HPLC法測定合歡皮抗新生血管有效部位中的總皂苷

施建軍， 譚 瑩， 杜 斌， 錢建瑛， 馮 磊， 邱麗穎

(江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，江蘇無錫214122)

合歡皮是豆科植物合歡Albizzia julibrissin Durazz的樹皮，為常用的傳統(tǒng)中藥，具有解郁安神、活血消腫之功效［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，合歡皮具有抗腫瘤作用［2］。合歡皮具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性［3-4］。在以抗腫瘤新生血管的生理活性指標(biāo)下，分離純化得到了合歡皮提取物，定性鑒別分析確定了該活性組分群為皂苷類化合物［5］。前期實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)報(bào)道表明合歡皮中目前已鑒定的皂苷的苷元多為齊墩果酸［6］。由于目前尚未有通過國家鑒定的合歡皮總皂苷對(duì)照品，測定合歡皮總皂苷的方法主要是紫外分光光度法［7-8］，雖然該方法所需設(shè)備及操作簡單，易普及推廣，靈敏度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性較高，應(yīng)用范圍廣;但其專屬性較差，對(duì)許多物質(zhì)均有顯色反應(yīng)，且易受環(huán)境因素、儀器等影響。本實(shí)驗(yàn)選用齊墩果酸為參照對(duì)照品，通過酸水解合歡皮中的總皂苷，得到齊墩果酸苷元，建立合歡皮中總皂苷的HPLC定量測定方法，以齊墩果酸的含有量代表總皂苷的含有量，同時(shí)對(duì)該方法進(jìn)行可行性分析。

1 儀器和試藥

HITACHI高效液相色譜儀，電子天平［梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司］，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，電熱恒溫水槽 (上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司)。齊墩果酸對(duì)照品由中國藥品生物制品檢定所提供 (110709-200505)，合歡皮生藥材由無錫山禾集團(tuán)中藥飲片廠提供 (20070418)，乙腈和甲醇為色譜純，水為二次蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 原藥及樣品溶液的準(zhǔn)備

2.1.1 原藥的制備 取合歡皮，粉碎，加10倍量75%乙醇溶液，加熱回流，冷卻過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，去離子水復(fù)溶，60℃真空干燥。取干粉，加去離子水溶解，等體積水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，回收溶劑，加水復(fù)溶，60℃真空干燥，得原藥。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精確稱取齊墩果酸對(duì)照品粉末1.5 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得貯備液，每1 mL含齊墩果酸0.15 mg。

2.1.3 供試品的制備 精密稱取原藥0.2 g，按2.3.2項(xiàng)單因素和2.3.3項(xiàng)正交實(shí)驗(yàn)方法制得的水解物，用甲醇定容至10 mL，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.4 陰性樣品1的制備 取200 mg原藥，用甲醇定容至10 mL，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.5 陰性樣品2的制備 原藥按2.3.2項(xiàng)方法酸解過濾后，在石油醚提取前，將沉淀直接加甲醇定容至5 mL，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.6 陰性樣品3的制備 原藥按2.3.2項(xiàng)方法酸解后將濾液與洗液合并，加NaOH溶液將pH調(diào)至中性，減壓蒸干溶劑，加甲醇定容至5 mL，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 HPLC測定齊墩果酸方法學(xué)考察

2.2.1 色譜條件 WondaSilTMC18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相乙腈-水 (90 ∶10);檢測波長210 nm;柱溫30℃;體積流量1 mL/min。理論板數(shù)以齊墩果酸計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2.2 線性關(guān)系考察 精密量取齊墩果酸對(duì)照品2、4、6、8、10、15、20 μL進(jìn)樣，按上述色譜條件進(jìn)行測定，以進(jìn)樣量 (X)為橫坐標(biāo)，峰面積 (Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:Y=564220X－7190.5，(R2=0.9992)。結(jié)果表明齊墩果酸在0.3～3.0 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一齊墩果酸對(duì)照品溶液(0.15 mg/mL)10 μL，在2.2.2項(xiàng)條件下，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定齊墩果酸的峰面積，計(jì)算得其RSD為1.60%。

2.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密吸取不同供試品溶液6份，在2.2.1項(xiàng)條件下進(jìn)樣10 μL，測定齊墩果酸的峰面積，計(jì)算得其RSD為1.72%。

2.2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10 μL，在2.2.1項(xiàng)條件下分別于0、2、4、8、12、24 h內(nèi)測定齊墩果酸峰面積，計(jì)算得其RSD為1.36%。

2.2.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取不同供試品溶液6份，分別精密加入齊墩果酸對(duì)照品3 mg，在2.2.1項(xiàng)條件下測定齊墩果酸峰面積，計(jì)算得平均回收率為97.91%，RSD為0.84%，結(jié)果見表1。

表1 齊墩果酸加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 酸水解工藝考察

2.3.1 酸水解合歡皮總皂苷的工藝研究 合歡皮皂苷為齊墩果酸型皂苷，常用水解劑有甲酸、乙酸、硫酸和鹽酸等。本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)考察乙酸、鹽酸和硫酸的水解程度;以酸濃度、酸量、水解溫度和酸解時(shí)間4個(gè)因素為考察對(duì)象，每個(gè)因素設(shè)立3個(gè)水平 (見表2)，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)，以齊墩果酸含有量為指標(biāo)，優(yōu)選最佳的水解條件。

