細(xì)胞程序性死亡配體1表位肽疫苗的設(shè)計(jì)及抗腫瘤活性

邵世帥，段樹康，田 浤，姚文兵，高向東

（中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 江蘇省生物藥物成藥性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 211198）

免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）療法在癌癥治療方面取得了前所未有的進(jìn)展，極大地改變了腫瘤治療策略［1-2］。以PD-1/PD-L1 為靶點(diǎn)的單克隆抗體被證明在晚期黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、胃癌等多種惡性腫瘤中表現(xiàn)出較為顯著的臨床療效和抗腫瘤活性［3-6］，但免疫檢查點(diǎn)阻斷療法僅對(duì)部分患者產(chǎn)生持久反應(yīng)，對(duì)大多數(shù)癌癥患者仍然無效［7-8］。

ICB 介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)依賴于能夠識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞的T 細(xì)胞的浸潤(rùn)情況［9］，免疫細(xì)胞如CD8+T 細(xì)胞影響著免疫治療的療效與癌癥患者的生存期［10］。腫瘤疫苗可誘導(dǎo)CD8+T 細(xì)胞的增殖，在某些情況下，這些T 細(xì)胞可被招募至腫瘤組織中［11］。因此，將ICB與腫瘤疫苗聯(lián)用是提高臨床療效較為合理的方案。腫瘤新生抗原疫苗是治療性腫瘤疫苗的最新進(jìn)展［12］，已有多項(xiàng)新生抗原疫苗與ICB 聯(lián)合應(yīng)用的臨床研究正在進(jìn)行中［13］。然而并非每一種突變都能產(chǎn)生新生抗原。據(jù)報(bào)道，自發(fā)發(fā)生的新生表位特異性T 細(xì)胞只反映個(gè)體腫瘤突變的1% ～ 2%［14］。因此選擇可在多種腫瘤類型中高表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原，設(shè)計(jì)出惠及更多腫瘤患者的腫瘤疫苗仍是更為現(xiàn)實(shí)有效的疫苗策略。

免疫檢查點(diǎn)PD-L1 是一種在正常組織中低表達(dá)，可在腫瘤部位誘導(dǎo)高表達(dá)的“適應(yīng)性”的腫瘤相關(guān)抗原［15-16］。在癌癥的發(fā)展過程中，腫瘤通過高表達(dá)PD-L1 與其受體PD-1 相互作用抑制T 細(xì)胞反應(yīng)，逃避腫瘤免疫監(jiān)視，從而抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)［17］。有研究發(fā)現(xiàn)PD-L1 幾乎可以在所有的小鼠腫瘤細(xì)胞系上誘導(dǎo)表達(dá)［18］。因此，PD-L1被認(rèn)為是腫瘤免疫治療的理想靶點(diǎn)。此外，細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）釋放的IFN-γ是反應(yīng)性PD-L1表達(dá)的最強(qiáng)刺激物［19］，因此將PD-L1 作為腫瘤疫苗的靶點(diǎn)，靶向PD-L1 的CTL 理論上可以在腫瘤部位通過正反饋調(diào)節(jié)不斷地發(fā)起對(duì)PD-L1陽性腫瘤細(xì)胞的殺傷。

本研究以免疫檢查點(diǎn)PD-L1為腫瘤疫苗靶點(diǎn)，預(yù)測(cè)PD-L1的CTL 表位肽和線性B 表位肽，并與硝基化輔助T 細(xì)胞表位連接，設(shè)計(jì)靶向PD-L1 的表位肽疫苗。硝基化輔助T 細(xì)胞表位是本課題組前期設(shè)計(jì)的能夠打破自體蛋白免疫耐受的CD4+T 表位，研究表明CD4+T 細(xì)胞對(duì)于誘導(dǎo)強(qiáng)大的CTL 反應(yīng)和CD8+記憶性T 細(xì)胞是十分必要的［20］。因此，本研究篩選并驗(yàn)證了PD-L1表位肽的免疫原性，并在小鼠腫瘤模型中研究了PD-L1-B1表位肽疫苗的抗腫瘤活性，同時(shí)初步探究了PD-L1-B1 表位肽疫苗對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響。

