免疫組化法與RNAscope 原位雜交法檢測(cè)宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中PD-1 和PD-L1 表達(dá)一致性研究

鮑書友，李麗，勞吉鋒，倪建

宮頸鱗狀細(xì)胞癌為女性常見的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，且患病人群呈年輕化趨勢(shì)，大部分患者預(yù)后不佳［1］。研究［2］指出，細(xì)胞的免疫應(yīng)答與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，特異性免疫檢測(cè)的新靶點(diǎn)對(duì)改善宮頸鱗狀細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤預(yù)后具有積極作用。臨床研究［3］表明，激活程序性死亡分子1（PD-1）/程序性死亡分子1 配體（PD-L1）通路可促進(jìn)宮頸癌、胃癌等惡性腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，抑制機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。大量研究［4-6］證實(shí)，抗PD-1/PD-L1 等免疫靶點(diǎn)治療藥物應(yīng)用于肺癌、宮頸癌等中取得良好的抗腫瘤效果。目前存在多個(gè)商品化PD-1、PD-L1 免疫組化抗體，不同抗體使用的閾值、判讀標(biāo)準(zhǔn)及檢測(cè)平臺(tái)均不同，因而也會(huì)有不同的治療選擇。本研究探究免疫組化法與RNAscope 原位雜交法檢測(cè)宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中PD-1 和PD-L1的表達(dá)水平與一致性，以期為臨床檢測(cè)宮頸鱗狀細(xì)胞癌特異性免疫位點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性分析2019 年3 月至2021 年2 月被江陰市中醫(yī)院病理科診斷為宮頸鱗狀細(xì)胞癌的80 例患者石蠟組織標(biāo)本，患者年齡25～86 歲［（65.17 ±7.63）歲］。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理診斷為宮頸鱗狀細(xì)胞癌［7］；（2）均未接受過放療或化療；（3）均接受PD-1抑制劑（納武利尤單抗注射液）治療；（4）年齡＞18 歲；（5）臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他類型惡性腫瘤者；（2）陰道感染性病變者；（3）近1 個(gè)月內(nèi)有免疫抑制劑服用史者；（4）妊娠期或哺乳期患者；（5）合并自身免疫疾病者。該研究已經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫組化法 宮頸癌根治術(shù)標(biāo)本取自宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織，采用石蠟包埋組織并切片（厚度為3 μm），脫蠟、脫水，隨后實(shí)施抗原修復(fù)，加入過氧化氫阻斷液（上海艾研生物科技有限公司），孵育15～20 min 后加入磷酸鹽緩沖液（中國賽默飛世爾科技有限公司）洗滌3～4 次，3～5 min/次，再加入一抗PD-1（單克隆，克隆號(hào)MX033）與一抗PD-L1（單克隆，克隆號(hào)22C3），抗體均購自美國Abcam 公司，孵育過夜（4 ℃）。然后加入山羊抗兔二抗，采用含辣根過氧化酶標(biāo)記（艾美捷科技有限公司），室溫下孵育60 min，接著加入氨基聯(lián)苯胺（上海機(jī)純實(shí)業(yè)有限公司）孵育，用蘇木精-伊紅染色，切片后脫水，最后封片。在高倍鏡下選擇陽性細(xì)胞表達(dá)較多的區(qū)域視野，實(shí)施統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果判讀：PD-L1 主要在腫瘤間質(zhì)免疫細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，腫瘤間質(zhì)免疫細(xì)胞PD-L1 陽性染色定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，腫瘤細(xì)胞PD-L1 陽性染色定位于細(xì)胞膜（完全或部分膜染色）。PD-L1 陽性評(píng)分采用聯(lián)合陽性評(píng)分法（CPS），CPS=［PD-L1 陽性細(xì)胞數(shù)（巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞）/活腫瘤細(xì)胞總數(shù)］×100，CPS≥1記為PD-L1 陽性。PD-1 主要在腫瘤間質(zhì)免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，按照棕褐色、棕黃色、淡黃色、陽性著色分別記為3+、2+、1+、0，PD-1 陽性：著色3+與2+的細(xì)胞比例≥5%［8］。均由2 名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師進(jìn)行判定，如不一致協(xié)商決定。