表2 L9(34)因素水平

2.3.2 單因素實(shí)驗(yàn) 按2.1.1項(xiàng)方法取0.2 g提取物于100 mL圓底燒瓶中，各加入30 mL 1 mol/L硫酸、30 mL 2 mol/L鹽酸和30 mL 2 mol/L乙酸，85℃水浴鍋中反應(yīng)2 h。冷卻后中速濾紙過濾，將沉淀用水洗至中性，收集濾液和洗液，沉淀放于烘箱中60℃烘干。用50 mL石油醚回流提取3次，每次提取2 h，合并提取液，旋干，加甲醇復(fù)溶，旋干，最后用甲醇定容至10 mL，制備供試品溶液。由結(jié)果可知硫酸水解后所得齊墩果酸含有量最高，合歡皮總皂苷水解的程度最佳，故所選酸為硫酸。

2.3.3 正交實(shí)驗(yàn) 取9份0.2 g提取物，按表3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)依次按照2.3.2項(xiàng)方法水解，制備供試品溶液。由表3可以看出，A、B、C、D對(duì)皂苷的水解影響程度不同，各因素的影響程度依次為:反應(yīng)時(shí)間 (D)＞料液比 (B)＞酸的濃度 (A)＞反應(yīng)溫度 (C)，最佳的酸水解條件為A3B2C2D3，即加入3 mol/L硫酸30 mL，85℃反應(yīng)4h。由于反應(yīng)溫度影響最小，在方差分析中將其作為誤差。從方差分析結(jié)果表明，酸的濃度 (A)和料液比 (B)對(duì)結(jié)果影響不大，反應(yīng)時(shí)間 (D)對(duì)結(jié)果有顯著性影響，由于只有一個(gè)因素有顯著性影響，因此本實(shí)驗(yàn)不考慮因素之間的交互作用，見表4。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

表4 方差分析

2.4 方法專屬性和特異性考察

2.4.1 方法專屬性考察 按上述色譜條件分別對(duì)對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液進(jìn)行分析。

精密吸取對(duì)照品溶液20 μL，按2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，在WondaSilTMC18柱中的保留時(shí)間為7.8 min左右，說明在該HPLC色譜分析條件適宜，對(duì)供試品溶液的系統(tǒng)分離效果較好。

將原藥水解后的水相，即水解液，按2.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果，在齊墩果酸的保留時(shí)間內(nèi)不出峰，同時(shí)以齊墩果酸為對(duì)照品進(jìn)行TLC檢測亦無對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)出現(xiàn)，說明水解液中不含齊墩果酸這一物質(zhì)，而全部存在于水解后的固相內(nèi)，即水解沉淀。

按2.2.1項(xiàng)色譜條件，將水解沉淀進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果，水解沉淀含有的成分過于復(fù)雜，在乙腈-水 (90∶10)條件下柱子分離齊墩果酸的效能大大降低，干擾了對(duì)齊墩果酸含有量的測定。但采用石油醚回流提取后，石油醚相的HPLC分析能在齊墩果酸保留時(shí)間內(nèi)出峰，并有較好的峰形，理論塔板數(shù)不低于1000，說明石油醚回流提取基本能使齊墩果酸與其他物質(zhì)達(dá)到分離的效果。

2.4.2 方法特異性考察 采用紫外分光光度法和HPLC法測定原藥水解的水相溶液 (陰性對(duì)照溶液1)。HPLC法在檢測原藥水解后的水相溶液時(shí)，在齊墩果酸保留時(shí)間7.8 min左右無色譜峰，同時(shí)TLC檢測時(shí)，在齊墩果酸對(duì)照品對(duì)應(yīng)位置亦無紫色斑點(diǎn)出現(xiàn)，說明該樣品無齊墩果酸這一化合物。而紫外分光光度法檢測時(shí)有顯色反應(yīng)，且齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到40.36 mg/g(n=3，RSD為0.77%)。結(jié)果表明，HPLC法檢測齊墩果酸這一化合物，專屬性較強(qiáng)、準(zhǔn)確性較好。

3 討論

3.1 一種科學(xué)可行、靈敏特異的測定方法是評(píng)價(jià)藥物組分有效物質(zhì)含有量的重要工具。前期工作提取到的具有抗腫瘤新生血管生成組分，能較好抑制腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移能力，體內(nèi)外評(píng)價(jià)其具有良好的成藥性。為了控制提取工藝和促進(jìn)其成藥化，建立一個(gè)靈敏度高、專屬性好和特異性好的方法具有非常的重要意義。

3.2 本實(shí)驗(yàn)建立了總皂苷的HPLC定量分析方法，且靈敏度高，測出最低含有量為0.3 μg;通過分別檢測原藥和陰性樣品，原藥水煮液中檢測不到齊墩果酸，通過酸水解后，樣品中能檢測到齊墩果酸，說明其方法專屬性好;采用紫外分光光度法測定合歡皮水解后的水相溶液，所得齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到38.04 mg/g，但是HPLC法檢測時(shí)，在齊墩果酸保留時(shí)間7.8 min左右無色譜峰，同時(shí)TLC檢測時(shí)，在齊墩果酸對(duì)照品對(duì)應(yīng)位置亦無紫色斑點(diǎn)出現(xiàn)，說明該原藥水解后的水相溶液中無齊墩果酸這一化合物，結(jié)果表明，HPLC法檢測齊墩果酸這一化合物，特異性較好。

3.3 此方法關(guān)鍵步驟為酸水解工藝，本實(shí)驗(yàn)通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)考察合歡皮總皂苷水解的主要因素并確定了最佳水解條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明反應(yīng)溫度對(duì)水解反應(yīng)有顯著影響。最佳水解總皂苷酸的種類為硫酸;其最佳水解工藝為:硫酸濃度3 mol/L，料液比1∶150，水解溫度85℃，水解時(shí)間4 h。

3.4 本研究為合歡皮抗新生血管有效部位總皂苷的定量測定提供了一種可行的、靈敏性、特異性和重復(fù)性好的穩(wěn)定的方法，為合歡皮抗新生血管有效部位的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供了科學(xué)依據(jù)。

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