1 材 料

1.1 試 劑

IFN-γ EliSpot 檢測(cè)試劑盒（德國(guó)AID 公司）；CpG 1018（北京擎科生物科技有限公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗小鼠IgG 抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；AF488標(biāo)記的羊駝抗人IgG抗體（美國(guó)杰克遜公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、EasyPure RNA Kit 試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；胎牛血清（FBS，美國(guó)Gibco公司）；紅細(xì)胞裂解液、FITC 標(biāo)記的抗小鼠CD45抗體、BB700 標(biāo)記的抗小鼠CD3 抗體、PE 標(biāo)記的抗小鼠CD4 抗體、APC 標(biāo)記的抗小鼠CD8 抗體（美國(guó)BD 公司）；7AAD 活性染色溶液、CFSE 細(xì)胞增殖試劑盒（美國(guó)賽默飛公司）；HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技公司）；mPDL1 蛋白、hPDL1蛋白（課題組設(shè)計(jì)并合成純化，純度大于80%）。

1.2 動(dòng)物和細(xì)胞株

重度免疫缺陷（NPI）雌性小鼠，6 ～ 8周齡，SPF級(jí)，購(gòu)自北京艾德摩生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2022-0001；BALB/c 雌性小鼠（6 ～ 8周齡），SPF級(jí)，購(gòu)自杭州子源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK（浙）2019-0004。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合中國(guó)藥科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

小鼠肝癌細(xì)胞株H22、小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26、人黑色素瘤細(xì)胞株A375、小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16F10（中國(guó)藥科大學(xué)江蘇省生物藥物成藥性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存）。

1.3 儀 器

Nanodrop 2000分光光度計(jì)、QuantStudio 3 PCR儀、高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)賽默飛公司）；Countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（上海澤權(quán)儀器設(shè)備有限公司）；BD Accuri C6 Plus流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

2 方 法

2.1 免疫檢查點(diǎn)PD-L1表位預(yù)測(cè)與肽疫苗設(shè)計(jì)

免疫檢查點(diǎn)PD-L1 分子胞外區(qū)和跨膜區(qū)蛋白序列由Uniprot 數(shù)據(jù)庫（http：//www. uniprot. org）查詢得到。隨后，通過免疫表位在線預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫IEDB（http：//www. iedb. org）對(duì)PD-L1 胞外和跨膜序列進(jìn)行CTL 表位和線性B 表位預(yù)測(cè)。綜合分析所有預(yù)測(cè)結(jié)果，選擇預(yù)測(cè)排名好、親和力高、半衰期長(zhǎng)的表位進(jìn)行合并設(shè)計(jì)，使所設(shè)計(jì)的CTL 表位肽可至少針對(duì)兩個(gè)不同的主要組織相容性復(fù)合體MHC Ⅰ類分子。最后通過柔性肽將PD-L1表位肽與硝基化輔助T 細(xì)胞表位連接，設(shè)計(jì)成PD-L1表位肽疫苗。所有的表位肽由合肥合生生物工程有限公司進(jìn)行合成，合成肽的純度大于95 %。

2.2 免疫原性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

2.2.1 人外周血單個(gè)核細(xì)胞（hPBMC）的分離與孵育 吸取無菌PBS 將濾器中殘留血液沖出稀釋，離心管中加入人淋巴細(xì)胞分離液15 mL，然后緩慢加入血液25 mL。采用密度梯度離心，1 850 r/min離心25 min。用一次性吸管吸取PBMC 細(xì)胞層（乳白色）到離心管中，補(bǔ)加PBS 至40 mL，1 420 r/min離心10 min。加入紅細(xì)胞裂解液3 mL 重懸，裂解10 min。加入PBS至30 mL，1 600 r/min離心3 min，室溫洗滌兩次。用RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸，稀釋，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量以及存活率。將人白細(xì)胞抗原（HLA）分型匹配的PBMC 鋪板，每個(gè)培養(yǎng)皿2 × 107個(gè)細(xì)胞。每個(gè)肽孵育50 μg，37 ℃、5% CO2過夜培養(yǎng)。

