PNA與引物的連接方法以及探討潛在的價值

農(nóng)琛,劉德文,賴鳳明,王太重,唐玉蓮

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院,廣西 百色 533000;2. 右江民族醫(yī)學(xué)院檢驗學(xué)院,廣西 百色 533000)

肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)是一種人工合成的類似于 DNA 或 RNA的聚合物[1-2]。由于PNA不帶負(fù)電荷,與核酸間不存在靜電斥力,因而結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性都大有提高。同樣的,PNA既不屬于多肽,也不屬于核酸,所以不易被蛋白酶或核酸酶水解[3]。許多研究人員利用PNA的這些特性,成功地篩選出目的基因,比如SATO Y等[4]基于PNA開發(fā)了用于檢測甲型流感RNA啟動子區(qū)域的熒光探針。同年,PETITI J等[5]基于PNA-PCR鉗夾效應(yīng)開發(fā)了一種新型、快速且廉價的檢測SF3B1基因突變方法,并且該方法通過了高通量測序技術(shù)的驗證。無獨有偶,KAWASAKI A等[6]使用PNA鉗夾選擇性地與植物基因組的靶區(qū)結(jié)合,并在PCR(polymerase chain reaction,PCR)過程中抑制其擴增,成功地提高了植物組織中細(xì)菌的16S rDNA的擴增產(chǎn)物。由此可見,PNA無論是用于核酸的擴增還是抑制,都得到了許多科學(xué)家的認(rèn)可。胎兒遺傳疾病的非損傷性產(chǎn)前診斷(non-invasive prenatal testing,NIPT)在臨床遺傳學(xué)中起著至關(guān)重要的作用[7]。因此,尋找非侵入性產(chǎn)前診斷的方法一直備受關(guān)注[8-10]。LO Y M等[11]從母體血漿中成功提取到胎兒游離DNA(cell-free fetal DNA,cffDNA)后,為NIPT開辟了新的可能。據(jù)相關(guān)研究表明,cffDNA在妊娠第4周就可檢出,占總游離DNA的10%～20%。孕早期和孕晚期的cffDNA濃度分別為25.4和292.2 基因組當(dāng)量每毫升(genome equivalents/ml,GE/ml)[12]。cffDNA的長度比母源DNA短許多,99%的cffDNA<313 bp,而母源DNA則>1 kb[13-14]。自2011年以后,基于cffDNA的非侵入性產(chǎn)前檢測已經(jīng)商業(yè)化,并完成了從傳統(tǒng)的侵入性篩查向現(xiàn)代化技術(shù)無創(chuàng)診斷的轉(zhuǎn)變[15]。然而,由于儀器成本和檢測范圍存在差異等問題,想要引入臨床實踐仍具有不小的挑戰(zhàn)[16-17]。

在這里,本研究報道了一種新型cffDNA富集的方法,理論上在混有DNA長短片段的溶液中,該方法可以選擇性地擴增短片段(cffDNA)而不擴增長片段(母源DNA)。支撐該方法的理論依據(jù)主要有三點,第一點是在孕婦外周血中,cffDNA與母源DNA大小不同[14];第二點則是在PCR反應(yīng)中,PNA會優(yōu)先于引物與DNA模板結(jié)合,且不會受各種酶的影響[18-20];第三點,點擊化學(xué)具有可選擇性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性強、易純化和操作等優(yōu)點[21-22]?；谝陨先c,本研究設(shè)計兩對引物,其一用于擴增SRY基因上長度小于313 bp的DNA短片段,模擬cffDNA。其二用于擴增部分包含上述短片段的DNA長片段,模擬母源DNA。將DNA長短片段混合后構(gòu)建SRY基因模型。最后,通過SRY基因模型中展示PNA-引物富集cffDNA的潛力。

