靶向鑒別、檢測動物雙歧桿菌的引物探針及應(yīng)用

杜麗霞，李 典，禚惠榮，石夢楠，陳延寧，李嵐芳，侯少陽

（菏澤學(xué)院藥學(xué)院，菏澤 274015）

腸桿菌基因組間重復(fù)序列（enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC）首先由Sharples等［1］在大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)的，后經(jīng)曹又方等［2］對46株菌的全基因序列進(jìn)行搜索分析，證明ERIC 序列是主要存在于腸桿菌基因組的重復(fù)序列。ERIC序列在基因組的位置分布及重復(fù)方式等方面有著較大差別［3］，因此常被用作腸桿菌科細(xì)菌鑒定的方法［4-5］。Versalovic 等［6］根據(jù)ERIC 核心序列設(shè)計了一 對 特 異 性 引 物（ERIC1：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，ERIC2：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′）用于擴增ERIC 序列，可獲得不同腸桿菌的特異性DNA 指紋圖譜［7-9］。ERIC 序列的高度保守性、通過ERIC-PCR技術(shù)獲得的DNA指紋圖譜的高度穩(wěn)定性以及ERIC-PCR 反映細(xì)菌特征性條帶的特點使得ERIC-PCR 技術(shù)相對于傳統(tǒng)細(xì)菌鑒定方法較為簡單、快速，目前被廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)的腸桿菌鑒別分類方面［10-11］。

動物雙歧桿菌作為一種可用于奶粉等乳制品的雙歧桿菌，是一種提高機體免疫能力、促進(jìn)嬰幼兒免疫系統(tǒng)發(fā)育的重要益生菌［12-14］。動物雙歧桿菌為革蘭氏陽性菌，形態(tài)多樣，但多呈分叉狀，為專性厭氧菌，發(fā)酵產(chǎn)物中含有多種糖類；在抑制病原體生長、提高機體巨噬細(xì)胞活性、調(diào)節(jié)胃腸道功能、降低機體膽固醇水平等方面具有十分重要的作用［15-16］，且已列入國家《可用于食品的菌株名單》。但傳統(tǒng)的鑒別動物雙歧桿菌的方法操作復(fù)雜且操作過程中容易被污染［17-19］。本研究基于ERIC-PCR 技術(shù)，設(shè)計的兩對特異性引物探針，優(yōu)化了目前相對傳統(tǒng)的動物雙歧桿菌純培養(yǎng)及平板計數(shù)鑒定方法，相比較于通過16S rRNA 測序后進(jìn)行基因比對更為簡單快速，并在一定程度上解決了應(yīng)用SNP 基因分型技術(shù)［20］的TaqMan-MGB 探針法［21］對于實驗設(shè)備及試劑的限制，具有成本低、特異性強的特點，可在多種菌株中簡單、方便、快速、靶向檢出極低含量的動物雙歧桿菌。在生產(chǎn)生活、科研活動及醫(yī)藥健康等方面的應(yīng)用具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材 料

1.1 試 劑

高純度耐熱DNA 聚合酶（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；瓊脂糖（西班牙Biowest 公司）；2K plus Ⅱ DNA marker（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；溴化乙啶（ethidium bromide，EB，美國Amresco 公司）；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司）；三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉（德國Sigma公司）；RNase A 酶（北京索萊寶科技有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；T5 載體（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；卡那霉素（北京索萊寶科技有限公司）；ERICPCR 通用型引物ERIC-F-D/ERIC-R-D、特異性引物1124-2-F/1124-2-R，1124-3-F-1/1124-3-R-1（蘇州金唯智生物科技有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

T100 Thermal PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；DYY-6C 電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；ZF-20D 暗箱三用紫外分析儀（驥輝分析儀器上海有限公司）；H1650-W 高速臺式離心機（長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限公司）；Eporator電轉(zhuǎn)儀（德國艾本德股份公司）。