2.2.2 NPI 小鼠人源免疫系統(tǒng)重建和免疫方案將NPI小鼠按照體重隨機(jī)分成3組，每組4只，分別為溶劑對(duì)照組、PD-L1-B1 組、PD-L1-B2 組，確保分組后組間小鼠體重沒有顯著性差異。尾靜脈移植約1 × 107個(gè)PBMC，重建人免疫系統(tǒng)。第2 天皮下免疫表位肽疫苗，此后每周免疫1 次，共3 次。每只小鼠接種PD-L1-B 表位肽50 μg 和佐劑CpG 1018 20 μg 的混合溶液，每3 天記錄一次小鼠的體重和移植物抗宿主?。℅VHD）情況。

2.2.3 PD-L1 蛋白的構(gòu)建和純化 將小鼠PD-L1蛋白胞外區(qū)（19-239）與硝基化輔助T 細(xì)胞表位融合構(gòu)建mPD-L1 蛋白，將人PD-L1 蛋白胞外區(qū)（19-238）與硝基化輔助T 細(xì)胞表位融合構(gòu)建hPDL1 蛋白。mPD-L1 和hPD-L1 蛋白的表達(dá)和純化同文獻(xiàn)［21］所述。隨后，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、Western blot 對(duì)純化的PD-L1疫苗進(jìn)行分析驗(yàn)證，蛋白純度大于80%。

2.2.4 ELISA 評(píng)價(jià)PD-L1-B 表位肽的免疫原性分別于免疫后第7、14、21、24天對(duì)小鼠進(jìn)行眼底靜脈叢取血，6 000 r/min 離心30 min，取上清液即為所需抗血清，選擇免疫系統(tǒng)重建成功的HIS 小鼠，取抗血清以1∶100 比例進(jìn)行稀釋后檢測(cè)PD-L1 特異性抗體滴度。hPD-L1蛋白作為抗原包被于酶標(biāo)條中，37 ℃孵育2 h。PBST 洗滌5 次，然后用5%BSA 封閉過夜。PBST 洗滌5 次，加入稀釋的小鼠抗血清，37 ℃孵育2 h。PBST 洗滌6 次，接著用HRP 標(biāo)記的山羊抗人二抗37 ℃孵育45 min。PBST 洗滌7 次。加入顯色劑顯色，37 ℃避光孵育15 min。用1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀在450 nm、630 nm處讀取吸收度。

2.2.5 流式檢測(cè)抗血清中PD-L1-B1 抗體與天然PD-L1受體的結(jié)合 以高表達(dá)PD-L1的腫瘤細(xì)胞為靶細(xì)胞（如A375、B16F10）。收集靶細(xì)胞并計(jì)數(shù)，使每個(gè)樣本細(xì)胞數(shù)量為2 × 105個(gè)。加入含1% FBS 的PBS 1 mL 洗滌細(xì)胞，1 769 r/min 離心5 min，棄上清。加入按1∶100稀釋的小鼠抗血清100 μL，室溫孵育30 min。1 769 r/min 離心5 min，棄上清液。PBS洗滌3次，將細(xì)胞重懸于PBS 0.1 mL中。加入AF488 標(biāo)記的羊駝抗人IgG 二抗，室溫孵育1 h。PBS洗滌2次，最后重懸細(xì)胞于PBS 0.2 mL中。在流式細(xì)胞儀上分析抗體結(jié)合的細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

2.2.6 IFN-γ EliSpot 評(píng)價(jià)PD-L1-T 表位肽的免疫原性 準(zhǔn)備IFN-γ EliSpot試劑板，加入滅菌PBS清洗4 次。然后加入RPMI 1640 完全培養(yǎng)基，室溫靜置孵育30 min。倒棄培養(yǎng)基，隨后在各孔中加入對(duì)應(yīng)的刺激物，其中刺激用肽每孔10 μg，陽性刺激物每孔0.3 μL。接著加入小鼠脾臟淋巴細(xì)胞懸液，每孔5 × 105個(gè)細(xì)胞，設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。PBS洗滌5次。加入稀釋的IFN-γ 抗體，室溫孵育2 h。PBS 洗滌5 次，加入過濾后的顯色液，避光顯色20 min。用去離子水洗滌正反面及底座3 ～ 5 遍，終止顯色。將板條避光密封保存，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)分析儀讀取數(shù)據(jù)。