1.2.2 RNAscope 原位雜交法 PD-1 與PD-L1 特異性探針均購自上海群己生物科技有限公司，采用熒光標(biāo)記PD-1mRNA 與PD-L1mRNA。結(jié)果判讀：PD-1mRNA 與PD-L1mRNA 陽性表現(xiàn)為細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中有棕黃色點(diǎn)，呈棕黃色顆粒狀。20 個(gè)點(diǎn)/細(xì)胞、16～19 個(gè)點(diǎn)/細(xì)胞、11～15 個(gè)點(diǎn)/細(xì)胞、1～10 個(gè)點(diǎn)/細(xì)胞、0 個(gè)點(diǎn)/細(xì)胞分別記為4 分、3 分、2 分、1 分、0 分，分值≥1 分記為細(xì)胞陽性［9］。均由2 名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師進(jìn)行判定，如不一致協(xié)商決定。

1.2.3 臨床病理資料收集 收集整理有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無神經(jīng)侵犯、年齡、腫瘤分期（TNM）、腫瘤直徑、有無脈管侵犯。

1.2.4 預(yù)后分析 患者從首次治療結(jié)束后開始隨訪，隨訪1 年，記錄PD-1mRNA 陽性表達(dá)與PD-1mRNA陰性表達(dá)及PD-L1mRNA 陽性表達(dá)與PD-L1mRNA陰性表達(dá)的總生存時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析所得數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)。采用Kappa 一致性檢驗(yàn)分析RNAscope 原位雜交法與免疫組化法檢測(cè)結(jié)果的一致性，Kappa 值＜0.40 表示一致性差，0.40≤Kappa 值≤0.60 表示一致性一般，0.60＜Kappa 值≤0.08 表示一致性中等，Kappa 值＞0.80 表示一致性良好。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，二者生存曲線的差異比較行Log-rank 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化法與RNAscope 原位雜交法檢測(cè)癌組織中PD-1 和PD-L1 表達(dá)一致性分析

免疫組化法結(jié)果顯示，80 例宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中PD-1 蛋白陽性52 例，陽性率為65.00%；PDL1 蛋白陽性60 例，陽性率為75.00%。RNAscope原位雜交法結(jié)果顯示，80 例宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中PD-1 蛋白陽性49 例，陽性率為61.25%；PD-L1 蛋白陽性57 例，陽性率為71.25%。免疫組化法與RNAscope 原位雜交法檢測(cè)PD-1 表達(dá)一致性良好（Kappa=0.847，P=0.325）；免疫組化法與RNAscope原位雜交法檢測(cè)PD-L1 表達(dá)一致性良好（Kappa 值=0.861，P=0.287）。見表1、2。

表1 免疫組化法與RNAscope 原位雜交法檢測(cè)癌組織中PD-1 表達(dá)一致性分析（例，n=80）

2.2 RNAscope 原位雜交法檢測(cè)癌組織中PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表達(dá)與其臨床病理特征的關(guān)系

PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表達(dá)與患者年齡、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯、TNM 分期、腫瘤直徑無關(guān)（P＞0.05）。見表3。

表2 免疫組化法與RNAscope 原位雜交法檢測(cè)癌組織中PD-L1 表達(dá)一致性分析（例，n=80）

表3 RNAscope 原位雜交法檢測(cè)癌組織中PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表達(dá)與其臨床病理特征的關(guān)系（例，n=80）

2.3 PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表達(dá)與宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系

隨訪1 年，80 例宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者失訪2 例，隨訪率為97.50%。PD-1mRNA 陽性表達(dá)與PD-1mRNA 陰性表達(dá)的總生存曲線比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.037，P=0.847）；PD-L1mRNA 陽性表達(dá)與PD-L1mRNA 陰性表達(dá)的總生存曲線比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.255，P=0.636）。見圖1、2。