1.3 菌 株

動物雙歧桿菌HP-B1124、乳酸片球菌HPB1099、植物乳桿菌HP-B1098、嗜酸乳桿菌HPB1079、鼠李糖乳桿菌HP-B1083、戊糖乳桿菌HPB1122、德氏乳桿菌HP-B1105，均為本實驗室分離、鑒別、保藏菌株；大腸埃希菌GB05 由山東大學(xué)張友明教授饋贈；動物雙歧桿菌ATCC 25527、動物雙歧桿菌BCRC 14668、動物雙歧桿菌CCRC 14668、動物雙歧桿菌CCUG 24606、動物雙歧桿菌CCUG 33907、動物雙歧桿菌CGMCC 1.2268、動物雙歧桿菌JCM 1190 均購買自山東振昂科技有限公司。

1.4 培養(yǎng)基

乳酸菌培養(yǎng)基（lactic acid bacteria culture medium，MRS培養(yǎng)基，北京路橋）。

LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 L，pH 7.2；121 ℃滅菌30 min；LB固體培養(yǎng)基需另加瓊脂20 g。

2 方 法

2.1 動物雙歧桿菌HP-B1124基因組DNA 的提取與純化

本研究運用改良的SDS-堿裂解法［22］對動物雙歧桿菌HP-B1124 基因組DNA 進(jìn)行提取與純化。具體方法為：將動物雙歧桿菌HP-B1124 接種于MRS 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，挑取少量菌體至EP 管中。按順序加入堿裂解液Ⅰ（25 mmol/L pH 8.0 Tris-Cl，50 mmol/L 葡 萄 糖，10 mmol/L pH 8.0 EDTA）、溶菌酶（50 mg/mL）、RNase A 酶（10 mg/L）100 μL，950 r/min振搖1 min。其次，加入堿裂解液Ⅱ（1% SDS，0.2 mol/L NaOH 溶液）200 μL，堿裂解液Ⅱ需現(xiàn)用現(xiàn)配，上下振蕩5 次使得混合均勻，后將其冰浴30 min。然后加入經(jīng)過預(yù)冷的堿裂解液Ⅲ（冰乙酸11.5 mL，5 mol/L 醋酸鉀60.0 mL，滅菌雙蒸水28.5 mL）160 μL，上下振蕩5次，冰浴5 min后12 500 r/min離心5 min。取上清液460 μL，加入苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1）460 μL 使其混合均勻，12 500 r/min 離心5 min，取上清液460 μL，加入2 倍體積的冰凍無水乙醇，混均，室溫條件下使得DNA 沉淀10 min 后12 500 r/min 離心5 min，37 ℃條件下使沉淀干燥。加入70%的乙醇1 mL，上下顛倒混勻后離心，干燥沉淀。加入含有RNase A 酶（10 mg/L）的1 × TE 溶液50 μL，使得沉淀重懸，于?20 ℃保存?zhèn)溆?。本研究中所涉及菌株的基因組DNA皆采用此方法進(jìn)行提取與純化。

2.2 動物雙歧桿菌HP-B1124 ERIC-PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.2.1 合成ERIC-PCR 相關(guān)引物序列 本實驗由金唯智公司合成的ERIC-PCR引物為：

ERIC-F-D：5′-ATGTMAGCTCCTGKGGHTTCA C-3′；

ERIC-R-D：5′-AAGTABGTGACTWGGGTSAG CG-3′。

2.2.2 確定最佳ERIC-PCR 反應(yīng)體系 通過多次對ERIC-PCR反應(yīng)體系的退火溫度、延伸時間、DNA濃度、引物濃度、Mg2+濃度等進(jìn)行優(yōu)化改善，即四因素三水平實驗確定可以用于實驗所涉及的動物雙歧桿菌HP-B1124 的最佳ERIC-PCR 反應(yīng)體系。四因素三水平實驗相關(guān)數(shù)據(jù)如表1。后取四因素三水平實驗所得ERIC-PCR 產(chǎn)物5 μL 采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定以尋找最佳反應(yīng)體系。

Table 1 Data form related to the four factors at three levels

2.3 回收獲得ERIC基因片段

對所得ERIC-PCR 產(chǎn)物采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。后采用康為世紀(jì)瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒對長度為750 bp 及1 000 bp 左右的片段進(jìn)行膠回收。取膠回收產(chǎn)物3 μL 與上樣緩沖液2 μL混合均勻后采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