2.3 PD-L1-B1表位肽的抗腫瘤活性評(píng)價(jià)

2.3.1 H22 肝癌腫瘤模型構(gòu)建及動(dòng)物分組BALB/c 小鼠腹腔移植2 × 106個(gè)H22 細(xì)胞，腹腔培養(yǎng)10 d后，抽取腹水，分離H22細(xì)胞，37 ℃、5% CO2過夜培養(yǎng)。第2 天，每只BALB/c 小鼠于右后肢靠背部位皮下注射5 × 105個(gè)H22 細(xì)胞。當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到3 ～ 5 mm 時(shí)，選擇造模成功且腫瘤形態(tài)規(guī)則的小鼠，以腫瘤體積大小為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行隨機(jī)區(qū)間分組，確保組間小鼠腫瘤體積和體重大小沒有顯著性差異。將小鼠分為3 組，分別為溶劑對(duì)照組、PD-L1 組、PD-L1-B1 組，每組8 ～ 10 只。其中PDL1 組免疫的是實(shí)驗(yàn)室前期驗(yàn)證有抗腫瘤活性的mPD-L1 蛋白，用于比較PD-L1-B1 表位肽疫苗與PD-L1蛋白疫苗的抑瘤效果。

2.3.2 免疫方案 分組當(dāng)天（第0天）進(jìn)行皮下免疫，溶劑對(duì)照組注射生理鹽水，PD-L1 組和PD-L1-B1 組免疫用的蛋白和表位肽（50 μg）與佐劑CpG 1018（20 μg）混合后接種。隨后在第7、14 天進(jìn)行兩次免疫，共免疫3次。從第0天開始，每3天進(jìn)行一次體質(zhì)量和腫瘤測(cè)量。

2.4 CTL效應(yīng)檢測(cè)

將200 μL，5 × 104個(gè)靶細(xì)胞提前鋪于48孔板。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)4 h。收集過夜刺激孵育的脾臟淋巴細(xì)胞到離心管中，1 200 r/min離心5 min。加入PBS 10 mL，1 200 r/min 離心5 min。加入適量的PBS重懸細(xì)胞，添加CFSE，使其終濃度為2 μmol/L，立即混合并在室溫下避光孵育7 min。通過添加4倍體積的預(yù)冷的完全培養(yǎng)基（含≥10 %血清）停止標(biāo)記，并在冰上孵育10 min，1 200 r/min離心5 min。用預(yù)冷的完全培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2 次，1 200 r/min 離心5 min。加入完全培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)，按照50∶1 效靶比進(jìn)行鋪板，每孔200 μL，2.5 × 106個(gè)細(xì)胞。搖勻，孵育24 h。收集培養(yǎng)基，再加入PBS洗滌，收集上清液。向孔中加入胰酶200 μL消化，加入完全培養(yǎng)基200 μL 終止消化，吹打收集細(xì)胞，1 769 r/min離心5 min。加入PBS 1 mL 重懸，1 769 r/min 離心5 min。用70 μm 濾膜過濾，每孔在上樣前5 min 加入7AAD（靶細(xì)胞單染加7AAD 0.5 μL）5 μL，混懸。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞殺傷活性。

2.5 小鼠肝癌腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞檢測(cè)

取實(shí)體腫瘤組織新鮮標(biāo)本，用手術(shù)剪去除壞死及脂肪組織，選取癌細(xì)胞集中和細(xì)胞活力較好的部位。將組織切成直徑1 ～ 2 mm 的碎塊，隨后將腫瘤組織轉(zhuǎn)移至裝有消化酶的離心管中。37 ℃水浴消化40 min，每隔2 ～ 3 min 顛倒混勻。將細(xì)胞懸液經(jīng)70 μm 濾網(wǎng)過濾，PBS 沖洗，收集濾液，1 769 r/min 離心7 min。加入PBS 重懸細(xì)胞。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、單染組和空染組，每個(gè)樣本取2 × 106個(gè)細(xì)胞，加入PBS 重懸細(xì)胞1 mL，1 769 r/min 離心5 min。加入含1% BSA 的PBS 1 mL 重懸細(xì)胞，1 769 r/min 離心5 min。加入FITC 標(biāo)記的抗小鼠CD45 抗體、BB700 標(biāo)記的抗小鼠CD3 抗體、PE 標(biāo)記的抗小鼠CD4 抗體、APC 標(biāo)記的抗小鼠CD8 抗體，CD45、CD3、CD4、CD8 單染管加入對(duì)應(yīng)的流式抗體，4 ℃避光孵育30 min。每管加入PBS 1 mL 洗滌，1 769 r/min離心5 min。加入PBS 600 μL重懸細(xì)胞，過濾后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞。

