STAT4 rs3024877 單核苷酸多態(tài)性與ANCA 相關(guān)性血管炎的關(guān)系

曹越琦，薛超

（1.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院腎臟病血液凈化科，天津 300211；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，南寧 530007）

原發(fā)性抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（anti-neutrophi cytoplasmic antibodies，ANCA）相關(guān)性血管炎（ANCA associated vasculitis，AAV）是一類可引起多臟器病變的自身免疫性疾病，突出特點(diǎn)為血管壁內(nèi)皮受損及纖維素樣壞死[1]，臨床表現(xiàn)復(fù)雜。隨著醫(yī)療水平的提高，AAV 的確診率呈逐年上升趨勢，但其發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，全基因組關(guān)聯(lián)（GWAS）研究使AAV 的發(fā)病機(jī)制有跡可循，提示遺傳多態(tài)性在AAV的發(fā)生發(fā)展中起到不可或缺的作用，且與ANCA 抗原特異性相關(guān)[2]。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子4（signal transducer and activator of transcription 4，STAT4）基因編碼的蛋白可參與多種免疫細(xì)胞的分化，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，如病原體反應(yīng)及細(xì)胞因子分泌[3-4]。目前國內(nèi)外有文獻(xiàn)報道，STAT4 基因多態(tài)性與哮喘、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫性疾病易感性相關(guān)[5]，但在AAV 中的研究較少。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，STAT4 rs10181656 基因多態(tài)性與AAV 易感性相關(guān)[6]，故推測STAT4 基因可能在AAV 發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用，為發(fā)掘更多與AAV 遺傳易感性相關(guān)的STAT4 基因點(diǎn)位，故本研究選取STAT4 rs3024877 位點(diǎn)進(jìn)行研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2005 年1 月—2018 年12 月于廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院就診的AAV 患者共145 例為AAV 組，入選標(biāo)準(zhǔn)：診斷符合2018 年第二屆Chapel Hill 國際血管炎命名會議[7]；ANCA 陽性；原發(fā)性AAV。對照組為216 名本院同期體檢中心的健康志愿者。排除標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤、感染、其他原因所致的繼發(fā)性血管炎、多臟器衰竭及妊娠狀態(tài)。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（2013-KY-國基-040），全體納入對象均知情同意。

1.2 資料收集 收集患者一般資料：年齡、性別、收縮壓/舒張壓。實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)：血常規(guī)、肝腎功能、補(bǔ)體、免疫球蛋白。腎臟穿刺病理結(jié)果：按2010 年AAV腎臟病理分類法，分為局灶型、新月體型、混合型和硬化型[8]。

1.3 基因組DNA 提取 使用DNA 提取試劑盒[北京天根生化公司]，保存符合吸光度值（A260/A280）為1.7～1.9，質(zhì)量濃度＞25 mg/L 的DNA[Nanodrop 2000]。

1.4 基因分型 基因分型采用MPCR-HTS 法，生工生物工程（上海）有限公司完成[9]。步驟：設(shè)計引物序列，上游引物：5'-GAGGTTTAGGGAAAGGAGGTG AG-3'，下游引物：5'-ATCCTCATAAAACAATCACCACTAAACTCA-3'。合成引物池，采用兩步PCR 法完成STAT4 rs3024877 序列擴(kuò)增和兼容Illumina測序文庫的制備。（1）PCR 體系：DNA 模板2 μL；上游引物池1 μL；下游引物池1 μL；2×PCRReady Mix 15 μL；RNase-free H2O 6 μL。擴(kuò)增：PCR 儀（BIORAD，T100TM）：98℃預(yù)變性5 min；98℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，共8 個循環(huán)；98℃變性30 s，66℃退火30 s，72℃延伸30 s，共25 個循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存，電泳，磁珠[AMPure XP]純化回收PCR 產(chǎn)物。（2）反應(yīng)體系：第一輪PCR 產(chǎn)物2 μL，通用P7 引物1 μL；通用P5 引物1 μL；2×PCR Ready Mix 15 μL；RNase-free H2O 11 μL。擴(kuò)增程序：98℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，共5 個循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存，磁珠[AMPure XP]純化回收PCR 產(chǎn)物，HiSeq XTen 測序儀（Illumina，SanDiego，CA）測序[10]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 SPSS 22.0 用于數(shù)據(jù)分析，Hardy-Weinberg 平衡以P＞0.05 為群體有代表性。計量資料數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的以x±s 表示，兩樣本數(shù)據(jù)比較采用t 檢驗(yàn)，多樣本的組間比較采用方差分析；偏態(tài)分布數(shù)據(jù)以M（P25，P75）表示，比較采用K-W 秩和檢驗(yàn)。計數(shù)資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。Logistic 回歸分析用于評估基因多態(tài)性與腎臟病理的關(guān)系，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者資料 AAV 組中男性59 例，女性86 例。男性患者具有更高的白細(xì)胞和紅細(xì)胞水平，女性患者具有更高的免疫球蛋白M 水平（P＜0.05），見表1。

