IL-17A 對卵巢癌進(jìn)展的影響及機(jī)制研究

鄭小燕，郁春艷，劉俊汝，劉子璇，陳思琦，鄧為民

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，國家教育部免疫微環(huán)境與疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300070）

卵巢癌（ovarian cancer，OvCa）是一種腹腔內(nèi)腫瘤，具有向網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移的明顯傾向性，臨床數(shù)據(jù)顯示有80%的OvCa 患者存在網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移[1]。脂肪細(xì)胞是OvCa 轉(zhuǎn)移至網(wǎng)膜的主要介質(zhì)，其分泌脂肪因子，如白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-8、單核細(xì)胞趨化因子（MCP）1，促進(jìn)腫瘤優(yōu)先歸巢至網(wǎng)膜；隨后，脂肪細(xì)胞為腫瘤提供脂肪酸（FA）促進(jìn)腫瘤快速增殖生長[1-3]。幾類脂肪酸受體參與腫瘤細(xì)胞對FA 的攝取轉(zhuǎn)運(yùn)，在FA 易位至細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)時(shí)，脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acidbinding protein，F(xiàn)ABPs）與FA 結(jié)合并將其運(yùn)送至細(xì)胞器進(jìn)行代謝[4]。FABP4 是FABPs 家族最豐富成員之一，多項(xiàng)研究顯示FABP4 參與OvCa 網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移，CRISPR 介導(dǎo)的FABP4 敲除或使用小分子抑制劑（BMS309403）可顯著減輕小鼠腫瘤負(fù)擔(dān)，并增強(qiáng)對鉑類治療的敏感性[3，5-6]。目前靶向FABP4 已成為延緩OvCa 進(jìn)展的一個(gè)策略，但是影響FABP4 表達(dá)的因素還需進(jìn)一步明確。

炎性微環(huán)境是腫瘤微環(huán)境的一個(gè)重要組成部分。Mukherjee 等[4]報(bào)道IL 誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)分解，釋放FA。IL-17A 屬于多效性炎性因子，是IL-17 家族研究最多且最具代表性的細(xì)胞因子，其主要通過IL-17A 受體（IL-17RA）發(fā)揮作用[7]。多項(xiàng)研究顯示IL-17A 在腫瘤中表達(dá)上調(diào)，通過促進(jìn)血管生成[8]；提高調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）免疫抑制活性加速腫瘤進(jìn)展[9-10]。Bilska 等[11]研究顯示在OvCa 患者血漿和腹膜液中IL-17A 水平顯著高于良性腫瘤組及對照組；此外，IL-17A 在脂肪細(xì)胞中也扮演重要角色[12]，基于此本課題組在OvCa 中探討IL-17A 是否影響FABP4 表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)OvCa 進(jìn)展。前期的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明外源性IL-17A 可通過其受體直接作用于卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780 和OVCAR3，通過激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（SATA）3 信號(hào)促進(jìn)FABP4 表達(dá)。在體外研究的基礎(chǔ)上，本文旨在通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床標(biāo)本探討IL-17A 對OvCa 進(jìn)展的影響并驗(yàn)證其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠卵巢上皮乳頭狀漿液性腺癌細(xì)胞系ID8 由南開大學(xué)李魯遠(yuǎn)教授惠贈(zèng)；C57BL/6 遺傳背景的野生型（WT）小鼠購自中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌性，6～8 周齡，體重18～20 g；C57BL/6遺傳背景的IL-17A 缺陷型（IL-17A-/-）小鼠由日本東京理科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所Yoichiro Iwakura 教授惠贈(zèng)，雌性，6～8 周齡，體重18～20 g；DMEM培養(yǎng)基購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；胎牛血清（FBS）購自GIBCO 公司；IL-17A（DF6127）、FABP4（DF6035）、STAT3（AF6294）、磷酸化STAT3（p-STAT3）（Tyr705，AF3293）、GAPDH（AF7021）抗體購自Affinity 公司，以上抗體人鼠通用，用做后續(xù)的Western 印跡和免疫組化實(shí)驗(yàn)；30 例OvCa 患者的病理組織石蠟切片標(biāo)本來自天津市中心婦產(chǎn)醫(yī)院，同時(shí)收集患者的臨床病理資料。這些標(biāo)本及病理資料的使用均已獲得天津市中心婦產(chǎn)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) ID8 細(xì)胞用含有10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，每1～2 天更換培養(yǎng)液并消化傳代，培養(yǎng)箱條件為37℃，CO2濃度為5%。待ID8 細(xì)胞處于對數(shù)生長期，消化處理進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 腹腔注射氯胺酮麻醉小鼠，待角膜反射消失后將其固定，如Connolly 等[13]報(bào)道所述，將ID8 細(xì)胞以1×106/20 μL PBS/只的劑量原位注射于6～8 周雌性C57BL/6 遺傳背景的WT 小鼠和IL-17A-/-小鼠卵巢囊內(nèi)（每組6 只），通過觀察卵巢囊膨脹來確定注射是否成功。每日測量小鼠體重觀察小鼠狀態(tài)。8 周后頸椎脫臼處死小鼠，打開腹腔觀察小鼠卵巢囊內(nèi)成瘤和腹腔轉(zhuǎn)移情況，并使用佳能90D 單反相機(jī)進(jìn)行拍照。