1 材料和方法

1.1化學(xué)藥品和試劑 無水硫酸銅(CuSO4)、(R)-2-((S)-1,2-二羥基乙基)-4-羥基-5-氧代-2,5-二氫呋喃-3-醇鈉、乙二胺四乙酸四鈉、三(3-羥基丙基三唑基甲基)胺(THPTA)、乙醇、醋酸三乙胺均從上海比得醫(yī)藥科技股份有限公司購買;PBS緩沖液0.01 M(pH=7.3±0.1)、無酶無菌水均從北京索萊寶科技有限公司購買;引物由Primer 5.0 軟件設(shè)計完成后外送上海生工生物工程有限公司合成;PNA從杭州泰禾生物技術(shù)有限公司購買。引物序列以及PNA序列如表1所示,部分相對位置示意圖如圖1所示。

表1 PNA-引物反應(yīng)體系中涉及到的引物以及PNA相關(guān)信息

注:S表示擴增SRY基因上的DNA短片段,長度為134 bp;L表示擴增部分包含SRY基因的DNA長片段,長度為1088 bp;S-F表示擴增S和L通用的上游引物;S-R為擴增S的下游引物;L-R為擴增L的下游引物;紅色條帶表示PNA結(jié)合位點。

1.2PNA-引物的連接步驟和層析條件 將50 nmol的PNA(含疊氮)和50 nmol的下游引物(S-R,含炔基)溶解在含有10 nmol NaCl的10 mL PBS緩沖溶液(10 mM)中,然后將以上溶液加入到溶解有THPTA(0.5 μmol)、CuSO4(0.5 μmol)、抗壞血酸鈉(2.5 μmol)的PBS緩沖溶液(10 mM)中,總體積為20 mL。在室溫下反應(yīng)3 h后,往以上混合物中加入2 mL的NH4OAc(5M)和50 mL乙醇,過濾后得到的固體粉末使用SCIENTZ-10ND多歧管壓蓋型冷凍干燥機(SCIENTZ)在-80 ℃冷凍干燥120 min。冷凍干燥后的固體溶于無菌無酶水,使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis,Urea-PAGE)進行脫鹽,同時將疑似連接產(chǎn)物的片段進行回收。粗產(chǎn)物在通過Supfex HP-C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm,Zafex)進一步純化,在使用Agilent 1100 series液相色譜儀(Agilent)分析過程中,流動相A為0.1 M醋酸三乙胺溶液;流動相B為80%的0.1 M醋酸三乙胺和20%的乙腈。該連接反應(yīng)的化學(xué)方程式如圖2所示。

圖2 PNA和引物基于點擊化學(xué)反應(yīng)連接的方程式

1.3PNA-引物的表征 為了明確PNA-引物是否合成成功,本研究通過質(zhì)譜分析對合成的PNA-引物進行表征。利用 Thermo ScientificTMLTQ XLTM線性離子阱質(zhì)譜儀對已分離純化后的PNA-引物進行鑒定,加樣條件為電噴霧電離源 (ESI) ,采集模式:電噴霧正離子或負(fù)離子模式,霧化氣:氮氣,離子源電壓為4500 V,碰撞能量擴增(CES)為15 V,樣品進樣流速為5 μL/min。質(zhì)譜掃描范圍為M/Z 500～20 000。使用Peakview 1.2軟件(美國AB SCIEX公司)對獲得的結(jié)果數(shù)據(jù)進行可視化分析。

1.4SRY基因模型的構(gòu)建 本次實驗已經(jīng)獲得右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意(YYZY-LL-2022-89),以下實驗均嚴(yán)格按照說明書進行。當(dāng)女性懷有男性胎兒時,血漿中的SRY基因只來源于胎兒,因此以SRY基因代表cffDNA對PNA-引物的功能進行初步探討。具體方法:取5名未妊娠的健康女性外周血,離心后收集血漿貯存于-80 ℃?zhèn)溆?。?名健康男性的外周血進行核酸提取(Ezup Column Blood Genomic DNA Purification Kit,上海生工生物工程有限公司),使用兩對引物分別擴增SRY基因的DNA短片段和部分包含SRY基因的DNA長片段(Taq PCR Master Mix,上海生工生物工程有限公司)。經(jīng)過0.1%的瓊脂糖電泳后(Agarose,西班牙Biowest公司),采用切膠回收試劑盒實現(xiàn)DNA長片段和短片段的回收(GeneJET Gel Extraction Kit,賽默飛世爾科技公司),成功回收后再取5 μL DNA溶液進行電泳鑒定。最后使用女性血漿將DNA短片段和長片段調(diào)整至相同的摩爾質(zhì)量并混勻,模擬孕婦外周血中cffDNA具有與母體DNA相同的基因片段環(huán)境,構(gòu)建SRY基因模型,記為Y0溶液。