表1 AAV 患者的資料[±s，M（P25，P75）]Tab 1 The data of AAV patients[±s，M（P25，P75）]

表1 AAV 患者的資料[±s，M（P25，P75）]Tab 1 The data of AAV patients[±s，M（P25，P75）]

注：1 mmHg=0.133 kPa

指標(biāo) 男（n=59） 女（n=86） t/Z P年齡（歲） 53.41±15.15 54.38±14.92 -0.39 0.70收縮壓（mmHg） 134.58±25.14 80.80±15.14 -0.43 0.67舒張壓（mmHg） 135.09±22.75 78.03±11.61 -0.87 0.38血紅蛋白（g/L） 75.60（66.00，113.00） 77.05（61.76，91.50） -1.90 0.06肌酐（μmol/L） 304.00（112.00，727.00）257.50（98.75，443.50） -1.69 0.09白細(xì)胞（×109/L） 8.80（6.29，11.40） 7.35（5.52，9.91） -2.00 0.04紅細(xì)胞（×109/L） 2.90（2.37，3.90） 2.69（2.22，3.32） -1.99 0.04尿素氮（mmol/L） 15.00（5.76，25.79） 12.69（5.92，25.38） -1.25 0.21白蛋白（g/L） 28.93±7.45 30.89±5.88 -1.76 0.08補(bǔ)體C3（g/L） 0.97（0.79，1.12） 0.92（0.81，1.09） -0.94 0.35補(bǔ)體C4（g/L） 0.30（0.24，0.40） 0.29（0.22，0.38） -1.00 0.32免疫球蛋白G（g/L） 13.15±6.65 14.86±4.92 -1.67 0.10免疫球蛋白A（g/L） 2.36（1.71，2.90） 2.50（1.73，3.25） -0.91 0.36免疫球蛋白M（g/L） 0.92（0.59，1.40） 1.15（0.74，1.64） -2.00 0.05

2.2 AAV 組基因型間實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 該位點(diǎn)不同基因型間實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），表2。

表2 AAV 組基因型間實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較[±s，M（P25，P75）]Tab 2 Comparison of laboratory indicators between genotypes in patients[±s，M（P25，P75）]

表2 AAV 組基因型間實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較[±s，M（P25，P75）]Tab 2 Comparison of laboratory indicators between genotypes in patients[±s，M（P25，P75）]