2.4 將ERIC基因片段連接T載體后進(jìn)行測序

從LB固體培養(yǎng)基上挑取大腸埃希菌GB05-dir接種至液體LB 培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，取培養(yǎng)液40 μL加入液體LB 培養(yǎng)基1.3 mL 中37 ℃培養(yǎng)1.5 h。9 300 r/min 離心30 s，棄上清液，加入雙蒸水1 mL重懸。9 700 r/min 離心30 s；加入雙蒸水1 mL 重懸。11 000 r/min 離心30 s，棄上清液，留液體約50 μL，即得感受態(tài)細(xì)胞。

向所得感受態(tài)細(xì)胞中加入膠回收ERIC-PCR片段2 μL及T載體0.5 μL，吹吸混勻，于25 ℃孵化器中連接25 min；1 350 V 電擊，靜置5 min。液體LB 培養(yǎng)基800 μL 洗出上述菌體，37 ℃、950 r/min復(fù)蘇1 h；8 000 r/min 離心1 min；棄上清液，留液體LB 培養(yǎng)基約200 μL 重懸菌體。將重懸后菌液涂布于卡那抗性的LB 平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，至有單克隆抗體長出。T 載體型號：T5 Simple Cloning Vector（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

挑取卡那抗性的LB平板上的單克隆抗體至液體卡那霉素抗性的LB 培養(yǎng)基1.3 mL 中培養(yǎng)2 h。取菌液1 μL 為模板，采用T7/T7-Term 通用型引物進(jìn)行驗證PCR 反應(yīng)。將所得PCR 產(chǎn)物采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳驗證，將驗證結(jié)果為陽性的PCR產(chǎn)物送至金唯智公司測序。

2.5 針對測序結(jié)果設(shè)計特異性引物探針

將測序結(jié)果運用DNAMAN 進(jìn)行序列拼接，將序列拼接結(jié)果導(dǎo)入Primer Premier 5 和Oligo 7 中，根據(jù)引物設(shè)計原則，設(shè)計出特異性引物。

2.6 引物探針設(shè)計檢驗

以動物雙歧桿菌HP-B1124 裂解后所得DNA為模板，使用高純度耐熱DNA 聚合酶，選用本文所設(shè)計的特異性引物探針進(jìn)行PCR 反應(yīng)。所涉及PCR 反應(yīng)體系為四因素三水平實驗所得優(yōu)化后的ERIC-PCR 反應(yīng)體系。對所得PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

2.7 引物探針特異性檢驗

將乳酸片球菌HP-B1099、植物乳桿菌HPB1098、嗜酸乳桿菌HP-B1079、鼠李糖乳桿菌HPB1083、戊糖乳桿菌HP-B1122、德氏乳桿菌HPB1105、大腸埃希菌GB05 作為引物探針特異性檢驗的對照，選用本實驗所設(shè)計的特異性引物探針，分別對上述菌株及本文所研究的動物雙歧桿菌HP-B1124 的 基 因 組DNA 進(jìn) 行PCR 反 應(yīng)，所 涉 及PCR 反應(yīng)體系為四因素三水平實驗所得優(yōu)化后的ERIC-PCR 反應(yīng)體系。對所得PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

2.8 引物探針可檢測基因組DNA的含量限度檢驗

將乳酸片球菌HP-B1099、植物乳桿菌HPB1098、嗜酸乳桿菌HP-B1079、鼠李糖乳桿菌HPB1083、戊糖乳桿菌HP-B1122、德氏乳桿菌HPB1105、大腸埃希菌GB05 與動物雙歧桿菌HPB1124 的基因組DNA 混合制成動物雙歧桿菌HPB1124 基因組DNA 含量分別為100%（絕對含量1 300 ng/mL）、75%（絕對含量975 ng/mL）、35%（絕對含量455 ng/mL）、8%（絕對含量104 ng/mL）、0%（絕對含量0 ng/mL）的混合DNA 溶液，以此混合DNA溶液為模板，使用高純度耐熱DNA聚合酶，選用本文所設(shè)計的特異性引物探針，進(jìn)行PCR 反應(yīng)，所涉及PCR 反應(yīng)體系為四因素三水平實驗所得優(yōu)化后的ERIC-PCR 反應(yīng)體系。對所得PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