1.5分析方法的驗證 在確保PNA與引物成功連接后,為了防止過量的回收DNA產(chǎn)物抑制PCR反應(yīng)[23],同時更好地體現(xiàn)出PNA的阻斷作用,本研究對回收的DNA片段進行50倍的等比倍比稀釋,通過比較PCR的結(jié)果進行初步驗證。PCR反應(yīng)體系的配置為:Taq PCR Master Mix取25 μL,2 μL的上游引物(S-F),2 μL的PNA-引物,1 μL的Y0溶液,20 μL的無酶無菌水,總體積為50 μL。在其它的配置都相同的情況下,本研究將Y0溶液更換成只有DNA長片段的溶液作為對照組。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)包括30個循環(huán):94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s。經(jīng)過0.1%的瓊脂糖電泳后,使用UVP ChemStudio 515(Analytik-Jena,德國耶拿分析儀器股份公司)進行成像以及分析電泳條帶的濃度。以marker條帶的濃度作為參照物進行相對定量分析(DNA Marker,上海生工生物工程有限公司),選擇性擴增短片段的富集效率計算公式如下:

DNA短片段擴增產(chǎn)物的富集效率(%)=[(x-y)/x]×100%

其中x表示使用PNA-引物對DNA長短片段混合物進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得的擴增片段濃度;y表示表示使用PNA-引物對只含有DNA長片段的模板進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得的擴增片段濃度。

2 結(jié)果

在本研究中,基于DNA片段的物理特性,首次嘗試對PNA與引物進行連接,在不破壞每個試劑功能的前提下,通過點擊化學(xué)將二者成功的連接起來,利用PNA的固定作用,極大可能地阻止了引物與相應(yīng)位點的結(jié)合,從而阻斷長片段自身的擴增,基于此原理(如圖3所示),本次研究將DNA長片段和短片段混合,使用PNA-引物反應(yīng)體系進行PCR擴增以檢測選擇性擴增DNA短片段的效率。本次研究對所有參與反應(yīng)的些參數(shù)都進行了優(yōu)化。從另一方面來說,這種新方法可以為cffDNA的分離以及純化提供新的思路。

注:紅色表示DNA長片段,藍(lán)色表示DNA短片段;理論上,Y0溶液中存在以上3種擴增反應(yīng)的可能。當(dāng)PNA-S-R的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過DNA長片段的量時,則存在第三種可能性。

2.1PNA-引物的分離以及純化 為了判斷點擊化學(xué)反應(yīng)能否將含有疊氮基團的PNA與含有含炔基的引物進行連接,本次研究將具有不同反應(yīng)條件的溶液進行初步的處理后,通過Urea-PAGE電泳可以得知(見圖4),在電泳道1中接近50 nt位置的條帶極大可能就是PNA與引物的連接物,而在25 nt附近的兩條條帶通過與電泳道3相比,可以判斷出是引物與催化劑反應(yīng)所生成的副產(chǎn)物。隨后,本次研究通過切膠回收,將疑似連接產(chǎn)物的電泳條帶通過高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography,HPLC)純化后,在與單獨的PNA和引物進行比較(見圖5,補充圖1),結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者的出峰時間均不相同。

注:泳道1為PNA與引物在催化劑存在下反應(yīng)3 h;泳道2為PNA與引物在沒有催化劑的情況下反應(yīng)3 h;泳道3為引物單獨與催化劑反應(yīng)3 h;泳道4為PNA單獨與催化劑反應(yīng)3 h;泳道5為僅有引物;泳道6為僅有PNA;泳道7為含有催化劑的反應(yīng)溶液。

