安腸湯通過TRAF6/IRAK1/NF-κB 信號通路對潰瘍性結腸炎大鼠的抑制作用研究

梁運特，孫平良，廖志遠，賴斯華，張 琴，湯 勇，黃仲海

1 廣西中醫(yī)藥大學研究生院，廣西 南寧 530200； 2 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）的臨床表現(xiàn)以反復腹瀉、黏液膿血便為主，多伴腹痛及不同程度的全身炎癥癥狀，具有病程長、易復發(fā)及難治愈等特點［1］。研究表明，UC 發(fā)病機制與遺傳因素、免疫異常、腸道微生態(tài)紊亂等密切相關［2-4］。前期研究表明，安腸湯具有顯著抗炎、增強細胞免疫的作用，可減少UC 大鼠結腸黏膜的潰瘍數(shù)和潰瘍面積［5］。其治療的機制是否與TRAF6/IRAK1/NF-κB 信號通路相關，目前尚無相關報道。本研究以安腸湯為研究對象，探究其對UC 大鼠結腸組織中TRAF6/IRAK1/NF-κB 信號通路中關鍵蛋白TRAF6、IRAK1、p-NF-κB、NF-κB 蛋白表達的影響，闡明安腸湯基于TRAF6/IRAK1/NF-κB 信號通路修復受損腸黏膜治療UC的藥效作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康SPF 級SD 大鼠60 只，雄雌各半，體質量180～220 g，購自長沙天勤生物技術有限公司，實驗動物許可證號碼：SCXK（湘）2014-0011。飼養(yǎng)環(huán)境：廣西中醫(yī)藥大學醫(yī)學分子實驗室，許可證號：SYXK 桂2010－0001；實驗溫度：20～23 ℃，實驗室濕度：50%～60%。實驗方案經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準［批準號為2013（KF）-E-003］。

1.2 主要藥物安腸湯藥物組成：補骨脂25 g，黃芪20 g，黨參15 g，白頭翁15 g，茯苓15 g，檳榔15 g，熟附子15 g，地榆15 g，赤芍15 g，雞內(nèi)金10 g，薏苡仁10 g，干姜10 g，白術10 g，木香10 g，延胡索10 g，甘草10 g。藥材由廣東康美藥業(yè)股份有限公司提供。將以上中藥材洗凈、浸泡30 min，先煎附子30 min，再加入剩余藥物，繼續(xù)熬30 min，每副藥水煎3次，濃縮后4 ℃保存?zhèn)溆?。美沙拉嗪腸溶片（佳木斯鹿靈制藥有限公司，國藥準字H19980149，規(guī)格：0.25 g/片）。本次實驗用藥處方及用量經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院藥學部審核。

1.3 試劑及耗材水合氯醛（成都市科龍化工試劑廠，批號：2013101801，規(guī)格：250 g/瓶）；PrimeScript ? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（Takara，型 號RR047A）；PrimeScript ? RT Master Mix（Perfect Real Time）（Takara，型號RR036A）；TriQuick Reagent（索萊寶，型號R1100）；TB Green? Pre-mix Ex Taq? Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（Takara，型號RR082A）；5% 2，4，6-三硝基苯磺酸液（南寧市托普邦生物科技有限公司，商品編號：P2297-10 mL，規(guī)格：10 mL/瓶）；甲醛（成都市科龍化工試劑廠，批號：20130817，規(guī)格：500 mL/瓶）；TransScript?-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（全式金，型號AU311）；0.2 mL熒光定量PCR 透明八排管八連管蓋（ABI，型號4323032）；高效RIPA 組織/細胞裂解液（Solarbio，型號R0010）；蛋白酶抑制劑混合液（100xPIC）（Solarbio，型號P6730）。