2.9 引物探針普適性檢驗

將動物雙歧桿菌ATCC 25527，動物雙歧桿菌BCRC 14668，動物雙歧桿菌CCRC 14668，動物雙歧桿菌CCUG 24606，動物雙歧桿菌CCUG 33907，動物雙歧桿菌CGMCC 1.2268，動物雙歧桿菌JCM 1190 7 株動物雙歧桿菌為引物探針普適性檢驗的對照，選用本實驗所設(shè)計的特異性引物探針，分別對上述菌株的基因組DNA 及本文所研究的動物雙歧桿菌HP-B1124 的基因組DNA 進(jìn)行PCR 反應(yīng)。所涉及PCR 反應(yīng)體系為四因素三水平實驗所得優(yōu)化后的ERIC-PCR 反應(yīng)體系。對所得PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

2.10 運用兩對特異性引物檢驗市售公示配方中含有動物雙歧桿菌的產(chǎn)品

選取5 種市售公示配方中含有動物雙歧桿菌的產(chǎn)品，提取產(chǎn)品基因組DNA 為模板，選用本實驗所設(shè)計的特異性引物探針，進(jìn)行PCR 反應(yīng)。所涉及PCR 反應(yīng)體系為四因素三水平實驗所得優(yōu)化后的ERIC-PCR 反應(yīng)體系。對所得PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

3 結(jié) 果

3.1 動物雙歧桿菌HP-B1124 ERIC-PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

經(jīng)改良的SDS-堿裂解法進(jìn)行提取與純化后，所得動物雙歧桿菌HP-B1124 基因組DNA 經(jīng)測量后濃度為1 300 ng/mL。濃度適宜，可用于后續(xù)實驗研究。

根據(jù)四因素三水平實驗所得ERIC-PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示在退火溫度42 ℃、模板質(zhì)量濃度為210 μg/L、引物濃度為21 μmol/L、Mg2+濃度為1.50 mmol/L 條件下動物雙歧桿菌HP-B1124 ERIC-PCR 反應(yīng)為9 組實驗中效果最佳。本研究采用的ERIC-PCR。反應(yīng)體系為預(yù)變性（92 ～ 99 ℃，8 ～ 15 min）；變性（93 ～ 100 ℃，1 ～ 4 min）；退火（42 ℃，1 min）；延伸（68 ～ 78 ℃，3 ～ 5 min）；循環(huán)（30 ～ 35 個）；終延伸（68 ～ 78 ℃，10 min）；保存（12 ～ 17 ℃）。模板濃度為210 μg/L、引物濃度為21 μmol/L、Mg2+濃度為1.50 mmol/L。

3.2 回收獲得ERIC基因片段

選用圖1 第2 泳道所示條帶的反應(yīng)體系對動物雙歧桿菌HP-B1124 的基因組DNA 進(jìn)行ERICPCR。對所得產(chǎn)物中長度750 bp 及1 000 bp 左右的條帶進(jìn)行膠回收。膠回收片段進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，膠回收成功得到明亮的長度為750 bp 及1 000 bp 左右的兩條片段。

Figure 1 ERIC-PCR amplification products from the four factors at three levels M: 2K plus Ⅱ DNA marker; Lane 1?9: Corresponding to table 1 group 1?9

3.3 ERIC基因片段連接T載體測序結(jié)果

將長度750 bp 及1 000 bp 左右的條帶膠回收后的產(chǎn)物連接T載體后進(jìn)行測序，根據(jù)測序結(jié)果可得1124-2、1124-3 兩條目的片段（將長度為794 bp的目的片段命名為1124-2，將長度為412 bp 的目的片段命名為1124-3）。兩條目的片段序列已上傳GenBank數(shù)據(jù)庫，接收序列號分別為OP081084、OP081085。

Figure 2 Two ERIC gene fragments of HP-B1124 M: 2K plus Ⅱ DNA marker; Lane 1: Bifidobacterium animalis HPB1124 gel extraction DNA (about 1 000 bp); Lane 2: Bifidobacterium animalis HP-B1124 gel extraction DNA (about 750 bp)

