基于生物信息學(xué)分析TGFβ1在肝臟肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其預(yù)后價(jià)值

鄭凱,袁仕國,歐陽怡佩,黃世穩(wěn)

(1 .右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,廣西 百色 533000;2. 海南省中醫(yī)院,海南 海口 570203)

肝臟肝細(xì)胞癌(liver hepatocellular carcinoma,LIHC)占原發(fā)性肝癌的70%～90%,是全球癌癥死亡的三大原因[1]。其發(fā)病機(jī)制尚不明確,臨床觀察顯示其為肝臟長期慢性肝病的終末期[2]。研究表明[3-4],肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制可能是肝癌診療與預(yù)后評(píng)估的瓶頸。LIHC嚴(yán)重威脅患者的健康,雖然手術(shù)治療已取得較好的成效,但預(yù)后效果仍很差[2]。因此,LIHC的治療仍為目前全世界面臨的難題。研究發(fā)現(xiàn)LIHC的相關(guān)基因?qū)IHC的早期診斷及預(yù)后十分重要。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGFβ1)在機(jī)體大多數(shù)細(xì)胞中均可表達(dá),廣泛參與機(jī)體生物學(xué)進(jìn)程,是在胚胎發(fā)育、正常生長發(fā)育、免疫調(diào)控和維持機(jī)體平衡中起主導(dǎo)作用的多功能蛋白,控制著多種細(xì)胞類型的增殖、分化、凋亡和其他功能[5]。許多細(xì)胞合成TGFβ1,并有專門的受體,它積極或消極地調(diào)節(jié)許多其他生長因子[6]。TGFβ1在包括肝癌在內(nèi)的肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展中同樣發(fā)揮主導(dǎo)作用[7-8]。因此,了解TGFβ1及其信號(hào)通路在肝臟疾病中的具體作用機(jī)制,對(duì)肝臟疾病的進(jìn)一步研究及治療具有重大臨床意義。近年來TGFβ1參與LIHC并指示其預(yù)后價(jià)值的研究報(bào)道少見,故本研究擬通過多個(gè)數(shù)據(jù)庫對(duì)TGFβ1基因進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘,分析TGFβ1 在LIHC中的表達(dá)及其預(yù)后價(jià)值,為臨床診斷和治療提供有效的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究方法

1.1.1分析TGFβ1在正常組織和泛癌中的表達(dá)差異 利用數(shù)據(jù)庫TIMER 2.0的Cancer Explaoration 模塊中的Gene DE界面進(jìn)行泛癌和正常組織中TGFβ1中的表達(dá)差異情況檢索,獲取在泛癌組織和正常組織中的表達(dá)情況的方框圖[9]。

1.1.2分析TGFβ1在LIHC中的差異表達(dá) 使用UALCAN數(shù)據(jù)庫中的TCGA模塊進(jìn)行TCGA Gene分析TGFβ1在LIHC和正常組織中的表達(dá)差異情況。輸入TGFβ1基因名并在TCGA窗口選擇Liver hepatocellular carcinoma,選取Expression獲取TGFβ在正常組織和LIHC中的表達(dá)差異,并就患者年齡、性別、腫瘤分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移情況、癌癥分期、T53突變狀態(tài)和組織學(xué)亞型分別分析TGFβ1在LIHC表達(dá)中的情況,分析TGFβ1 在不同臨床病理特征中的差異表達(dá)[10-12]。

1.1.3分析TGFβ1與LIHC預(yù)后的關(guān)系 利用數(shù)據(jù)庫Kaplan-Meier Plotter中mRNA系類組塊中的Liver cancer模塊,在Survival選項(xiàng)選取OS和RSF選項(xiàng)分析TGFβ1對(duì)LIHC患者總生存期的影響及無病生存期的影響,并繪制TGFβ1表達(dá)與生存關(guān)系KM的生存曲線[11-12]。

