合歡皮總皂苷對小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的SOD、GSH-PX活性及COX-2、CaN表達的影響

杜 斌， 蔡維維， 馮 磊， 邱麗穎

（江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇無錫214122）

合歡皮總皂苷對小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的SOD、GSH-PX活性及COX-2、CaN表達的影響

杜 斌， 蔡維維， 馮 磊， 邱麗穎*

（江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇無錫214122）

目的 通過觀察合歡皮總皂苷對小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的SOD、GSH-PX活性及COX-2、CaN表達的影響，研究其毒性機制。方法 實驗分為正常對照組、合歡皮總皂苷小劑量致毒組 （7.5 mg/kg）及合歡皮總皂苷大劑量致毒組 （750 mg/kg），一次性灌胃給藥，觀察給藥前及給藥14 d時小鼠自主活動次數(shù)，比色法檢測腦組織超氧化物歧化酶 （SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶 （GSH-PX）活性，鏈霉親和素-生物素復(fù)合物 （SABC）免疫組化試劑盒檢測環(huán)氧化酶-2（COX-2）、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 （CaN）的表達。結(jié)果 合歡皮總皂苷致毒劑量可降低小鼠自主活動次數(shù)；與正常對照組比較，給藥組腦組織中CaN表達降低；COX-2表達增高，有顯著差異性，與合歡皮總皂苷小劑量致毒組比較，合歡皮總皂苷大劑量致毒組腦組織中CaN表達降低，COX-2表達增高，有顯著差異性。與正常對照組比較，給藥組腦組織中SOD和GSH-PX活性均降低，有顯著差異性；與合歡皮總皂苷小劑量致毒組比較，合歡皮總皂苷大劑量致毒組腦組織中SOD活性降低，GSH-PX活性增高，但無差異性。結(jié)論 合歡皮總皂苷致毒劑量對神經(jīng)系統(tǒng)有毒性作用，可能與總皂苷降低SOD、GSH-PX活性，同時增高COX-2表達、降低CaN表達有關(guān)。

合歡皮總皂苷；神經(jīng)毒性；小鼠

合歡皮為豆科植物合歡（Albizia julibrissin Durazz）的干燥莖皮，合歡皮中含有黃酮、三萜、多糖、木脂素、鞣質(zhì)、生物堿、甾醇、脂肪酸甘油酯、吡啶衍生物等多種化學(xué)成分。2000年版 《中華人民共和國藥典》一部收載合歡皮具有解郁安神，活血消腫的功能，說明安心神、解憂郁為合歡皮的主要功效。臨床方劑合歡湯有解郁作用，大致相當(dāng)于興奮大腦皮層。用于心神不安，憂郁失眠，肺癰瘡腫，跌撲傷痛等癥［1］。文獻報道及本實驗室研究發(fā)現(xiàn)合歡皮總皂苷有顯著抗腫瘤新生血管的作用［2-3］，同時發(fā)現(xiàn)一定劑量合歡皮總皂苷對腎臟、肺臟、肝臟、生殖系統(tǒng)、胃腸道等有一定的毒性［4-8］。為了促進臨床使用，需進一步探討合歡皮總皂苷對神經(jīng)系統(tǒng)的作用機制及毒性。

1 實驗與儀器

1.1 實驗動物 清潔級昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量20 g左右。上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，動物合格證號為滬SXK2012-0002。

1.2 藥物和試劑 超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）（南京建成生物工程研究所，批號20130530）；谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-PX）（南京建成生物工程研究，批號20130425）；考馬斯亮藍 （南京建成生物工程研究所，批號20130428）；細胞凋亡及環(huán)氧化酶（Cyclooxygenase，COX）測定試劑盒（武漢博士德生物有限公司，批號分別為13CM400，195841）；DAB顯色液A、B（批號P0203-1、P0203-2，碧云天生物技術(shù)研究所）；其余試劑為國產(chǎn)分析純。合歡皮 （安徽頤生堂中藥飲片有限公司，批號120320），70%乙醇加熱提取2次，提取液濃縮至無乙醇。通過D101型大孔樹脂柱吸附后依次用水、35%和80%乙醇進行梯度洗脫，收集80%洗脫組分，冷凍干燥，所得凍干粉即為實驗用樣品。

1.3 儀器 TG16A-WS臺式離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；TS-8型漩渦混勻器 （江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；DK-8B型電熱恒溫水浴槽 （上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；ME204E電子天平 （梅特勒-托利多儀器 ［上海］有限公司）；ELX800全自動酶標(biāo)儀 （美國伯騰儀器有限公司）；5804R多功能臺式離心機 （德國艾本德公司）；80i正置熒光顯微鏡 （日本尼康公司）；ZZ-6小鼠自主活動儀 （成都泰盟軟件有限公司）。