指標(biāo) TT F 或χ2 P血紅蛋白（g/L） 70.45（59.00，94.40） 4.28 0.12肌酐（μmol/L） 340.00（120.00，586.00） 4.15 0.13白細(xì)胞（×109/L） 7.51（5.55，11.09） 0.30 0.86紅細(xì)胞（×109/L） 2.77（2.16，3.59） 1.76 0.42尿素氮（mmol/L） 17.28（8.24，28.63） 5.72 0.06白蛋白（g/L） 31.14±6.97 0.52 0.60補(bǔ)體C3（g/L） 0.91（0.75，0.98） 5.35 0.06補(bǔ)體C4（g/L） 0.25（0.19，0.31） 4.67 0.10免疫球蛋白G（g/L） 13.28（11.19，16.45） 0.28 0.87免疫球蛋白A（g/L） 2.45（1.46，3.32） 0.02 0.99免疫球蛋白M（g/L） 1.07（0.69，1.38） 0.08 0.96 CT 82.00（66.75，99.70）225.00（92.50，436.00）8.11（5.87，11.03）2.82（2.37，3.65）12.26（5.02，20.53）29.78±7.06 0.99（0.84，1.16）0.31（0.24，0.38）14.57（10.29，16.74）2.46（1.70，3.08）1.13（0.70，1.48）CC 72.00（60.60，101.03）333.00（125.00，625.50）8.00（5.79，10.50）2.63（2.27，3.40）15.06（7.82，24.98）29.83±5.60 0.87（0.75，1.09）0.29（0.23，0.42）13.60（9.47，19.92）2.36（1.92，3.15）1.04（0.64，1.62）

2.3 兩組間基因型及等位基因頻率分布 對照組（χ2=0.496，P=0.481）、AAV 組（χ2=0.252，P=0.615）均符合Hardy-Weinberg 平衡，兩組間基因型、等位基因頻率分布無明顯差異（P＞0.05），見表3。

表3 兩組間基因型、等位基因分布[n（%）]Tab 3 Distribution of genotype and allele between two groups[n（%）]

2.4 基因多態(tài)性與AAV 易感性 經(jīng)Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，與CC（野生純和型）對比，TT、CT 基因型與AAV 易感性無關(guān)；以等位基因C 為參照，T 與AAV 易感性無關(guān)（均P＞0.05），見表4。

表4 基因多態(tài)性與AAV 的Logistic 回歸分析Tab 4 Logistic regression analysis of gene polymorphism of AAV

2.5 各病理類型間基因型、等位基因頻率分布 基因型在各病理類型間的分布有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001），等位基因在各病理類型間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003），見表5。

表5 各病理類型間基因型、等位基因頻率分布[n（%）]Tab 5 Distribution of genotype and allele frequencies between pathological types[n（%）]

2.6 等位基因與病理類型相關(guān)性 以等位基因?yàn)樽宰兞?，病理類型為因變量做Logistic 回歸分析，以C 等位基因?yàn)閰⒄?，T 為新月體型的危險因素（P=0.004），T 為混合型的危險因素（P=0.041），見表6。

表6 等位基因與病理類型的Logistic 回歸分析Tab 6 Logistic regression analysis of allele frequencies and pathological types

2.7 基因型與病理類型相關(guān)性 以基因型為自變量，病理類型為因變量做Logistic 回歸分析，以CT+CC 基因型為參照，TT 為新月體型的危險因素（P=0.003），TT 為混合型的危險因素（P=0.009），見表7。

表7 基因型與病理類型的Logistic 回歸分析Tab 7 Logistic regression analysis of genotype frequencies and pathological types

3 討論

STAT4 是STAT 家族中重要一員，在各類炎性過程中均可見其身影，例如病原體反應(yīng)、細(xì)胞因子分泌等[11]。STAT4 定位于細(xì)胞質(zhì)，作為唯一組織限制性表達(dá)的STAT，該基因所編碼的蛋白被確定為DNA 結(jié)合蛋白的主要成分，其mRNA 在單核、淋巴、巨噬細(xì)胞中表達(dá)[12]，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡。多種細(xì)胞因子與細(xì)胞膜結(jié)合后使得STAT4 被磷酸化，而后二聚化的STAT4 易位至細(xì)胞核，被激活的STAT4 具有炎癥作用，參與所有已知的IL-12 的生物學(xué)功能，參與自然殺傷細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和T 輔助細(xì)胞（Th）的功能調(diào)節(jié)和分化，導(dǎo)致Th1/Th2 分化率向Th1 側(cè)轉(zhuǎn)移，激活特定的Th1 分化并抑制Th2 反應(yīng)[13]，而Th1 細(xì)胞功能失調(diào)可誘導(dǎo)多種自身免疫性疾病，其主要表達(dá)于炎癥部位的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞中[14]，由此推測，STAT4 在AAV 發(fā)生、發(fā)展中扮演重要的角色。