1.4 實驗儀器T18 型組織勻漿機（IKA）；TU-100C 型恒溫金屬浴鍋（上海一恒）；單道移液器（德國Eppendorf公司，10/20/100/200/1000 μL）；一次性使用真空采血管（江西精致科技有限公司，抗 凝 管EDTA.K2）；Ulti Mate 3000 型Thermo FisherUHPLC 3000 液相色譜（美國賽默飛）；超聲清洗機（鄭州園田清潔設備有限公司）；電泳儀（Bio-Rad，PowerPac Basic）；蛋白轉印模塊（濕轉）（Bio-Rad，Mini Trans-Blot Cell）；TD4 型普通離心機（上海盧湘儀）；DW-86L728J 型Haier 醫(yī)用低溫保存箱（青島海爾特種電器）；FC-1100 型超微量核酸檢測儀（遂真）；G8830-64001 型Ariamx Real-Time PCR（Agilent Technologies）；4375786 型Veriti ? 96-Well Thermal Cycler（Applied Biosystems?）；5418R 型低溫離心機（eppendorf）；SIM-F140AY65 型制冰機（廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學生物實驗室）。

1.5 實驗方法

1.5.1 造模方法 參照文獻［6-7］建立UC 大鼠模型，在禁食但不禁飲24 h 后，使用水合氯醛（濃度：10%，按大鼠體質量0.3 mL/100 g 計算用量）進行腹腔內(nèi)注射麻醉，將灌腸管逐步深入距大鼠肛門約7 cm，注入2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzenesulfonic acid solution，TNBS）（按大鼠體質量90 mg/kg 計算用量）造模，等待藥液完全進入腸道后，將大鼠繼續(xù)提尾倒立2 min，保證藥液充分吸收?？瞻捉M大鼠用等體積的生理鹽水注入，待操作完畢大鼠清醒后給予自由飲食以及進水。造模成功表現(xiàn)：1）反復出現(xiàn)大便溏泄，甚至有脫肛癥狀；2）形體消瘦、食欲及體質量均下降；3）出現(xiàn)畏寒弓背，群體蜷縮聚堆；4）精神神態(tài)萎靡，毛色枯槁；5）易疲勞、嗜臥。以1）—3）項為主癥，4）—5）項為兼癥，具備兩項主癥及兩項兼癥即可認為大鼠模型復制成功。

1.5.2 分組及給藥 大鼠模型建立后，將造模組大鼠隨機分為模型組，美沙拉嗪組，安腸湯低、中、高組，每組10 只?？瞻捉M和模型組大鼠每天予0.9% NS 3 mL/只進行灌胃，美沙拉嗪組大鼠以美沙拉嗪混懸液5 mg/mL 灌胃，安腸湯低劑量組給予1 mL/（kg·d）（相當于臨床等效量）、中劑量組給予5 mL/（kg·d）（相當于臨床等效量的5倍）、高劑量組給予10 mL/（kg·d）（相當于臨床等效量的10倍），灌胃量為藥液＋0.9%NS共3 mL。給藥周期為14天。

1.5.3 標本處理 大鼠給藥灌胃14 天后，使用水合氯醛麻醉，剖腹取腹主動脈血5～7 mL，靜置30 min，予離心15 min 分離血清，并于-20 ℃冰箱保存待測。在距離肛門約8 cm 處取結腸病變最明顯的組織，以0.9%NS 沖洗干凈后，切取病變處結腸組織，一部分凍存于-80 ℃冰箱，另一部分固定于4%多聚甲醛。

1.6 觀察指標

1.6.1 病理學組織觀察 取結腸組織的病變部位，采用10%甲醛固定24 h 后，依次進行酒精脫水、浸蠟、組織切片、脫蠟、HE 染色等，在光鏡下觀測組織形態(tài)學改變并拍照。

