慢性鋁暴露對(duì)小鼠精子質(zhì)量及睪丸細(xì)胞焦亡的影響

農(nóng)威華,楊鳳蓮,李紅閣, 竇晟,董明右,王俊利

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,廣西 百色 533000;2. 右江民族醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)藥與大健康現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)學(xué)院,廣西 百色 533000;3. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點(diǎn)學(xué)科生殖醫(yī)學(xué),廣西 百色 533000)

鋁是一種在自然環(huán)境中豐富存在且使用廣泛的金屬元素,可以通過皮膚、呼吸道、消化道、肌肉注射等途徑進(jìn)入人體。人類接觸鋁的來源主要包括食物、空氣傳播的微粒和煙霧、藥物、化妝品等[1]。鋁在體內(nèi)積累將對(duì)男性精子質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面的影響,包括降低精子數(shù)量、活力及存活率,增加精子畸形率等[2]。目前已發(fā)現(xiàn)多種途徑參與鋁誘導(dǎo)的男性生殖毒性,如氧化應(yīng)激、炎癥、DNA損傷和線粒體功能障礙,其中炎癥是早期的標(biāo)志性損傷[3-5]。

焦亡是由某些炎癥小體引發(fā)的細(xì)胞程序性死亡的一種炎癥形式[6],可導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、質(zhì)膜溶解、染色質(zhì)碎裂、細(xì)胞內(nèi)促炎內(nèi)容物如IL-18和IL-1β的釋放[7],Gasdermin D(GSDMD)是Caspase-1(CASP1)的一種蛋白底物,是細(xì)胞焦亡過程中的執(zhí)行分子,其裂解可導(dǎo)致N-結(jié)構(gòu)域寡聚化和質(zhì)膜孔形成,是細(xì)胞死亡的破裂形式[8]。在探討鋁對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)影響的研究中發(fā)現(xiàn),鋁可以刺激核苷酸寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體家族pyrin結(jié)構(gòu)域,炎癥小體NLRP3組裝并激活CASP1,誘導(dǎo)GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡信號(hào),釋放細(xì)胞因子IL-1b和IL- 18,放大神經(jīng)炎癥反應(yīng)[9]。對(duì)來自病原體感染、組織損傷和毒物反應(yīng),機(jī)體促炎細(xì)胞因子激活,如腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白介素-1β (IL-1β) 和白介素-6 (IL-6),從而對(duì) HPG 軸、睪丸組織、精子質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響[10-11]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),鋁可以誘發(fā)睪丸炎癥和精子質(zhì)量下降,基于炎癥與焦亡的發(fā)生密切相關(guān),認(rèn)為焦亡是鋁對(duì)男性生殖毒性的潛在機(jī)制。

本研究通過分析鋁暴露對(duì)小鼠精子質(zhì)量的影響,結(jié)合鋁暴露組與對(duì)照組睪丸細(xì)胞焦亡關(guān)鍵基因(Nlrp3、Caspase-1、Gsdmd和IL1b)mRNA和蛋白的表達(dá)差異,探討鋁通過睪丸細(xì)胞焦亡影響精子質(zhì)量的潛在機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1鋁暴露小鼠模型的構(gòu)建 12只成熟雄性c57bl/6j小鼠,8周齡,購(gòu)買于斯萊克景達(dá)動(dòng)物公司,許可證號(hào):SCXK(湘)2019-0004。在實(shí)驗(yàn)開始前進(jìn)行1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件為室溫(25±2) ℃、相對(duì)濕度 50%～70%、12 h∶12 h明暗交替光照,實(shí)驗(yàn)期間小鼠可自由攝食及飲水。隨后,將小鼠隨機(jī)分為兩組:對(duì)照組(n=6)、鋁模型組(n=6)。鋁模型組采用10 mg/(kg·d) AlCl3(AlCl3·6H2O,上海阿拉丁生化科技公司,批號(hào):A112509)灌胃,每天1次[12]。對(duì)照組用鋁暴露組AlCl3等體積的蒸餾水灌胃,每天1次。模型構(gòu)建持續(xù)8周,取小鼠睪丸組織、附睪組織及附睪精子進(jìn)行分析。精子質(zhì)量及睪丸組織形態(tài)是評(píng)估鋁暴露小鼠模型建造成功的重要指標(biāo),精子質(zhì)量下降及睪丸組織形態(tài)受損說明實(shí)驗(yàn)組小鼠生殖系統(tǒng)成功因鋁暴露而受損[13]。