2.6 腫瘤組織RNA分離提取和qRT-PCR

每個(gè)小鼠腫瘤樣本稱取20 mg，放入液氮預(yù)冷的研缽中研磨成粉，隨后使用EasyPure RNA Kit 試劑盒提取腫瘤組織RNA。使用Nanodrop 2000 檢測(cè)RNA 的濃度和純度。使用HiScript Ⅲ RT Super-Mix for qPCR 試劑將每個(gè)樣本的1 μg 總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒通過qRT-PCR 檢測(cè)基因表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒操作說明書進(jìn)行。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各項(xiàng)結(jié)果以±s表示。采用Student′sttest 對(duì)兩組樣本進(jìn)行顯著性比較，采用One-way ANOVA 方差分析對(duì)3組及以上樣本進(jìn)行顯著性比較，P＜ 0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 PD-L1表位肽疫苗的設(shè)計(jì)

選擇中國(guó)人群常見的HLA I 類分型：HLA-A*02∶01、HLA-A*11∶01、HLA-A*24∶02 進(jìn)行表位預(yù)測(cè)，獲得了CTL 表位肽和線性B 表位肽，經(jīng)過表位合并，設(shè)計(jì)了4個(gè)CTL表位肽和2個(gè)線性B表位肽，并與硝基化輔助T細(xì)胞表位連接，最終候選表位肽序列見表1。

3.2 基于HIS 小鼠檢測(cè)PD-L1 表位肽的體液免疫活性

為了檢測(cè)PD-L1-B表位肽的免疫原性，取首次免疫后第7、14、21、24 天的HIS 小鼠血清，使用ELISA 法檢測(cè)抗體滴度驗(yàn)證B 表位肽的免疫原性。結(jié)果如圖1-A 所示，從第14 天開始，PD-L1-B1 表位肽誘導(dǎo)產(chǎn)生了相較于溶劑對(duì)照組有顯著性差異的PD-L1 特異性抗體（P ＜0.05），并且第21、24 天的抗體滴度進(jìn)一步升高，但PD-L1-B2 表位肽未能成功誘導(dǎo)出PD-L1特異性抗體。

Table 1 Amino acid sequence of hPD-L1 epitope peptides

為了驗(yàn)證誘導(dǎo)產(chǎn)生的PD-L1-B1抗體能否和細(xì)胞表達(dá)的天然PD-L1受體結(jié)合，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。選擇PD-L1陽性表達(dá)細(xì)胞為靶細(xì)胞（本實(shí)驗(yàn)選擇人A375 腫瘤細(xì)胞和小鼠B16F10 腫瘤細(xì)胞），加入HIS小鼠血清作為一抗，然后加入熒光標(biāo)記的抗人IgG 二抗進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖1-B 所示，與對(duì)照組相比，設(shè)計(jì)的兩款PD-L1-B 表位肽中，PD-L1-B1成功誘導(dǎo)出了PD-L1 特異性抗體，并能與人PD-L1陽性表達(dá)細(xì)胞A375 結(jié)合。研究還發(fā)現(xiàn)當(dāng)以鼠PDL1 陽性表達(dá)細(xì)胞B16F10 為靶細(xì)胞時(shí)，HIS 小鼠血清中PD-L1 特異性抗體同樣能夠結(jié)合小鼠B16F10細(xì)胞上表達(dá)的PD-L1蛋白（圖1-C）。