1.2.3 Western 印跡 用RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制劑）充分裂解小鼠腫瘤組織提取總蛋白，BCA 測定蛋白含量。將蛋白等量上樣于10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳，PVDF 轉(zhuǎn)膜，3%的牛血清白蛋白（BSA）封閉非特異性抗原后，添加一抗GAPDH（1∶1 000），STAT3（1∶1 000），p-STAT3（1∶1 000），F(xiàn)ABP4（1∶1 000），4℃低速震蕩孵育過夜，次日，加入二抗室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光成像儀掃描條帶，Image J 軟件分析蛋白條帶。以GAPDH 為內(nèi)參，目的條帶與內(nèi)參條帶比值表示目的蛋白相對表達(dá)量。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片標(biāo)本厚度為5 μm。切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、脫水后，將其置于檸檬酸鈉緩沖液中微波爐煮沸進(jìn)行抗原修復(fù)，恢復(fù)至室溫后去除內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉，滴加一抗IL-17A（1∶200），F(xiàn)ABP4（1∶200）于4℃孵育過夜。次日，進(jìn)行二抗孵育，DAB 顯色，復(fù)染，脫水透明封片。實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：采用Mattern 積分法對染色結(jié)果進(jìn)行評分，每個(gè)標(biāo)本在顯微鏡（400×）下隨機(jī)選擇10 個(gè)視野，結(jié)合陽性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度綜合判斷。染色強(qiáng)度分4 級(jí)：無陽性著色0 分；淺棕褐色1分；棕褐色2 分；深棕褐色3 分。陽性細(xì)胞數(shù)占視野中總細(xì)胞數(shù)的百分比分4 級(jí)：無陽性細(xì)胞記0 分；1%～25%記1 分；26%～50% 記2 分；50%以上記3分。染色強(qiáng)度評分加陽性細(xì)胞百分比評分為最終得分。得分＜3 分為陰性表達(dá)（-），≥3 分為陽性表達(dá)（+）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 9 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并繪圖。兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，用四格表Fisher's 精確檢驗(yàn)分析IL-17A、FABP4 表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-17A 促進(jìn)小鼠OvCa 原位成瘤和腹腔轉(zhuǎn)移 由圖1 可知，WT 小鼠造模部位卵巢明顯腫大，與周圍組織黏連，其表面可見若干瘤結(jié)節(jié)，分界不清（圖1Aa）；腫瘤廣泛分布于腹腔，在網(wǎng)膜、腸系膜、腸管外壁和腹壁可見明顯瘤結(jié)節(jié)[圖1Ab（a）～（d）所示]。IL-17A-/-小鼠造模部位卵巢腫大，與周圍組織無黏連，表面瘤結(jié)節(jié)較少（圖1Ac）。與WT 小鼠相比，IL-17A-/-小鼠腹腔瘤結(jié)節(jié)顯著減少（圖1B，t=5.132，P＜0.05）。

圖1 IL-17A 促進(jìn)小鼠OvCa 原位成瘤和腹腔轉(zhuǎn)移Fig 1 IL-17A promoted orthotopic tumorigenesis and intraperitoneal metastasis of OvCa in mice

2.2 IL-17A 通過激活STAT3信號(hào)促進(jìn)FABP4表達(dá)由圖2 可知，與WT 小鼠相比，IL-17A-/-小鼠腫瘤組織中FABP4、p-STAT3 蛋白表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2B，t=11.347、8.180，均P＜0.01）；然而，兩組之間STAT3 表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖2B，t=0.110，P＞0.05）。

圖2 小鼠腫瘤組織中FABP4、p-STAT3、STAT3 蛋白表達(dá)Fig 2 Expression of FABP4，p-STAT3 and STAT3 proteins in mouse tumor tissue

2.3 IL-17A 在OvCa 患者中的表達(dá) 收集30 例OvCa 患者石蠟切片標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。有15 例患者（50%）IL-17A 呈陽性表達(dá)，13 例患者（43.3%）FABP4 呈陽性表達(dá)，染色結(jié)果如圖3 所示。在IL-17A 陽性組中FABP4 陽性表達(dá)率為66.7%，在IL-17A 陰性組中FABP4 陽性表達(dá)率為20%，IL-17A 表達(dá)與FABP4 表達(dá)具有一定相關(guān)性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 IL-17A 與FABP4 的相關(guān)分析Tab 1 Correlation analysis between IL-17A and FABP4

圖3 人卵巢癌組織中IL-17A、FABP4 表達(dá)情況（400×）Fig 3 Expression of IL-17A and FABP4 in human ovarian cancer tissues（400×）