1.1.4構(gòu)建TGFβ1蛋白互作網(wǎng)絡(luò)以及進(jìn)行功能富集分析 在數(shù)據(jù)庫STRING中Protein Name輸入TGFβ1,Organism選擇Homosapiens進(jìn)行檢索,具體參數(shù)設(shè)定為:置信度為0.7,首級(jí)及次級(jí)互動(dòng)蛋白數(shù)量分別選擇不超過20和不超過10,繪制蛋白互作圖并篩選出與TGFβ1基因的密切相關(guān)的基因[13]。將上述與TGFβ1緊密的互作基因輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫,以FDR<0.05顯著性作為富集標(biāo)注將進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路功能富集及分析[14]。

1.2統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用數(shù)據(jù)庫默認(rèn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法進(jìn)行:TGFβ1在泛癌組織和正常組織中的表達(dá)水平差異,采用Wilcoxon檢驗(yàn)(TIMER 2.0);TGFβ1在LIHC與正常組織中的表達(dá)水平比較,采用單因素方差分析(UALCAN數(shù)據(jù)庫);TGFβ1高表達(dá)與生存率的比較,采用Logrank檢驗(yàn)(TIMER 2.0)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1TGFβ1在泛癌癥中的表達(dá)情況 結(jié)果顯示,TGFβ1在LIHC等多種癌癥組織中相較于正常組織都有較高的表達(dá),見圖1。

注:與正常肝組織比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.2TGFβ1在LIHC中的表達(dá)情況 TGFβ1在正常肝組織中的表達(dá)顯著低于LIHC組織(P<0.001)。見圖2。

2.3TGFβ1表達(dá)水平與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 在UALCAN數(shù)據(jù)庫中選擇性別、年齡、體重、腫瘤分期、淋巴轉(zhuǎn)移、個(gè)體癌癥分期、T53突變狀態(tài)及組織學(xué)亞型等方面進(jìn)行相關(guān)性分析顯示,TGFβ1在上述不同臨床病理特征分期中存在差異表達(dá)。UALCAN結(jié)果顯示,TGFβ1表達(dá)水平與患者的上述臨床病理學(xué)特征有關(guān),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

2.4TGFβ1對(duì)LIHC患者生存期的影響結(jié)果 TGFβ1的表達(dá)與LIHC患者的總體生存率有關(guān)(P<0.05),總體上減短患者的總生存期。而對(duì)患者無病生存期并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見圖4。

注:TGFβ1在LIHC組織中與正常肝組織比較,***P<0.001。

注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

注:A為總生存期,B為無病生存期。

2.5蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與功能富集分析結(jié)果 結(jié)果發(fā)現(xiàn)30個(gè)蛋白與TGFβ1基因存在緊密互作關(guān)系(見圖5)。TGFβ1的互作蛋白被用于GO和KEGG功能富集分析(見圖6),其中KEGG富集的通路主要包括:癌癥相關(guān)通路(hsa05200)、癌癥中的蛋白聚糖(hsa05205)、TGFβ1信號(hào)通路(hsa04350)、轉(zhuǎn)化生長因子受體β信號(hào)通路(GO:0007179)、FoxO信號(hào)通路(hsa04068)、AGE-RAGE信號(hào)通路(hsa04933)、乙型肝炎(hsa05161)、人類t細(xì)胞白血病病毒1感染(hsa05166)等信號(hào)通路。GO富集的通路包括:2個(gè)分子功能、5個(gè)細(xì)胞組分和7個(gè)生物學(xué)過程,其中分子功能包括:蛋白結(jié)合(GO:0005515)和同源蛋白結(jié)合(GO:0042802)。細(xì)胞組分包括:胞核(GO:0005634)、細(xì)胞表面(GO:0000086)、質(zhì)膜(GO:0005886)及細(xì)胞內(nèi)外區(qū)域(GO:0005615,GO:0005576)。生物學(xué)過程包括:參與TGβ1受體信號(hào)道路(GO:007179)、細(xì)胞增殖的負(fù)性調(diào)控(GO:0008285)、老化(GO:0007568)、轉(zhuǎn)錄正調(diào)控及DNA模板化(GO:0045893)、傷口愈合(GO:0042060)、正向調(diào)控RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控(GO:0045944)、缺氧反應(yīng)(GO:0001666)。