1.6.2 qPCR 測定大鼠結腸組織中TRAF6、IRAK1、NF-κB mRNA 相對表達量 把組織剪成細小的碎片，取50～100 mg 放入2 mL 離心管置于冰盒上，依次加入1 mLTriQuick Reagent，用勻漿機勻漿至無沉淀，室溫靜置，加入0.2 mL 氯仿后靜置，取上清0.5 mL加入潔凈的離心管；加入0.5 mL異丙醇，靜置10 min；離心，棄上清；加入1 mL 75%乙醇，4 ℃，12 000 g×5 min離心，棄上清；加入1 mL無水乙醇，4 ℃，12 000 g×5 min 離心，棄上清；65 ℃金屬浴鍋上烘干沉淀，加0.03 mLDEPC 水溶解。使用超微量核酸檢測儀（遂真，F(xiàn)C-1100）進行RNA濃度及純度檢測，后按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄操作，所得cDNA置于-80 ℃保存待用。

qPCR 反 應 體 系 為：MonAmp ?SYBR? Green qPCR Mix：10 μL，cDNA：1 μL，Primer Forward（10 μM）：0.4 μL，Primer Reverse（10 μM）：0.4 μL，H2O：8.2 μL；反應程序：預變性95 ℃：30 s；PCR循環(huán)（40 循環(huán)）：95 ℃：10 s，60 ℃：30 s，溶解曲線：標準溶解曲線程序。實驗儀器為Agilent Technologies AriaMx Real-Time PCR 儀。經(jīng)實驗獲得的數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0 軟件進行整理及分析，采 用2-ΔΔCT 法 進 行 分 析，公 式 為：ΔCt=（Ct gene-Ctβ-actin），ΔΔCt=（ΔCt treat-ΔCt control）。所得數(shù)據(jù)使用GraphPad 進行整理制圖。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6.3 Western blot 法檢測結腸組織TRAF6、IRAK1、p-NF-κB、NF-κB 表達 組織剪成細小的碎片，取20～40 mg放入2 mL離心管置于冰盒上，加入200～400 μL RIPA-PMSF-PIC，用勻漿機勻漿至無沉淀，勻漿時勻漿5 s左右放回冰盒冷卻一會兒再繼續(xù)勻漿。離心半徑：8.4 cm，12 000 r/min 離心5 min，取上清采用BCA 法測定蛋白含量。將濃度定量至2 μg/μL，加入4×蛋白上樣buffer，100 ℃變性10 min。所得變性后的蛋白置于-80 ℃保存待用。90 V 恒壓電泳約20 min，待樣品進入分離膠層后，換用120 V恒壓電泳1～1.5 h。300 mA 恒流轉膜90 min。用TBST（索萊寶，T1081）配制8%脫脂奶粉（索萊寶，D8340）作為封閉液，將膜放入封閉液中封閉3 h。按抗體說明書上的推薦比例使用封閉液將一抗（一抗信息另附表格）進行稀釋，將膜放入稀釋后的一抗中4 ℃ 孵育12 h。一抗孵育完成后，使用TBST 洗膜3 次，每次15 min。將膜放入按1∶4000 比例稀釋的二抗（goat anti-rabbit：Abcam，ab6721）中37 ℃ 孵育1 h，使用TBST洗膜3次，每次15 min。使用ECL 顯色劑對膜進行顯色，于凝膠成像儀中進行曝光成像。

1.7 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示，多組間采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠結腸組織的病理改變與空白組比較，模型組大鼠腸組織結構完全紊亂，結腸黏膜表面嚴重缺損，腺體排列損傷嚴重，層次不清，不同程度出現(xiàn)隱窩分支及扭曲，隱窩數(shù)量減少，更有大量炎細胞聚集，浸潤，其中腺體破壞甚至丟失；安腸湯低、中、高劑量治療后，UC 小鼠結腸黏膜病變均有一定程度的改善，其中安腸湯高劑量治療和美沙拉嗪治療后小鼠結腸黏膜病變恢復更加明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠結腸組織的病理改變（HE，×100）

2.2 大鼠結腸組織中TRAF6、lRAK1、NF-κBmRNA相對表達量與空白組比較，模型組大鼠組織中TRAF6、IRAK1、NF-κB mRNA 相對表達量明顯增高（P＜0.05）；與模型組比較，美沙拉嗪組和安腸湯低、中、高組大鼠血漿中TRAF6、IRAK1、NF-κB mRNA相對表達量顯著降低（P＜0.05）；與美沙拉嗪組比較，安腸湯高劑量組大鼠血漿中TRAF6、IRAK1、NF-κB mRNA相對表達量降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血漿中TRAF6、lRAK1、NF-κB mRNA的相對表達量比較（±s）