2 方法

3 結(jié)果

3.1 合歡皮總皂苷對小鼠30 min自主活動的影響 與正常對照組比較，合歡皮總皂苷小劑量致毒組及大劑量致毒組，小鼠30 min站立和活動次數(shù)顯著降低。與合歡皮總皂苷小劑量致毒組比較，大劑量致毒組小鼠30 min站立和活動次數(shù)顯著降低。與給藥前比較，合歡皮總皂苷小劑量致毒組及大劑量致毒組，小鼠30 m in站立和活動次數(shù)顯著降低 （表1）?？傇碥招┝恐露窘M（7.5mg/kg）及合歡皮總皂苷大劑量致毒組 （750 mg/kg），每組10只，雌雄各半。給藥劑量參照本實驗室急性毒理學(xué)研究所得的最小致毒量和最小致死量確定。禁食4 h后一次性灌胃給藥，對照組給予等體積正常。

2.2 小鼠自主活動觀察 給藥前和給藥14 d后，成都泰盟有限公司小鼠自主活動測試儀測試小鼠30 min活動和站立次數(shù)。

2.3 腦組織SOD和GSH-PX的測定 取腦組織相同部位的一小塊組織，用冰鹽水漂洗，吸水紙吸干，稱重，放入10 mL離心管中；加入適量的冷生理水，2 000 r/min勻漿10 s，間歇30 s，反復(fù)3次制成10%的組織勻漿；使用冷凍離心機，4℃，3 500 r/min離心10 m in，取上清液測定腦組織中SOD和GSH-PX的活性。各指標(biāo)測定按照試劑盒說明書進行操作。以考馬斯亮藍法測定蛋白的量。

2.4 SABC免疫組化試劑盒檢測COX-2、CaN陽性細胞的表達 常規(guī)脫蠟至水，根據(jù)SABC免疫組化試劑盒說明，電爐煮沸法進行抗原修復(fù)，3%H2O2滅活內(nèi)源性酶，切片于0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液 （pH 6.0），滴加正常山羊血清封閉液（50μL/片）、CaN或COX-2抗體、生物素化山羊抗小鼠抗體（50μL/片）及SABC（50μL/片），DAB顯色劑，光鏡下控制顯色時間，待細胞核呈棕黃色時，終止反應(yīng)；再用蘇木精復(fù)染，逆梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

2.5 COX-2及CaN陽性細胞表達計數(shù) 高倍鏡下觀察，CaN的陽性細胞表達即核內(nèi)呈棕黃色。COX-2陽性細胞表達即胞漿呈棕色顆粒。每張切片隨機選10個非重疊400高倍鏡視野，計數(shù)COX-2、CaN陽性細胞數(shù)。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，進行單因素方差分析，組間采用t檢驗，實驗數(shù)據(jù)以

表1 合歡皮總皂苷對小鼠30m in自主活動的影響

表1 合歡皮總皂苷對小鼠30m in自主活動的影響

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與合歡皮總皂苷小劑量組比較，##P＜0.01；與同組給藥前比較，△△P＜0.01

組別 劑量/（mg.kg-1） 給藥前 給藥后活動次數(shù)/次 站立次數(shù)/次 活動次數(shù)/次 站立次數(shù)/次32.60±8.33 92.40±13.97 33.20±9.93 88.10±7.48合歡皮總皂苷小劑量組 7.5 34.20±11.06 95.39±10.25 20.42±5.76**△△ 55.46±8.18**△△合歡皮總皂苷大劑量組 750 29.35±7.75 95.12±11.65 14.09±6.60**##△△ 45.83±7.77**##△△正常對照組0

3.2 合歡皮總皂苷對腦組織SOD和GSH-PX的影響 與正常對照組比較，合歡皮總皂苷小劑量致毒組及大劑量致毒組腦組織的SOD和GSH-PX活性均顯著降低。與合歡皮總皂苷小劑量致毒組比較，大劑量致毒組腦組織SOD活性降

低，GSH-PX活性增高，但無統(tǒng)計學(xué)意義 （表2）。3.3 合歡皮總皂苷對腦COX-2及CaN的影響 COX-2在正常腦組織中少有表達。與正常對照組比較，給藥組腦組織中COX-2表達明顯增高，有顯著差異性。與合歡皮總皂苷小劑量致毒組比較，合歡皮總皂苷大劑量致毒組的COX-2表達明顯增高，有顯著差異性 （圖1、表3）。

表2 合歡皮總皂苷對腦組織SOD、GSH-PX活性的影響

表2 合歡皮總皂苷對腦組織SOD、GSH-PX活性的影響

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與合歡皮總皂苷小劑量組比較，##P＞0.05

組別 劑量/（mg.kg-1）SOD/（U.gprot-1）GSH-PX/（U.mL-1）0 357.29±28.7 123.65±33.6合歡皮總皂苷小劑量組 7.5 162.92±29.95** 31.32±3.63**合歡皮總皂苷大劑量組 750 158.33±30.23** 37.32±5.88正常對照組**

與正常對照組比較，給藥組腦組織中CaN表達顯著降低，有顯著差異性。與合歡皮總皂苷小劑量致毒組比較，合歡皮總皂苷大劑量致毒組的腦組織中CaN表達顯著降低，有顯著差異性 （圖1、表3）。