3.4 針對測序結(jié)果設(shè)計特異性引物探針

將運用DNAMAN進(jìn)行序列拼接后所得結(jié)果導(dǎo)入Primer Premier 5 和Oligo 7，根據(jù)引物設(shè)計原則，設(shè)計出兩對特異性引物探針，序列見表2。

Table 2 PCR primers used in the study

由SnapGene 分析可知，所設(shè)計的兩對特異性引物探針可擴增的理論產(chǎn)物長度分別為786 bp 和283 bp。

3.5 引物探針設(shè)計檢驗

為檢驗所設(shè)計的兩對特異性引物探針能否擴增出理論長度為786 bp，283 bp 的兩條目的片段，本研究依照“2.6”項所示方法，將所得PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證，結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，所設(shè)計的兩對特異性引物探針可擴增出長度為786 bp左右，283 bp左右的兩條目的片段。

Figure 3 Accuracy test of the primer probes M: 2K plus Ⅱ DNA marker; Lane 1: 1124-2-F/1124-2-R; Lane 2: 1124-3-F-1/1124-3-R-1

3.6 引物探針特異性檢驗

為驗證所設(shè)計的兩對特異性引物探針可以特異性的鑒別出動物雙歧桿菌，本研究依照“2.7”項所示方法，將所得PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證，結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，乳酸片球菌HPB1099、植物乳桿菌HP-B1098、嗜酸乳桿菌HPB1079、鼠李糖乳桿菌HP-B1083、戊糖乳桿菌HPB1122、德氏乳桿菌HP-B1105、大腸埃希菌GB05與動物雙歧桿菌HP-B1124 8 株菌株中，只有動物雙歧桿菌HP-B1124 可顯示完整明亮的目的片段，其他7 株菌株皆不顯示完整明亮的目的片段。因此可知引物探針1124-2-F/1124-2-R，1124-3-F-1/1124-3-R-1對動物雙歧桿菌具有特異性。

Figure 4 Specificity test of the primer 1124-2-F/1124-2-R (A) and 1124-3-F-1/1124-3-R-1 (B)M: 2K plus Ⅱ DNA marker; 1: Genomic DNA of Bifidobacterium animalis HP-B1124; 2: Pediococcus acidilactici HP-B1099; 3: Lactiplantibacillus argentoratensis HP-B1098; 4: Lactobacillus acidophilus HPB1079; 5: L. rhamnosus HP-B1083; 6: L. pentosus HP-B1122; 7: L. delbrueckii HP-B1105; 8: Escherichia coli GB05

3.7 引物探針可檢測基因組DNA的含量限度檢驗

為確定本研究所設(shè)計的兩對特異性引物探針可檢測的基因組DNA 含量限度，本研究依照“2.8”項所示方法，以此混合DNA 溶液為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。將所得PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，在動物雙歧桿菌HP-B1124 基因組DNA 含量為8%（絕對含量104 ng/mL）時，引物探針1124-2-F/1124-2-R，1124-3-F-1/1124-3-R-1仍可以擴增出目的片段。

Figure 5 Content limit test of detectable genomic DNA for primer 1124-2-F/1124-2-R （A） and 1124-3-F-1/1124-3-R-1(B)M: 2K plus Ⅱ DNA marker; 1: B. animalis HP-B1124 genomic DNA were 100% (absolute 1 300 ng/mL); 2: 75% (absolute 975 ng/mL);3: 35% (absolute 455 ng/mL); 4: 8% (absolute 104 ng/mL); 5: 0%(absolute 0 ng/mL)

3.8 引物探針普適性檢驗

為驗證所設(shè)計的兩對特異性引物探針對動物雙歧桿菌具有普適性，可鑒別出動物雙歧桿菌，本研究依照“2.9”項所示方法，將所得PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證，結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示，引物探針1124-2-F/1124-2-R，1124-3-F-1/1124-3-R-1 對動物雙歧桿菌HP-B1124，動物雙歧桿菌ATCC 25527，動物雙歧桿菌BCRC 14668，動物雙歧桿菌CCRC 14668，動物雙歧桿菌CCUG 24606，動物雙歧桿菌CCUG 33907，動物雙歧桿菌CGMCC 1.2268，動物雙歧桿菌JCM 1190 8 株動物雙歧桿菌皆可擴增出目的片段。因此，引物探針1124-2-F/1124-2-R，1124-3-F-1/1124-3-R-1 對動物雙歧桿菌具有普適性。