表2 各組大鼠血漿中TRAF6、lRAK1、NF-κB mRNA的相對表達量比較（±s）

注：#表示與空白組比較，P＜0.05；*表示與模型對照組比較，P＜0.05；&表示與美沙拉嗪組比較，P＜0.05

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2.3 大鼠血清內(nèi)TNF-α、lL-1β、lL-6含量與空白組比較，模型組小鼠血清內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，安腸湯低、中、高劑量組及美沙拉嗪組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 含量顯著降低（P＜0.05），其中美沙拉嗪組含量明顯下降（P＜0.05）；以安腸湯低、中、高劑量干預后，以高劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6 含量降低最明顯（P＜0.05），但均略差于美沙拉嗪組。見表3。

表3 各組大鼠結腸組織勻漿上清TNF-α、lL-1β及l(fā)L-6含量比較（±s）pg/mL

表3 各組大鼠結腸組織勻漿上清TNF-α、lL-1β及l(fā)L-6含量比較（±s）pg/mL

注：#表示與空白組比較，P＜0.05；*表示與模型對照組比較，P＜0.05；&表示與美沙拉嗪組比較，P＜0.05

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2.4 大鼠的結腸組織TRAF6、lRAK1、p-NF-κB、NF-κB表達與空白組比較，模型組大鼠結腸組織TRAF6、IRAK1、p-NF-κB、NF-κB蛋白表達量明顯增高（P＜0.05）；與模型組比較，美沙拉嗪組和安腸湯低、中、高組大鼠結腸組織TRAF6、IRAK1、p-NF-κB、NF-κB 蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）；與美沙拉嗪組比較，安腸湯高劑量組大鼠結腸組織TRAF6、IRAK1、p-NF-κB、NF-κB 蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）。見表4，圖2。

表4 各組大鼠結腸組織中TRAF6、lRAK1、p-NF-κB、NF-κB的表達量比較（±s） kD

表4 各組大鼠結腸組織中TRAF6、lRAK1、p-NF-κB、NF-κB的表達量比較（±s） kD

注：#表示與空白組比較，P＜0.05；*表示與模型對照組比較，P＜0.05；&表示與美沙拉嗪組比較，P＜0.05

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圖3 Western blot檢測小鼠結腸組織TRAF6、IRAK1、p-NF-κB、NF-κB的蛋白水平電泳圖

3 討論

3.1 UC 的病因和發(fā)病機制UC 的確切病因和發(fā)病機理至今仍然未知，但研究發(fā)現(xiàn)與腸道菌群失調和促炎介質的過表達密切相關［8-10］。前期研究結果顯示，UC 大鼠的血清內(nèi)毒素含量及糞便乙酸含量與其本病的嚴重程度成正相關，且安腸湯能明顯降低UC 大鼠血清內(nèi)毒素含量及糞便乙酸含量，調節(jié)腸道菌群，促進黏膜愈合［11］。

3.2 lRAK1 在NF-κB 信號通路傳導中發(fā)揮關鍵作用目前發(fā)現(xiàn)的白細胞介素受體相關激酶（interleukin receptor related kinase，IRAK）共有4 個亞型，即IRAK1、IRAK2、IRAK3 和IRAK4，它們均可參與生物體的炎癥反應過程［12-13］，并在生物體中細胞因子或相關致病受體的下游信號通路傳導中發(fā)揮關鍵作用［14］。研究表明，當白細胞介素受體1 被激活后，在細胞內(nèi)吸引相關分子黏附進而激活IRAK1分子，成功被激活后IRAK1分子可調控NF-κB相關信號的轉導，進而參與炎癥細胞的增殖、侵襲等過程［15］。陳建翠等［16］研究發(fā)現(xiàn)，下調IRAK1 基因能調控NF-κB 信號通路并且抑制宮頸 癌細 胞生 長。XIAOFEN X 等［17］證 實IRAK1 和STAT3可協(xié)同上調IL-10的轉錄。