1.2精子質(zhì)量檢測(cè) 取一側(cè)附睪組織,置于1.5 mL 37 ℃的生理鹽水中,剪碎、混勻,37 ℃水浴箱中溫育15 min,取得附睪精子濾液。取10 μL精子濾液滴入預(yù)熱的Makler精子計(jì)數(shù)板,利用計(jì)算機(jī)輔助精液分析儀(CASA) ,參照WHO 精子運(yùn)動(dòng)分類標(biāo)準(zhǔn)[14],將精子活動(dòng)力分為 PR(前向運(yùn)動(dòng)精子)、NP(非前向運(yùn)動(dòng)精子)和 IM(不動(dòng)精子)三級(jí),對(duì)精子進(jìn)行分類計(jì)數(shù),顯微鏡下計(jì)數(shù) 200 個(gè)精子,分析前向運(yùn)動(dòng)精子百分比,精子活力檢測(cè)工作于3 min內(nèi)完成。采用Diff-Quik快速染色法試劑盒(北京索萊寶科技公司,批號(hào):G2572)進(jìn)行精子形態(tài)學(xué)檢查,統(tǒng)計(jì)異常精子數(shù),計(jì)算異常精子率。

1.3睪丸組織病理學(xué)、生精小管面積和直徑測(cè)量 取左側(cè)睪丸固定于4%聚甲醛24 h,進(jìn)行脫水、石蠟包埋,切割成5 μm的石蠟切片。石蠟切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色,于蔡司顯微鏡下分析睪丸、附睪組織病理學(xué)。于顯微鏡下每組隨機(jī)篩選50個(gè)圓形生精小管進(jìn)行直徑和面積測(cè)量。

1.4定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 采用Trizol(美國(guó)英杰生命科技有限公司)法提取睪丸總RNA,測(cè)定總 RNA濃度及純度,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒the PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit [寶生物工程(大連)有限公司]說明書步驟將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)在A28132 PCR系統(tǒng)下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR擴(kuò)增。以Gapdh為內(nèi)參基因,數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。使用引物序列如表1所示。

表1 qPCR實(shí)驗(yàn)相關(guān)基因的引物序列

1.5免疫組織化學(xué)檢測(cè) 石蠟切片用酒精梯度進(jìn)行水化,用pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液高壓孵育3 min修復(fù)抗原,滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑,PBS清洗,滴加非特異染色阻斷劑,滴加對(duì)應(yīng)的一抗液,蓋上濕盒蓋,放入4 ℃冰箱內(nèi)過夜,PBS沖掉切片內(nèi)的一抗液,加入二抗,孵育20 min,用PBS沖掉切片內(nèi)的二抗液,使用DAB顯色液顯色,水洗盡DAB液后,放入蘇木素中染色、水洗、返藍(lán)、脫水、封片,顯微鏡下分析染色結(jié)果。使用抗體如表2所示。

表2 免疫組化中相關(guān)抗體信息

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1鋁暴露對(duì)小鼠體重、睪丸重量、附睪重量及精子質(zhì)量的影響 與對(duì)照組相比,鋁暴露小鼠體重、睪丸重量及附睪重量均明顯下降(P<0.01)。與對(duì)照組相比,鋁暴露小鼠附睪精子數(shù)量、精子活力均顯著下降(P<0.01),精子畸形率顯著增加(P<0.01)。結(jié)果見圖1。