本研究雖然未發(fā)現(xiàn)STAT4 rs3024877 基因多態(tài)性與AAV 易感性相關(guān)，但與其他自身免疫性疾病發(fā)病的相關(guān)研究已開展。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，STAT4 rs3024877 基因多態(tài)性與中國女性患者系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）易感性顯著相關(guān)[15]。隨著深入研究發(fā)現(xiàn)，STAT4 基因第14 內(nèi)含子至第17 外顯子區(qū)域（包含rs3024866、rs3024877、rs3024886）具有與SLE 發(fā)病風(fēng)險較高的關(guān)聯(lián)性[16]。在東西方人群中，對比研究人類基因組單倍型圖（haplotype map，Hapmap），提示STAT4 基因位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性分布頻率及不同基因間的連鎖呈現(xiàn)出明顯地域差異，我國北京漢族人群（CHB）的SLE 風(fēng)險SNPs 頻率相較于歐裔（CEU）呈明顯增多的趨勢，如rs3024877 中，CEU 為33.1%，CHB 為44.4%[17]。截然不同的是，我國臺灣人群特發(fā)性膜性腎?。↖MN）中，STAT4 rs3024877 并未發(fā)現(xiàn)與疾病易感性相關(guān)，而STAT4 rs3024908 的基因型分布在AAV 組及對照組間有差異，且AA 基因型是疾病的風(fēng)險因素[18]。

AAV 腎損害較為常見，據(jù)既往病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞胞外陷阱大量附著于AAV 患者的腎小球及間質(zhì)中，可反向參與ANCA 的產(chǎn)生，與組蛋白DNA、中性粒細(xì)胞顆粒蛋白等結(jié)合，介導(dǎo)靶器官的血管損傷，相較于其他臟器，腎臟自身可分泌炎癥因子、腫瘤壞死因子等，這些物質(zhì)或?yàn)槟I臟受損易感性的病理基礎(chǔ)，導(dǎo)致腎臟損害具有特殊性[19]。免疫熒光顯微鏡下以少免疫復(fù)合物沉積為特征，光鏡下多見壞死及新月體腎小球腎炎[20]，患者常常表現(xiàn)為血尿（包括肉眼血尿）、蛋白尿甚至導(dǎo)致不可逆的腎功能衰竭。局灶型預(yù)后相對較好，新月體型常常呈現(xiàn)為腎功能急進(jìn)性下降，但積極治療后腎功能可恢復(fù)，混合型病情進(jìn)展一般介于上述兩者之間，而硬化型預(yù)后最差，進(jìn)展為終末期幾率較前述3 種類型大，確診后第一年內(nèi)死亡的風(fēng)險也更高。本研究發(fā)現(xiàn)，位點(diǎn)基因型及等位基因在4 種不同病理類型間分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，相較于等位基因C，突變等位基因T 為新月體型、混合型的危險因素，并未發(fā)現(xiàn)與硬化型存在明顯關(guān)聯(lián)。隱性模型下，突變純合基因型TT 為新月體型、混合型的危險因素。上述結(jié)果提示，或許基因多態(tài)性會影響血管炎發(fā)生發(fā)展過程，進(jìn)而在腎活檢中表現(xiàn)為不同的病理類型，患者臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，針對個體化治療有較大獲益，這也為臨床治療提供了新的思路。

基于上述，中國人群中STAT4 rs3024877 基因多態(tài)性與AAV 易感性無關(guān)，與腎損害相關(guān)病理類型存在關(guān)聯(lián)，對于臨床治療有一定的指導(dǎo)意義，但由于本實(shí)驗(yàn)樣本量較小，后續(xù)需擴(kuò)大樣本量以進(jìn)行更深入的研究。鑒于STAT4 在炎癥和自身免疫中的不可或缺性，該基因其他位點(diǎn)或許有望成為AAV的有效治療靶點(diǎn)，期待更多學(xué)者擴(kuò)大研究人群及樣本量，來闡明發(fā)病關(guān)鍵因子，提高AAV 診治水平。