3.3 TRAF6主要通過經(jīng)典途徑活化NF-κB信號通路腫瘤壞死因子受體相關因子6（tumor necrosis factor receptor related factor，TRAF6）是一個作用廣泛的泛素連接酶，屬于腫瘤壞死因子超家族，當其被激活的時，能夠開啟細胞內(nèi)相關的信號通路。目前已知的TRAFs家族蛋白共有7種，標記為TRAF1～7。其中TRAF6 是細胞內(nèi)最為重要的信號轉導蛋白，具有特異性的受體結合［18-20］，介導著細胞膜上多種信號通路的傳導，TRAF6主要通過經(jīng)典途徑活化NF-κB信號通路，當機體受到炎癥因子刺激后導致TRAF6 發(fā)生聚集作用，通過激活NF-κB 誘導激酶并使NF-κB 活化，啟動NF-κB 信號通路并調控機體的免疫和炎性反應［21］。

3.4 NF-κB信號通路調控炎癥因子的表達NF-κB信號通路在細胞的炎癥反應、應激反應、免疫應答等過程中起到非常關鍵的作用［22-23］，如IRAK、TRAF6等細胞因子可以結合細胞膜表面的受體，激發(fā)NF-κB 信號通路改變基因的表達，被活化的NF-κB可以游離至細胞核，激活或抑制多種κB 相關基因的轉錄，影響TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10 等炎癥因子的表達，這些促炎因子在UC 發(fā)生、發(fā)展及轉歸中發(fā)揮重要作用［24］。TNF-α、IL-6 和IL-1β都是促炎細胞因子，可調節(jié)血管內(nèi)皮細胞的上內(nèi)皮分子分泌，促進中性粒細胞對這些細胞因子的黏附［25］。TNF-α 的分泌誘導著廣泛的生理和致病現(xiàn)象，如影響著細胞增殖、分化、死亡、基因轉錄及炎癥的調節(jié)［26］。IL-6則是由活化的T細胞和成纖維細胞產(chǎn)生的一種細胞因子［27］，在調節(jié)機體免疫、炎性等過程發(fā)揮重要作用［28-29］。IL-1β是一種通過促進血管因子生成而發(fā)揮抗皮質素作用的細胞因子，可使內(nèi)皮細胞存、增殖［30］。

3.5 安腸湯能夠通過TRAF6/lRAK1/NF-κB信號通路對UC 的炎癥活動進行調控本實驗中，qPCR結果顯示，TRAF6、IRAK1、NF-κB mRNA 相對表達量在模型組中的表達高于正常組，在美沙拉嗪組和安腸湯組（低、中、高組）的表達量均低于模型組，提示美沙拉嗪腸溶片和安腸湯對TRAF6、IRAK1、NF-κB mRNA 相對表達量均有抑制作用，而安腸湯高劑量組的抑制作用略好于美沙拉嗪組。Western blot 結果顯示，模型組大鼠結腸組織TRAF6、IRAK1、p-NF-κB、NF-κB 蛋白表達明顯高于空白組，在美沙拉嗪組、安腸湯組（低、中、高）中低于模型組，提示美沙拉嗪腸溶片和安腸湯的干預對TRAF6、IRAK1、p-NF-κB、NF-κB 蛋白的表達均有抑制作用，安腸湯高劑量組的抑制作用略優(yōu)于美沙拉嗪組。與此相對應的是，大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的表達在模型組均明顯高于空白組；在美沙拉嗪組及安腸湯組（低、中、高）均明顯低于模型組，提示美沙拉秦腸溶片和安腸湯都能夠抑制該信號通路末端炎癥因子的表達，且美沙拉秦腸溶片的作用較強于安腸湯。

綜上所示，安腸湯能抑制UC 腸黏膜炎癥反應，且與腸黏膜損傷修復有密切關系，我們推測安腸湯能夠通過TRAF6/IRAK1/NF-κB信號通路對UC的炎癥活動進行調控，從而修復受損腸黏膜。然而安腸湯是復方中藥方劑，其組成的的化學成分復雜，其確切的抗UC 組分及詳細的作用機制有待于進一步研究。