注:A.對(duì)照組與鋁暴露小鼠體重; B.對(duì)照組與鋁暴露小鼠睪丸重量;C.對(duì)照組與鋁暴露

2.2鋁暴露對(duì)小鼠睪丸、附睪病理形態(tài)的影響 對(duì)照組小鼠睪丸組織學(xué)正常形態(tài),有組織良好的生精小管,管內(nèi)包含不同成熟階段的生精細(xì)胞,細(xì)胞排列整齊,管內(nèi)精子數(shù)量多(見圖2A),同樣的在附睪中精子數(shù)量多(見圖2B)。然而在鋁暴露小鼠中,部分睪丸生精小管萎縮,直徑及面積減小,生精細(xì)胞層數(shù)及數(shù)量減少,細(xì)胞排列紊亂,管內(nèi)精子數(shù)量明顯減少(見圖2A),在附睪中精子數(shù)量明顯減少(見圖2B)。

注:A.對(duì)照組與鋁暴露小鼠睪丸HE染色; B.對(duì)照組與鋁暴露附睪HE染色。

2.3鋁暴露對(duì)小鼠生精小管直徑及面積的影響 與對(duì)照組大鼠生精小管的平均面積(55968.42±7420.05) μm2相比,鋁暴露小鼠生精小管平均面積(39255.70±2647.92) μm2縮小(見圖3A)。與對(duì)照組生精小管直徑(266.69±11.76) μm相比,鋁暴露小鼠生精小管直徑(223.95±10.45) μm也是減小(見圖3B)。

注:A.對(duì)照組與鋁暴露小鼠生精小管面積; B.對(duì)照組與鋁暴露生精小管直徑;n=6,**P<0.01。

2.4鋁暴露對(duì)小鼠睪丸組織中焦亡關(guān)鍵基因表達(dá)的影響 qRT-PCR 檢測(cè)顯示,與對(duì)照組相比,鋁暴露小鼠睪丸組織中焦亡關(guān)鍵基因Nlrp3、Caspase-1、Gsdmd和IL-1b mRNA表達(dá)均上調(diào)(見圖4A)。免疫組化結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,鋁暴露小鼠睪丸組織中焦亡關(guān)鍵基因Nlrp3、Caspase-1、Gsdmd和IL-1b 的蛋白表達(dá)均上調(diào)(見圖4B)。

注:A.qRT-PCR檢測(cè)鋁暴露對(duì)小鼠睪丸組織中焦亡關(guān)鍵基因Nlrp3、Caspase-1、IL-1b、Gsdmd mRNA表達(dá)的影響; B.免疫組化檢測(cè)鋁暴露對(duì)小鼠睪丸組織中焦亡關(guān)鍵基因Nlrp3、Caspase-1、IL-1b、Gsdmd蛋白表達(dá)的影響。**P<0.01

3 討論

本研究旨在探討鋁暴露對(duì)小鼠精子質(zhì)量及睪丸組織細(xì)胞焦亡的影響,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,鋁暴露組小鼠體重、睪丸重量、附睪重量均顯著下降,與以往的研究相一致[15]。本研究中觀察到鋁暴露小鼠進(jìn)食量下降,這是導(dǎo)致其體重下降的重要原因,過往文獻(xiàn)也有類似發(fā)現(xiàn)[16]。睪丸重量是男性生育能力的關(guān)鍵,睪丸重量下降可致生精數(shù)量減少[17]。研究認(rèn)為鋁暴露小鼠睪丸、附睪重量下降可能是由于鋁的作用引起組織壞死和萎縮[18]。另一種可能是在鋁誘導(dǎo)下產(chǎn)生自由基,導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA氧化損傷,最終出現(xiàn)蛋白質(zhì)消耗[19-20]。

精子質(zhì)量下降是男性生殖毒性的標(biāo)志之一[21],男性暴露于有毒物質(zhì)的環(huán)境是導(dǎo)致精子質(zhì)量下降和不孕不育的主要原因之一[22-23]。精子活力、精子數(shù)量、精子畸形率是精子質(zhì)量的重要參數(shù),本次研究結(jié)果顯示鋁暴露小鼠精子數(shù)量、活力顯著下降,精子畸形率顯著升高,這與先前的研究報(bào)道相一致[24]。精子質(zhì)膜中多不飽和脂肪酸的含量極高,極易受到氧化應(yīng)激的影響[25-26]。鋁是一種促氧化劑,它可以通過增強(qiáng)氧自由基和改變酶活性對(duì)睪丸及精子產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷[27],這可能是精子質(zhì)量下降的主要原因。