圖1 合歡皮總皂苷對小鼠腦COX-2及CaN表達的影響（×400）

表3 合歡皮總皂苷對腦細胞凋亡及CaN表達的影響s，n=10）

表3 合歡皮總皂苷對腦細胞凋亡及CaN表達的影響s，n=10）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與合歡皮總皂苷小劑量組比較，##P＜0.01

組別 劑量/（mg.kg-1）COX-2/（個/視野）CaN/（個/視野）5.3±0.43 43.7±3.41合歡皮總皂苷小劑量組 7.5 27.6±5.25** 32.5±3.23**合歡皮總皂苷大劑量組 750 47.1±4.25**## 25.2±4.44**##正常對照組0

4 討論

本實驗室已經(jīng)提取到合歡皮有效的抗腫瘤新生血管的組分和單體，但是毒性大安全范圍較?。?-10］。合歡皮乙醇提取物具有良好的體內(nèi)抗腫瘤活性，能明顯抑制小鼠荷瘤生長速度，延長荷瘤鼠存活時間［11］。合歡皮總皂苷通過影響細胞周期，下調(diào)pAKT、pERK的表達量，從而抑制血管形成［12-14］。其抗腫瘤作用，由于藥物劑量增大，神經(jīng)系統(tǒng)的毒性也顯現(xiàn)出來。我們在前期實驗中報道合歡皮總皂苷7.5、75、750 mg/kg劑量組對呼吸系統(tǒng)及腎臟的毒性安全評價。本次實驗結(jié)果顯示合歡皮總皂苷小劑量致毒組及大劑量致毒組腦組織的SOD、GSH-PX活性和CaN表達均降低，腦組織中COX-2表達明顯增加。過氧化損傷、自由基生成及細胞凋亡等可能為合歡皮總皂苷致神經(jīng)毒性的機制。SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，SOD活性高低間接反映腦組織清除自由基的能力；GSH-PX是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，對防止體內(nèi)自由基引起膜脂質(zhì)過氧化特別重要；CaN作為一種使底物脫磷酸化的蛋白磷酸酶，參與全身性應(yīng)激反應(yīng)引起的磷酸化反應(yīng)，在維持重要器官磷酸化反應(yīng)平衡中有重要意義。在過氧化損傷引起的細胞凋亡過程中，Bcl-2與COX參與了細胞凋亡的調(diào)控［4-5］。COX有兩種同工酶COX-1和COX-2。COX-1為結(jié)構(gòu)型被稱為要素酶或管家酶，主要存在于血管、胃、腎等組織中，可產(chǎn)生的PG參與機體正常生理過程和保護功能；COX-2為誘導(dǎo)型，是經(jīng)刺激迅速產(chǎn)生的誘導(dǎo)酶，即由各種損傷性化學(xué)、物理和生物因子誘導(dǎo)其產(chǎn)生，進而催化PGs合成參與炎癥反應(yīng)。COX的表達與細胞凋亡關(guān)系密切［15］，本研究通過COX-2的表達觀察合歡皮總皂苷對腦神經(jīng)的影響。黃清松等［16］報道細胞內(nèi)氧化還原與細胞凋亡有著密切的關(guān)系，本研究發(fā)現(xiàn)合歡皮總皂苷腦組織中SOD、GSH-PX活性與降低CaN的表達、增高COX-2的表達關(guān)系密切。本實驗中，合歡皮總皂苷致毒劑量使腦組織COX-2表達明顯

增多、CaN的表達明顯減少，表明此毒性可能與降低腦組織中SOD、GSH-PX活性有關(guān)。與合歡皮小劑量組比較，合歡皮大劑量組腦組織中SOD、GSH-PX活性降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義，而腦組織中CaN的表達減少，COX-2的表達增加，有顯著差異性。這些指標(biāo)的改變可能影響給藥后小鼠30 m in站立和活動次數(shù)。上述變化有一定的劑量依賴關(guān)系，且與對照組比較有顯著性差異。說明一定劑量的合歡皮總皂苷對可致小鼠神經(jīng)毒性損傷，其損傷程度與合歡皮總皂苷的量呈正相關(guān)性，與陳小青等［17］報道一致?？膳卸ê蠚g皮總皂苷類成分是合歡皮導(dǎo)致神經(jīng)毒性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

綜上所述，合歡皮總皂苷對神經(jīng)系統(tǒng)有一定毒性作用。本課題組在后續(xù)的研究中將選擇陽性藥物對照，加大對合歡皮的神經(jīng)毒性組份及作用機制的研究。

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R285.5

B

1001-1528（2015）11-2514-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.040

2014-06-13

江蘇省中醫(yī)藥管理局康緣中醫(yī)藥科技創(chuàng)新基金項目 （HZ0816KY）

杜 斌 （1983—），男，實驗師，研究方向為藥理學(xué)。Tel：13771560729，E-mail：dubin_41@126.com

*通信作者：邱麗穎 （1965—），女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為天然產(chǎn)物的開發(fā)和中藥藥理學(xué)。Tel：（0510）85327353，E-mail：qiulydoc@sina.com