圖1 PD-1mRNA 陽性表達(dá)與PD-1mRNA 陰性表達(dá)的總生存曲線

圖2 PD-L1mRNA 陽性表達(dá)與PD-L1mRNA 陰性表達(dá)的總生存曲線

3 討論

有研究［10］指出，腫瘤微環(huán)境中的T 細(xì)胞浸潤(rùn)狀態(tài)與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與預(yù)后關(guān)系密切。目前，PD-L1、PD-1 等免疫位點(diǎn)已成為免疫治療宮頸癌的重要靶點(diǎn)。相關(guān)研究［11］表明，PD-1 為細(xì)胞表面膜蛋白，能夠結(jié)合腫瘤細(xì)胞配體PD-L1，減少機(jī)體T 細(xì)胞分化增殖，激活調(diào)節(jié)T 細(xì)胞活性，并可降低機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，而PD-1 抑制劑能夠抑制PDL1、PD-1 的表達(dá)，以及能夠抑制T 細(xì)胞耗竭，增加機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷能力，并可降低該通路對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的負(fù)向調(diào)控，從而改善腫瘤患者預(yù)后。有研究［12］表明，在宮頸癌細(xì)胞表面，PD-L1、PD-1 表達(dá)明顯增加，其在宮頸癌的免疫逃逸中具有重要作用。故檢測(cè)宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中PD-L1、PD-1 表達(dá)對(duì)于臨床開展免疫治療具有一定的臨床價(jià)值。

目前，臨床上多采用免疫組化法測(cè)定PD-1 和PD-L1 表達(dá)情況，然而不同腫瘤細(xì)胞中PD-1 和PDL1 陽性表達(dá)不盡相同。因此，選擇一種合適的評(píng)估方法測(cè)定免疫位點(diǎn)陽性率表達(dá)的一致性具有重要意義。研究［13］指出，RNAscope 原位雜交法是在原位雜交技術(shù)基礎(chǔ)上檢測(cè)特定基因mRNA 水平的檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)基因的mRNA 能夠替代檢測(cè)蛋白質(zhì)。被檢測(cè)基因的空間改變?yōu)樵\斷與預(yù)后提供了重要信息，尤其是在免疫腫瘤學(xué)中，免疫活性狀態(tài)、細(xì)胞浸潤(rùn)、表型等可能與患者的生存時(shí)間密切相關(guān)。RNAscope 原位雜交法為一種全自動(dòng)檢測(cè)方法，可檢測(cè)多個(gè)樣本的RNA 水平，可定量檢測(cè)特定RNA的表達(dá)，并能夠避免主觀性因素造成的誤差，相較于免疫組化法，RNAscope 原位雜交法具有更高的靈敏度與特異度，但其成本較高［14］。

既往研究［15］結(jié)果顯示，PD-1 和PD-L1 在宮頸癌組織中表達(dá)水平較高。本研究結(jié)果顯示，免疫組化法與RNAscope 原位雜交法檢測(cè)PD-1、PD-L1 表達(dá)一致性良好，考慮單純采用免疫組化法測(cè)定PD-1、PD-L1 表達(dá)存在一定的偏差，因此采用RNAscope原位雜交法檢測(cè)PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表達(dá)水平。后續(xù)可采用免疫組化法聯(lián)合RNAscope 原位雜交法檢測(cè)免疫位點(diǎn)配體。已有研究［16］證實(shí)，RNAscope 原位雜交法適用于檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌組織中PD-1、PD-L1 表達(dá)，且與免疫組化法具有良好的一致性。本研究結(jié)果顯示，PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表達(dá)與患者年齡、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯、TNM 分期、腫瘤直徑無關(guān)。有研究［17］指出，PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表達(dá)與進(jìn)展期胃癌患者腫瘤分化、性別、轉(zhuǎn)移、年齡無關(guān)。國內(nèi)有研究［18］表明，相較于PD-L1mRNA 陰性表達(dá)的胃癌患者，PDL1mRNA 陽性表達(dá)的患者總生存時(shí)間延長(zhǎng)，而PD-1mRNA 表達(dá)與胃癌患者總生存時(shí)間無關(guān)。本研究進(jìn)一步分析PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表達(dá)對(duì)患者總生存時(shí)間的影響，結(jié)果顯示，PD-1mRNA 陽性表達(dá)與PD-1mRNA 陰性表達(dá)的總生存曲線比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PD-L1mRNA 陽性表達(dá)與PDL1mRNA 陰性表達(dá)的總生存曲線比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表達(dá)與宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者總生存時(shí)間無關(guān)。

免疫組化法與RNAscope 原位雜交法檢測(cè)宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中PD-1 和PD-L1 表達(dá)一致性良好，PD-1mRNA、PD-L1mRNA 表達(dá)與患者總生存時(shí)間無關(guān)，后續(xù)可聯(lián)合2 種檢測(cè)方法檢測(cè)宮頸鱗狀細(xì)胞癌特異性免疫位點(diǎn)。