Figure 6 Universal test of the primer 1124-2-F/1124-2-R（A）and 1124-3-F-1/1124-3-R-1(B)M: 2K plus Ⅱ DNA marker; 1: Genomic DNA of B. animalis HPB1124; 2: B. animalis ATCC 25527; 3: B. animalis BCRC 14668;4: B.animalis CCRC 14668; 5: B.animalis CCUG 24606; 6: B.animalis CCUG 33907; 7: B.animalis CGMCC 1.2268; 8: B.animalis JCM 1190

3.9 運用兩對特異性引物檢驗市售公示配方中含有動物雙歧桿菌的產(chǎn)品

為驗證所設(shè)計的兩對特異性引物探針的市場可實用性，本研究依照“2.10”項所示方法，將所得PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證，結(jié)果見圖7。結(jié)果顯示，針對動物雙歧桿菌HP-B1124 及5 種市售公示配方中含有動物雙歧桿菌的產(chǎn)品，引物探針1124-2-F/1124-2-R，1124-3-F-1/1124-3-R-1皆可擴增出相應(yīng)目的片段。

Figure 7 Specific primer probes were used to test commercially available published formula products containing B.animalis M: 2K plus Ⅱ DNA marker; Lane 1?6 in Figure 7-A: 1124-2-F/1124-2-R as primers, genomic DNA of B. animalis HP-B1124 and genomic DNA of products containing B. animalis in commercially published formulations 1?5 as templates; Lane 1?6 in Figure 7-B: 1124-3-F-1/1124-3-R-1 as primers, genomic DNA of B. animalis HP-B1124 and genomic DNA of products containing B. animalis in commercially published formulations 1?5 as templates

4 討 論

ERIC-PCR 技術(shù)憑借可對細(xì)菌DNA 進(jìn)行指紋圖譜分析等優(yōu)點被應(yīng)用于細(xì)菌分類和鑒定方面。本研究便以ERIC-PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)，通過四因素三水平實驗不斷優(yōu)化ERIC-PCR 反應(yīng)條件來尋找動物雙歧桿菌HP-B1124的DNA 指紋圖譜，并提取動物雙歧桿菌HP-B1124 長度為1 000 bp，750 bp 左右的目的片段用于設(shè)計特異性引物探針。將所提取片段連接T 載體測序后設(shè)計出1124-2-F/1124-2-R，1124-3-F-1/1124-3-R-1兩對特異性引物探針（兩條片段的序列已上傳GenBank 數(shù)據(jù)庫，接收序列號分別為OP081084、OP081085）以用于動物雙歧桿菌的鑒定。本研究通過檢驗兩對特異性引物探針的特異性、普適性、可檢測基因組DNA 時的含量限度以及是否可鑒定出市售產(chǎn)品中含有動物雙歧桿菌進(jìn)一步增強了引物探針1124-2-F/1124-2-R，1124-3-F-1/1124-3-R-1 的可靠性及可實用性。通過本研究檢驗可知，本研究所設(shè)計的兩對特異性引物探針可對動物雙歧桿菌特異性的擴增出兩條長度為786 bp和283 bp的目的片段。

本研究中兩對特異性引物探針可用于多種動物雙歧桿菌的鑒定，具有普適性；但無法通過兩對引物探針確定其具體株名信息，在具有普適性的同時也有相對的局限性。尋找到一種可簡單、快速識別菌種的方法對于未來菌種研究等方面具有十分重要的意義。

綜上所述，本研究所設(shè)計的兩對特異性引物探針優(yōu)化了目前相對傳統(tǒng)的動物雙歧桿菌純培養(yǎng)及平板計數(shù)鑒定方法，改善了傳統(tǒng)的鑒別動物雙歧桿菌的方法操作相對復(fù)雜且操作過程中容易被污染的缺點，相比較于目前應(yīng)用的SNP 基因分型法及實時熒光定量PCR 法等具有成本低、特異性強的特點，可簡單、快速、靶向的用于混合菌株中動物雙歧桿菌的鑒定，對于科研活動及日常生活具有較強實用性。