Figure 1 Immunogenicity of PD-L1-B epitope peptide and cross-reactivity of the PD-L1-B1 antiserum to native PD-L1 ( ± s, n = 3)A: Antibody titers produced after immunization of mice with PD-L1-B epitope peptide vaccine; B: Binding of PD-L1-B1 antiserum to human A375;C: Binding of PD-L1-B1 antiserum to mouse B16F10*P ＜ 0.05; ns:Not significant

3.3 基于HIS 小鼠檢測(cè)PD-L1 表位肽的細(xì)胞免疫活性

序列分析發(fā)現(xiàn)，預(yù)測(cè)并設(shè)計(jì)的PD-L1-T2 表位肽包含于PD-L1-B1 表位肽中。為了驗(yàn)證PD-L1-B1 中的T2 表位肽是否能夠誘導(dǎo)出針對(duì)T2 表位肽的肽特異性T 細(xì)胞，對(duì)HIS 小鼠進(jìn)行PD-L1-B1 表位肽疫苗免疫。隨后在IFN-γ EliSpot實(shí)驗(yàn)中，采用T2 短肽刺激脾臟淋巴細(xì)胞，結(jié)果如圖2 所示。采用配對(duì)T 檢驗(yàn)，加入T2 肽刺激后，斑點(diǎn)數(shù)顯著增加，這表明PD-L1-B1 肽中的T2 肽能有效誘導(dǎo)出肽特異性T細(xì)胞。

3.4 PD-L1-B1表位肽疫苗的抗腫瘤活性評(píng)價(jià)

前面的免疫原性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)篩選并驗(yàn)證了PDL1 表位肽的免疫原性，發(fā)現(xiàn)PD-L1-B1 表位肽疫苗誘導(dǎo)的PD-L1 特異性抗體不僅能結(jié)合人PD-L1，還能與鼠PD-L1 結(jié)合，同時(shí)PD-L1-B1 還包含了一個(gè)驗(yàn)證有免疫原性的CTL 表位肽PD-L1-T2，因此選擇PD-L1-B1表位肽，進(jìn)一步探究其抗腫瘤活性。

為了評(píng)價(jià)PD-L1-B1 表位肽的抑瘤活性，在BALB/c小鼠中構(gòu)建H22肝癌皮下移植瘤模型。抑瘤結(jié)果如圖3-A，3-B所示，相較于溶劑對(duì)照組，PDL1-B1 表位肽顯著抑制了腫瘤的生長(zhǎng)［（757.3 ±376.2）mm3vs（1 978 ± 1 026）mm3，P ＜0.01）］，并且抑瘤效果不比PD-L1 蛋白疫苗差。在進(jìn)一步評(píng)價(jià)PD-L1-B1 表位肽活性的實(shí)驗(yàn)中，分離了治療后的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，首先通過IFN-γ Elispot評(píng)估了各組淋巴細(xì)胞的IFN-γ的分泌水平，然后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了各組脾臟淋巴細(xì)胞的細(xì)胞殺傷毒性，統(tǒng)計(jì)結(jié)果分別如圖3-C、3-D 所示。結(jié)果表明PD-L1-B1 表位肽免疫后顯著增強(qiáng)了脾臟淋巴細(xì)胞的IFN-γ 分泌水平，同時(shí)其誘導(dǎo)的CTL 具有很高的體外殺傷活性，為（36.87 ± 3.43）%。相較于溶劑對(duì)照組，PD-L1-B1 組CTL 對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＜0.000 1）。

Figure 2 IFN-γ EliSpot responses against T2 epitope peptide in PD-L1-B1 ( ± s, n = 6)*P ＜ 0.05

Figure 3 Anti-tumor activity of PD-L1-B1 epitope peptide vaccineA: Tumor volume growth curve in mice after vaccine immunization (± s, n = 8-10); B: Tumor size in mice executed after vaccine treatment ( ± s, n =6); C: IFN-γ secretion levels in 5 × 105 spleen lymphocytes ( ± s, n = 6); D: In vitro killing toxicity of splenic lymphocytes after immunization ( ±s,n = 6)*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001, ****P ＜ 0.000 1

3.5 腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞檢測(cè)