睪丸的組織形態(tài)學(xué)特征是男性生育能力評(píng)估和生殖毒性評(píng)估的關(guān)鍵指標(biāo)[28]。在本研究中,鋁暴露小鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)觀察顯示,生精小管縮小,生殖細(xì)胞滑脫、排列紊亂、層數(shù)減少,精子發(fā)生中斷,管腔內(nèi)精子數(shù)量減少,在附睪中成熟精子數(shù)量減少。之前的研究也報(bào)道了暴露于不同環(huán)境毒物后,睪丸的結(jié)構(gòu)發(fā)生了類似的變化[29-30]。金屬毒物對(duì)睪丸組織形態(tài)的改變可能是由于氧化應(yīng)激引起的,睪丸組織學(xué)這些改變預(yù)示著精子發(fā)生和類固醇生成等重要過程受到干擾,上皮細(xì)胞的退化是睪丸損傷的主要原因[31-32]。有研究表明,鋁暴露大鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)觀察證實(shí)了精原細(xì)胞、細(xì)線前精母細(xì)胞、粗線精母細(xì)胞減少,提示生精活性下降[33]。此外,暴露于毒物環(huán)境后,生精小管直徑減小,同時(shí)伴有精子質(zhì)量下降[34-35],本研究結(jié)果顯示鋁暴露小鼠生精小管面積及直徑均減小,同樣伴有精子質(zhì)量下降。因此,認(rèn)為生精小管直徑及面積的減小可能是精子發(fā)生缺陷的一個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)。

細(xì)胞焦亡是近年來發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的一種新的程序性細(xì)胞死亡方式,其特征為依賴于炎性半胱天冬酶,主要是Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11,并伴有大量促炎癥因子的釋放。焦亡經(jīng)典途徑是炎癥小體NLRP3激活Caspase-1,Caspase-1將GSDMD裂解形成N-GSDMD,還能將IL-1b、IL-18前體加工成成熟的IL-1b、IL-18,成熟的IL-1b、IL-18并通過N-GSDMD形成的孔釋放出,導(dǎo)致細(xì)胞焦亡[36]。在非經(jīng)典焦亡途徑中,Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11直接結(jié)合胞質(zhì)脂多糖,靶向和激活GSDMD,切割GSDMD,并間接激活Caspase-1,引發(fā)細(xì)胞焦亡[37-38]。鋁引發(fā)炎癥反應(yīng),nod樣受體pyrin結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的炎癥小體NLRP3被激活[39]。細(xì)胞膜膜孔存在及焦亡小體的形成是細(xì)胞焦亡的重要標(biāo)志。有研究報(bào)道,鋁可引起小鼠神經(jīng)元細(xì)胞膜孔及焦亡小體的形成,同時(shí)引起小鼠大腦皮層Nlrp3、Caspase-1、IL-1b和Gsdmd等焦亡關(guān)鍵蛋白水平的升高,導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞焦亡[40]。同樣,本研究發(fā)現(xiàn)在鋁暴露小鼠睪丸組織中焦亡關(guān)鍵基因Nlrp3、Caspase-1、IL-1b和Gsdmd的mRNA及蛋白表達(dá)均顯著升高,推測(cè)鋁可導(dǎo)致睪丸細(xì)胞焦亡,但睪丸細(xì)胞膜膜膜孔和焦亡小體是否形成需要進(jìn)一步研究。有研究表明,暴露于有毒重金屬或其他有毒環(huán)境,睪丸及間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生焦亡,睪丸組織DNA斷裂及類固醇的生成降低,影響精子的發(fā)生[41-42]。因此,推測(cè)鋁暴露可能誘發(fā)睪丸細(xì)胞焦亡,導(dǎo)致精子質(zhì)量下降,其發(fā)生機(jī)制尚不清楚,這將是下一步研究的內(nèi)容。

鋁暴露促進(jìn)小鼠睪丸細(xì)胞焦亡關(guān)鍵因子的表達(dá),降低小鼠精子質(zhì)量,推測(cè)鋁暴露誘發(fā)的睪丸細(xì)胞焦亡是雄性生殖系統(tǒng)損傷的潛在機(jī)制。