圖5 PNA-引物、引物和PNA依次在HPLC中的峰值時間

2.2質(zhì)譜的表征分析 為了判斷生成的連接物是否就是由PNA與引物連接而成的,本次研究使用Thermo ScientificTMLTQ XLTM線性離子阱質(zhì)譜儀對已經(jīng)分離純化后的PNA-引物進行表征。在質(zhì)譜分析中,如圖6A～圖6C所示,PNA-引物的分子量理論值應(yīng)該等于PNA的分子量加上引物的分子量,在誤差允許的范圍內(nèi),質(zhì)譜儀器得出的分子量結(jié)果為10546.2 Da,其結(jié)果符合預(yù)期的理論值范圍。綜上所述,本次研究通過Urea-PAGE電泳實驗分析、HPLC分析以及質(zhì)譜分析,成功地確定了PNA-引物已經(jīng)連接成功。

注:A為引物質(zhì)譜分析的結(jié)果;B為PNA的質(zhì)譜分析結(jié)果;C為PNA-引物的質(zhì)譜分析結(jié)果。

2.3PNA-引物的富集效率檢測結(jié)果 在確保PNA-引物連接成功后,本次研究首先要保證PNA和引物各自的功能都不受到影響,為此,基于前期的實驗研究,使用包含了PNA堿基序列的引物(33號引物對)進行測試,如圖7A所示,在電泳條帶1、2號中,33號引物對能夠正常擴增出產(chǎn)物,而加入PNA后的3、4號電泳條帶卻無法擴增出產(chǎn)物,則說明PNA阻斷了引物與DNA模板的結(jié)合,同樣的,在加入PNA-引物后(5、6號電泳條帶),電泳的結(jié)果同樣能夠說明連接后的PNA功能沒有改變。接下來是對引物的功能進行判定,為了防止PNA的阻斷效應(yīng)出現(xiàn),本次研究使用短片段作為DNA模板進行擴增,結(jié)果如圖7B所示,在相同的條件下,二者都能擴增出模板DNA,則說明引物的功能沒有改變。最后是對PNA-引物的特異性擴增DNA短片段進行測試,等比倍比稀釋后的DNA長片段經(jīng)過相同濃度的引物和PNA-引物擴增后,其擴增出來的條帶亮度以及擴增閾值均不相同(補充圖2)。通過對Y0溶液的擴增以及電泳條帶的分析,基于相對定量的方法進行濃度判斷,以點對點的方法創(chuàng)建濃度曲線,最終結(jié)果如圖4C所示,具體濃度可以從表2獲得。通過兩獨立樣本t檢驗(見圖4D)可以得知,PNA-引物反應(yīng)體系在兩種不同的溶液中擴增出的產(chǎn)物相對濃度不同,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001),基于上述選擇性擴增DNA短片段的富集效率計算公式,可以算出5組PNA-引物反應(yīng)體系在Y0溶液中選擇性擴增DNA短片段的效率分別為:72.27%、81.21%、79.51%、83.20%、79.66%。因此,雖然該新方法目前還不能做到百分之百的只擴增DNA短片段而不擴增DNA長片段,但從目前的結(jié)果來看,這依然是一個非常具有潛力的新方法,可以為cffDNA的富集提供新的視角和研究方向。

注:A為PNA性能的測試;B為引物的性能測試;C～D為PNA-引物在5組Y0溶液和DNA長片段溶液中的擴增效率比較;****P<0.0001。

表2 每條電泳帶的相對濃度值

3 討論

肽核酸因其高度的靈活性,可以通過廣泛的構(gòu)象來結(jié)合其它生物分子,并且被認(rèn)為在未來的納米生物技術(shù)中會具有至關(guān)重要的作用[24]。使用PNA來代替探針中的DNA,可以提高探針的親和力、靶標(biāo)特異性和抗生物降解性[25-26]。與傳統(tǒng)的northern印跡雜交、微陣列和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等技術(shù)相比,使用PNA探針技術(shù)不需要核酸的提取和擴增,可以直接檢測細(xì)胞中的核酸成分[27-28]。因此,通過點擊化學(xué)反應(yīng),將PNA與引物進行連接,并且保留各自的性能不被破壞,生成的PNA-引物在未來的納米生物技術(shù)具有非常大的潛力。

