑒定和分離組織特異性干細胞（如SSC 和SLC），并明確體內移植后分化與組織特異性歸巢調控中的相關標記。第二個挑戰(zhàn)是需要確保干細胞的安全性及質量控制，相關評估指標包括細胞活力、內毒素含量、基因組穩(wěn)定性、致瘤性等。第三個挑戰(zhàn)是需要建立干細胞的應用級生產和擴增體系，睪丸組織內自體SLC 和SSC的數量有限，自體干細胞預保存的時機選擇尚未達成共識，異體干細胞移植仍存在倫理學爭議，大規(guī)模批量生產SLC 和SSC 非常困難；盡管MSC 和iPSC 來源廣泛、體外培養(yǎng)體系成熟，但體內分化或轉分化效果仍需經過長期評估[34]。

總之，干細胞移植的臨床轉化和廣泛應用仍是艱巨的過程，為了推動細胞療法未來成為患者可選的一線方案，仍需不斷優(yōu)化改造以提高干細胞移植的療效和安全性。

3 干細胞移植的優(yōu)化策略

移植的干細胞需要在受體組織內存活才能發(fā)揮其定向分化替代或旁分泌調控的治療作用，然而衰老微環(huán)境的炎癥因子、ROS、免疫細胞與移植細胞的相互作用等因素都會影響定植組織內干細胞的存活率，因此提高干細胞的存活率對優(yōu)化干細胞移植療效至關重要。近年來，隨著基因工程和生物材料等技術的蓬勃發(fā)展，諸如理化因子預處理、基因修飾及結合仿生材料等多種干細胞移植優(yōu)化策略也被廣泛探討[6,10]。

理化因子預處理是指在體外培養(yǎng)過程中通過物理或化學因素（缺氧、流體力學、小分子藥物或生物大分子等）激活或減弱干細胞相關信號通路以增強干細胞對體內應激環(huán)境的適應性[50]。研究結果表明體外預處理可以增強干細胞抗凋亡、定向歸巢、組織修復、旁分泌及免疫調節(jié)等生物學特性[51-52]。

基因工程化修飾是對干細胞進行基因編輯改變特定功能基因表達的優(yōu)化處理策略[5]。目前已知部分基因在LC 發(fā)育和睪酮合成分泌過程中起重要作用，如NR5A1、NR2F2 和LHCGR 等[53]?；蚓庉嫾夹g一方面有利于明確性腺功能減退或生精障礙相關基因在睪丸衰老過程中的作用，另一方面也可以對干細胞中抗炎、抗衰老、抗氧化相關基因進行工程化處理，為提高干細胞移植療效提供更多的干預靶點[54]。

生物材料工程是利用仿生材料改善干細胞的體外培養(yǎng)與體內遞送方式的優(yōu)化策略[10]。仿生材料具有良好的生物相容性以及結構可塑性，一方面可以模擬細胞外基質為干細胞提供生物力學支持（如基質骨架、水凝膠、纖維支架材料等），有助于干細胞的黏附、遷移和長期定植[55]；另一方面作為可溶性旁分泌因子的擴散媒介，也有助于增強干細胞的環(huán)境響應和免疫調控功能[56]。此外，也有研究報道通過2D 或3D 類器官結構、生物打印等可以提高SSC 的體外擴增效率，有助于自體干細胞的批量生產[57]。

盡管探索干細胞的工程化改造策略如火如荼，但這些新型治療手段仍處于臨床前研究階段，目前尚無臨床應用治療睪丸衰老的報道。相信隨著干細胞與材料科學等交叉學科的不斷深入發(fā)展，干細胞移植在衰老和再生醫(yī)學領域將不斷取得突破。

4 小結與展望

隨著全球老齡化進展加速以及國內人口負增長，衰老相關慢性疾病以及兩性生育力保護日益引起重視。防治睪丸衰老對于改善中老年男性健康和生活質量、緩解人口老齡化危機具有重要意義。干細胞移植作為治療睪丸衰老的新策略具有廣闊的應用前景。高產的稻田不僅需要優(yōu)良的種子，還需要肥沃的土壤。如何提高干細胞移植治療睪丸衰老的效果，不僅需要關注干細胞的類型、數量、遞送方式，還需要關注移植干細胞在睪丸生態(tài)位的相互作用及存活狀態(tài)。隨著對衰老機制的認識不斷加深與新興學科的交叉融通，我們期待干細胞移植療法不斷突破現有技術瓶頸，逐步建立完善的應用轉化體系，為老齡化人群提供高質量的個性化治療，為衰老與再生醫(yī)學領域帶來新一輪革命。