為了分析PD-L1-B1表位肽疫苗治療后對(duì)腫瘤微環(huán)境中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的影響，分別檢測(cè)腫瘤組織中CD45+細(xì)胞、CD3+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，結(jié)果如圖4所示。與溶劑對(duì)照組相比，PD-L1-B1 表位肽疫苗接種顯著增加了CD45+免疫細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)數(shù)量（P ＜0.000 1）（圖4-A），并且相對(duì)于溶劑對(duì)照組，PD-L1-B1 組誘導(dǎo)的T 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)水平顯著提高（P ＜0.01）（圖4-B）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PD-L1 蛋白和PD-L1-B1表位肽都提高CD4+T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)水平，但PDL1-B1組腫瘤浸潤(rùn)的CD4+T細(xì)胞比例更高，占比達(dá)到（59.48 ± 12.87）%，與溶劑對(duì)照組相比具有顯著性差異（P ＜0.001）（圖4-C）。最后相較于溶劑對(duì)照組，PD-L1-B1 表位肽誘導(dǎo)的CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)水平顯著提高（P ＜0.000 1）（圖4-C）。

Figure 4 Detection of tumor-infiltrating lymphocytes in mouse tumor tissues ( ± s, n = 6)A: Proportion of infiltrating CD45+ cells in tumor tissue after immunization; B: Proportion of CD3+ T cells to CD45+ cells in tumors after immunization;C: Proportion of CD4+ T cells and CD8+ T cells to CD3+ T cells in tumors after immunization*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001, ****P ＜ 0.000 1

3.6 腫瘤組織中相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)

為了進(jìn)一步分析PD-L1-B1表位肽疫苗對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響，檢測(cè)了腫瘤組織中相關(guān)蛋白或者細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平變化情況，結(jié)果如圖5 所示。首先檢測(cè)了腫瘤微環(huán)境中PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平變化，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于溶劑對(duì)照組，PD-L1-B1 組腫瘤組織中PD-L1 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平顯著升高（P ＜0.01）（圖5-A）。隨后檢測(cè)了具有抑瘤作用的IFN-γ 和TNFα 的轉(zhuǎn)錄水平變化（圖5-B，圖5-C），發(fā)現(xiàn)相較于溶劑對(duì)照組和PD-L1 組，PD-L1-B1 組腫瘤微環(huán)境中IFN-γ 和TNF-α 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平顯著提高。此外，還檢測(cè)了炎癥因子IL-2 和IL-10 的轉(zhuǎn)錄水平變化情況，結(jié)果顯示PD-L1-B1 組腫瘤組織免疫激活細(xì)胞因子IL-2 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平顯著升高（P ＜0.001），而免疫抑制細(xì)胞因子IL-10 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平下降（P ＜0.01）（圖5-D，圖5-E）。

Figure 5 Detection of relevant proteins relative expression levels in tumor tissues by qRT-PCR ( ± s, n = 5)A: mRNA transcript levels of PD-L1; B: mRNA transcript levels of IFN-γ; C: mRNA transcript levels of TNF-α; D: mRNA transcript levels of IL-2;E: mRNA transcript levels of IL-10*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001

4 討 論

本研究以PD-L1 為靶點(diǎn)預(yù)測(cè)PD-L1 表位肽，并與硝基化輔助T 細(xì)胞表位連接設(shè)計(jì)成PD-L1 表位肽疫苗。抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖3），設(shè)計(jì)的PD-L1-B1 表位肽疫苗具有良好的抑瘤活性，治療后的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞殺傷活性，這表明以PD-L1為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)表位肽疫苗是可行的。