利用孕婦外周血中胎兒游離DNA進行無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷已成為產(chǎn)前診斷的目標(biāo),NIPT既可以獲得完整的胎兒遺傳信息,同時又能避免對母嬰的風(fēng)險。因此,為了從母體循環(huán)中獲取稀有的胎兒細(xì)胞,開發(fā)高效的分離技術(shù)是必要的[29-30]。然而從母親血漿中有效地分離cffDNA是一個至今沒有解決的技術(shù)難題,現(xiàn)有的cffDNA分離技術(shù)主要有大規(guī)模并行測序(MPS)[31-32],液滴數(shù)字PCR(ddPCR)[33-34]和物理分離法[35-36]。其中MPS的全基因組測序或靶向測序方法被認(rèn)為是準(zhǔn)金標(biāo)準(zhǔn),ddPCR是一種新穎的技術(shù),同樣具有穩(wěn)健、靈敏、高效和可靠的技術(shù)[37],但這兩種方法所涉及的儀器成本高昂,距離常規(guī)臨床應(yīng)用,有較大的距離。物理分離法是目前已被公認(rèn)的可以從母體血漿中得到高比例cffDNA的可靠方法[38],但該法的缺點是通量低,且可能產(chǎn)生樣品污染,不是一個理想的臨床常規(guī)方法?？偟膩碚f,在過去的十年里,有關(guān)cffDNA富集的方法,或通量低,或成本高,或程序復(fù)雜難以滿足臨床常規(guī)應(yīng)用的要求。

在本次研究中,通過構(gòu)建SRY基因模型,簡單模擬孕婦外周血環(huán)境,其研究目的就是使用一種新方法可以選擇性地將混合溶液中的DNA短片段(cffDNA)進行選擇性擴增。在該實驗中詳細(xì)地講解了基于點擊化學(xué)將PNA與引物進行連接方法,這是一種創(chuàng)新的方法。然后分別通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、高效液相色譜儀以及質(zhì)譜儀對PNA-引物進行表征,進一步確定了PNA-引物的成功合成。最后,通過PCR反應(yīng)結(jié)合電泳條帶的濃度分析,初步對該反應(yīng)體系的富集效率進行評估,在特定的濃度條件下,DNA短片的富集效率可以高達(dá)83.20%,這是一項令人振奮的消息。

綜上所述,基于DNA片段的大小,開發(fā)了一套利用“PNA-引物”進行選擇性富集DNA短片段的方法,這種新方法同時具有通量高、成本低的特點,為cffDNA的分離以及純化提供了新的思路。然而,本研究仍然存在一些不足之處:①本研究中對于DNA長片段與PNA-引物的濃度比例選擇比較苛刻,理想狀態(tài)下,二者1∶1的比例是PNA能夠阻斷引物與DNA模板結(jié)合的最高閾值比例,若PNA-引物的量越是高于DNA長片段的量,則擴增的假陽性比例就會越多。理論上,PNA-引物的量越是低于DNA長片段的量,則特異性擴增出DNA短片段(cffDNA)的比例也就越大;②本研究仍然存在可以改進以提高擴增DNA短片段效率的空間,比如說將短片段的上游引物與另一個PNA進行連接,以增強引物對DNA短片段結(jié)合的特異性,進而降低母源DNA的干擾;③為了能夠更好地驗證該方法的實用性,后續(xù)的實驗應(yīng)構(gòu)建孕婦具體的外周血模型或者在臨床上使用不同孕期的孕婦進行驗證,同時與MPS金標(biāo)準(zhǔn)進行比較,但受限于許多因素的影響,很遺憾,本次研究未能完成這一步的驗證。