使用Fisher's 精確檢驗(yàn)分析IL-17A、FABP4 表達(dá)與OvCa 患者臨床病理資料的關(guān)系。結(jié)果顯示IL-17A、FABP4 表達(dá)與患者年齡無關(guān)（均P＞0.05），與癌癥FIGO 分期、轉(zhuǎn)移有明顯關(guān)系（均P＜0.05），見表2、3。

表2 IL-17A 與臨床病理資料之間的關(guān)系Tab 2 Relationship between IL-17A expression and clinicopathological data

表3 FABP4 與臨床病理資料之間的關(guān)系Tab 3 Relationship between FABP4 expression and clinicopathological data

3 討論

OvCa 是最致命的婦科惡性腫瘤，其致死率高、預(yù)后較差[14]。由于該疾病隱匿，大多數(shù)患者在晚期確診，表現(xiàn)為腹腔轉(zhuǎn)移和腹水形成[15]。目前，手術(shù)加鉑類/紫杉類為主的化療是OvCa 患者主要治療方案，但由于化療耐藥的出現(xiàn)，患者5 年生存率并沒有顯著提高[16-17]。

FABP4 是重要的脂質(zhì)伴侶蛋白，通過結(jié)合和重新分配脂肪酸來協(xié)調(diào)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)反應(yīng)[3]。FABP4 主要在脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)，參與糖尿病胰島素抵抗、炎癥以及血管生成[18-20]。在前列腺癌和OvCa中，F(xiàn)ABP4 是脂肪細(xì)胞參與癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵介質(zhì)[5]。研究顯示FABP4 在OvCa 中高表達(dá)，通過攝取游離脂肪酸為癌細(xì)胞提供能量，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移[3，5]。FABP4 已成為治療優(yōu)先轉(zhuǎn)移至脂肪組織的腹腔播散性腫瘤（如OvCa、胃癌和結(jié)腸癌）的極好靶點(diǎn)[1]。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床標(biāo)本證實(shí)IL-17A可通過激活STAT3 信號(hào)通路上調(diào)FABP4 表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)OvCa 生長轉(zhuǎn)移。

本課題組前期體外結(jié)果顯示外源性IL-17A 可通過其受體直接作用于卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780 和OVCAR3，通過激活STAT3 信號(hào)促進(jìn)FABP4 表達(dá)。棕櫚酸（PA）是一種常用的長鏈脂肪酸，充當(dāng)外源脂肪酸來源，體外研究表明在PA、IL-17A 存在的情況下，腫瘤細(xì)胞通過IL-17A/IL-17RA/p-STAT3/FABP4 軸增強(qiáng)對PA 的攝取，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

為了進(jìn)一步探討IL-17A 對OvCa 生長轉(zhuǎn)移的影響，本研究以相同基因背景來源的IL-17A-/-小鼠和WT 小鼠為研究對象建立原位種植瘤模型，檢測IL-17A 對OvCa 原位成瘤和腹腔轉(zhuǎn)移的影響，結(jié)果顯示IL-17A 顯著促進(jìn)小鼠OvCa 原位成瘤和腹腔轉(zhuǎn)移。與WT 小鼠相比，IL-17A-/-小鼠腫瘤組織中p-STAT3、FABP4 蛋白表達(dá)顯著降低，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)IL-17A 可通過IL-17A/IL-17RA/p-STAT3/FABP4 軸促進(jìn)OvCa 進(jìn)展。OvCa 患者臨床病理標(biāo)本顯示IL-17A、FABP4 表達(dá)與癌癥FIGO 分期、轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且兩者表達(dá)也存在一定相關(guān)性。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床標(biāo)本證實(shí)IL-17A 可通過激活STAT3 信號(hào)上調(diào)FABP4 表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)OvCa生長轉(zhuǎn)移。IL-17A/IL-17RA/p-STAT3/FABP4 軸可能只是IL-17A 促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的原因之一，其他方面的影響也不容忽視。Coffelt 等[21]報(bào)道，IL-17A 可促進(jìn)中性粒細(xì)胞擴(kuò)增極化，進(jìn)而抑制CD8+T 細(xì)胞活化，促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移。Li 等[22]報(bào)道IL-17A 可通過激活酪氨酸蛋白激酶（JAK）、STAT 信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移。雖然IL-17A 可通過多種機(jī)制發(fā)揮促腫瘤作用，但本研究證明IL-17A 可通過IL-17A/IL-17RA/p-STAT3/FABP4 軸促進(jìn)OvCa 生長轉(zhuǎn)移，這至少是一個(gè)影響腫瘤生長的重要機(jī)制。

綜上所述，本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床標(biāo)本證實(shí)IL-17A 可通過IL-17A/IL-17RA/p-STAT3/FABP4 軸促進(jìn)OvCa 生長轉(zhuǎn)移，為臨床干預(yù)OvCa提供了新的思路和策略。