PD-1/PD-L1 是腫瘤免疫療法的理想靶點(diǎn)，目前國(guó)內(nèi)上市的PD-1/PD-L1單克隆抗體已經(jīng)達(dá)到15款。然而在大多數(shù)癌癥類型中，由于缺乏預(yù)先存在的抗腫瘤CTL，大多數(shù)患者沒有反應(yīng)，也沒有獲得臨床益處［11］。因此，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)腫瘤抗原的CTL 的治療性腫瘤疫苗可以提高患者對(duì)ICB的反應(yīng)率。PD-L1可在大多數(shù)腫瘤中誘導(dǎo)表達(dá)，是致使腫瘤免疫逃逸的主要免疫檢查點(diǎn)分子，目前的PD-1/PD-L1 ICB 適應(yīng)癥基本囊括主要癌癥類型。在評(píng)價(jià)PD-L1-B1 表位肽抑瘤活性的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)PD-L1-B1表位肽疫苗治療能夠有效增加免疫細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)數(shù)量。在連接硝基化輔助T 細(xì)胞表位的情況下，PD-L1-B1 表位肽組的腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞的浸潤(rùn)水平相較于溶劑對(duì)照組顯著升高（圖4-C）。在檢測(cè)腫瘤組織中IFN-γ 和PD-L1 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平變化時(shí)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)PD-L1-B1 表位肽治療后，IFN-γ 轉(zhuǎn)錄水平明顯上升。相對(duì)應(yīng)的，PD-L1 的轉(zhuǎn)錄水平也被檢測(cè)到上升，與目前研究認(rèn)為的IFN-γ 可誘導(dǎo)PD-L1 表達(dá)是一致的［22］。因此，針對(duì)PD-L1 的表位肽疫苗能夠誘導(dǎo)肽特異性T細(xì)胞聚集到腫瘤組織中，分泌IFNγ 引發(fā)一系列抗腫瘤反應(yīng)，而IFN-γ 還能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1，PD-L1 特異性CTL 又能進(jìn)一步識(shí)別并殺傷PD-L1陽性腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮正反饋調(diào)節(jié)的作用。

針對(duì)腫瘤免疫逃逸機(jī)制的免疫檢查點(diǎn)開發(fā)腫瘤疫苗提供了一種新的、可推廣的策略。治療性腫瘤肽疫苗是一種低副作用的疫苗接種方法，能以主動(dòng)免疫的方式在體內(nèi)誘導(dǎo)出針對(duì)腫瘤細(xì)胞的持久的特異性T 細(xì)胞反應(yīng)［23］或者多克隆抗體反應(yīng)［18］。在檢測(cè)腫瘤組織中相關(guān)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，PD-L1-B1 表位肽疫苗治療能夠提高激活免疫的炎癥因子轉(zhuǎn)錄，如IFN-γ、TNF-α、IL-2。IFN-γ 和TNF-α 被認(rèn)為在抗腫瘤免疫中發(fā)揮了重要作用［24］，有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤中同時(shí)表達(dá)IFN-γ 和PD-L1 的患者比單獨(dú)表達(dá)IFN-γ 的患者具有更好的預(yù)后［25］。此外IL-2 除了具有促進(jìn)T 細(xì)胞增殖作用外，還調(diào)節(jié)CD8+T 細(xì)胞效應(yīng)和記憶反應(yīng)［26］。同時(shí)，PD-L1-B1 表位肽疫苗還降低免疫抑制分子的表達(dá)，如IL-10。綜上所述，PD-L1 表位肽疫苗可以重塑腫瘤免疫抑制微環(huán)境，使腫瘤微環(huán)境向免疫炎癥方向轉(zhuǎn)變。目前研究認(rèn)為免疫炎癥腫瘤（又稱“熱”腫瘤）特征是高T 細(xì)胞浸潤(rùn)、IFN-γ 信號(hào)增強(qiáng)、PD-L1 表達(dá)和高腫瘤突變負(fù)荷（TMB）［27］。因此，認(rèn)為在PD-L1-B1表位肽疫苗的作用下，“冷”腫瘤有向“熱”腫瘤轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。

綜上所述，本研究篩選得到的PD-L1-B1 表位肽不僅能誘導(dǎo)產(chǎn)生PD-L1 特異性抗體和細(xì)胞毒性T 細(xì)胞，有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，還能增加腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+T 細(xì)胞，重塑腫瘤免疫抑制微環(huán)境。因此，PD-L1-B1表位肽疫苗是一個(gè)有效的腫瘤免疫治療候選分子，期待PD-L1-B1 表位肽疫苗聯(lián)合ICB 或者其他免疫療法在腫瘤臨床治療中的應(yīng)用前景。