圖5 與TGFβ1基因存在緊密互作關(guān)系的蛋白

注:BP.生物學(xué)功能,CC.細(xì)胞組分,MF.分子功能,KEGG.信號(hào)通路。

3 討論

研究表明,LIHC的發(fā)生是多因素、多機(jī)制的調(diào)控過程。其中,肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化在肝纖維化發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15],對(duì)于慢性肝病的進(jìn)程以及發(fā)展為肝硬化和LIHC等終末期肝病的進(jìn)程的調(diào)節(jié)非常重要[16],而TGFβ1是活化HSC的重要蛋白因子,在急慢性肝損傷發(fā)生的早期,肝臟的固有細(xì)胞即肝細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞(kupffe cell)及炎癥反應(yīng)招募的免疫細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等分泌TGFβ1。TGFβ1參與HSC活化發(fā)生的多條細(xì)胞通路,引起早期肝纖維化的發(fā)生[17]。LIHC的晚期,TGFβ1在加速肝纖維化的發(fā)生、促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、肝癌干細(xì)胞的擴(kuò)增、血管的異常增生等方面發(fā)揮促進(jìn)作用[18-19]。同時(shí),TGFβ1可抑制免疫應(yīng)答,為肝癌細(xì)胞的增長創(chuàng)造腫瘤微環(huán)境[20];TGFβ1還可以增強(qiáng)水解蛋白與細(xì)胞黏附分子結(jié)合的活性,為肝癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件[21]?；谏鲜錾磉^程,TGFβ1對(duì)于LIHC的分子靶向治療具有重要的價(jià)值,由此,TGFβ1具有重要的研究價(jià)值。本研究結(jié)果顯示,TGFβ1在LIHC中的表達(dá)水平與正常組織相比較高。且高表達(dá)的TGFβ1與性別、年齡、體重、腫瘤分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移情況、個(gè)體癌癥分期、組織學(xué)亞型及T53突變狀態(tài)等都有關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)Smad2、Smad3、TGFβR1和TGFβR2等為TGFβ1的緊密互作蛋白,經(jīng)功能富集分析,發(fā)現(xiàn)它們主要參與核酸轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞增殖、老化、凋亡過程,是細(xì)胞核、質(zhì)膜的組成成分,而且在癌癥相關(guān)通路、癌癥中的蛋白聚糖、TGFβ1信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、AGE-RAGE等信號(hào)通路起作用。多種癌癥的發(fā)生都與TGFβ1信號(hào)通路有關(guān),TGFβ1信號(hào)通路已被證明與肝細(xì)胞癌[22]、結(jié)直腸癌[23-24]、非小細(xì)胞肺癌[25]的發(fā)病機(jī)制有關(guān),還參與了慢性腎癌的發(fā)生發(fā)展[26]。FoxO信號(hào)通路是主要的神經(jīng)活動(dòng)信號(hào)通路,同時(shí)也是細(xì)胞癌變、癌癥發(fā)生發(fā)展的重要通路,其促進(jìn)了前列腺癌的進(jìn)展[27]。而且TGFβ1的相關(guān)基因MMP2被發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)直腸癌淋巴轉(zhuǎn)移的發(fā)生[28],EP300被報(bào)道通過FBXW7-NOTCH-CCL2/CSF1軸改變腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞極化,促進(jìn)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的腫瘤進(jìn)展[29]。由此可見,與TGFβ1緊密互作的這些蛋白大都與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

綜上所述,TGFβ1基因可能是導(dǎo)致LIHC患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。另外,SMRF2和TIMP1等多個(gè)基因與TGFβ1緊密相關(guān),本研究可為進(jìn)一步探討LIHC發(fā)病機(jī)制以及預(yù)后價(jià)值提供一定的理論依據(jù)。