二苯乙烯苷對阿爾茨海默病神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的抑制作用

李彥炳,夏小燕,康碧倩,李悅,何曉璇,李振中,朱曉瑩,廖艷花,黃忠仕

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,廣西 百色 533000;2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,廣西 南寧 530200;3. 右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,廣西 百色 533000;4. 右江民族醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院,廣西 百色 533000)

阿爾茨海默病(alzheimer disease,AD)是一種以大腦皮質(zhì)和海馬突觸功能障礙與神經(jīng)元細(xì)胞丟失為特征的進行性神經(jīng)退行改變疾病,在臨床上,阿爾茨海默病常表現(xiàn)為漸進性的認(rèn)知缺陷和記憶障礙[1-2]。目前,對AD的發(fā)病機制尚未完全明確,其中B淋巴細(xì)胞瘤因子相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)作為凋亡因子,介導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡,已被廣泛證實[3-4]?，F(xiàn)如今臨床針對AD研發(fā)的藥物也不可阻止或逆轉(zhuǎn)其疾病進展,只可以在一定程度緩解AD的臨床癥狀,針對AD疾病的治療,已經(jīng)對多種中草藥進行研究實驗,且取得了可觀的結(jié)果[5-7],為此本實驗就二苯乙烯苷(2,3,5,4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glycoside,TSG)對阿爾茨海默病神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的抑制情況進行探討,為AD疾病的治療尋找更多的可能性[8-10]。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗用動物 于長沙市天勤生物技術(shù)有限公購買SPF級雄性大鼠,24月齡,體質(zhì)量650～850 g,動物許可證號為SCXK(湘)2019-0014,動物全程飼養(yǎng)于廣西百色市右江民族醫(yī)學(xué)院SPF級動物實驗中心,所有動物實驗研究經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn),批準(zhǔn)號為2021082001。

1.1.2藥物與試劑 山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(美國ProteintechGroup公司,批號:20000174);β淀粉樣蛋白25-35(β-amyloid protein 25-35,Aβ25-35)(美國SIGMA公司,批號:118M4893V);二苯乙烯苷(成都克洛瑪生物科技有限公司,批號:CHB180810);石杉堿甲片購自辰欣藥業(yè)股份有限公司(批號國藥準(zhǔn)字H20093133,50μ/g片);三代逆轉(zhuǎn)錄預(yù)混液(武漢莫納生物科技有限公司,批號:150613);抗體染料法qPCR mix(武漢莫納生物科技有限公司,批號:140606);TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,批號:20221129-1)。

1.1.3實驗用儀器 ZH-藍(lán)星B/S型大小鼠腦立體定位儀(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司);ZH-KES型微量注射泵(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司);PAT-8R被動逃避黑白箱(成都泰盟軟件有限公司);Histo Core PEARL型自動程控脫水機,EG1150C型自動包埋機(德國徠卡);Neofuge15R型高速冷凍離心機; LightCycler96型實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)系統(tǒng)(羅氏)。

1.2方法

1.2.1模型制備 適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后,將SD大鼠隨機分為7組,每組15只,分別為正常組、假手術(shù)組、模型組、陽性藥組、TSG低劑量組、TSG中劑量組、TSG高劑量組。SD大鼠稱重,甲苯噻嗪(8 mg/kg)腹腔注射麻醉后,備皮,將其穩(wěn)定固定于腦立體定位儀兩滑道之間,保持前后囟同一水平,取75%乙醇由內(nèi)向外消毒大鼠頭頂部備皮區(qū)域。執(zhí)筆式持手術(shù)刀垂直進刀,沿矢狀縫做一長約3 cm的切口,用組織鉗固定兩側(cè)皮層,充分暴露切口,剝離顱骨頂部的筋膜及組織,以大鼠前囟為原點,參考大鼠腦立體定位儀圖譜選取海馬區(qū)域(前囟后3.5 mm,中線外側(cè)2.0 mm),取牙科鉆分別在兩側(cè)海馬區(qū)域鉆出小孔,微量進樣器垂直進入2.7 mm。將于37 ℃孵育1周的質(zhì)量濃度為5 μg/μL的Aβ25-35溶液以0.2 μL/min的速度緩慢勻速注入兩側(cè)腦室,注入體積1 μL,注射時間約5 min,注射完成后留針5 min,有助于Aβ25-35充分彌散,緩慢出針。假手術(shù)組注射等量生理鹽水,正常組不做處理。術(shù)后對頭部皮層進行縫合,每日通過肌注給予青霉素G10萬單位,連續(xù)7 d,用于預(yù)防切口組織感染[11-13]。

1.2.2篩選動物模型 進行被動回避實驗行為學(xué)測試,以此作為篩選動物模型造模成功與否的標(biāo)準(zhǔn)。第一階段將實驗大鼠從亮室入口放入實驗箱體,打開亮室與暗室之間的門,不通電,進行10 min環(huán)境適應(yīng)后,將實驗對象放入暗室并關(guān)閉兩室之間的門,放置10 s并進行通電,使大鼠形成記憶。第二階段進行測試,實驗對象由明室進入暗室的時間記為潛伏期,在暗室遭受電擊次數(shù)記為錯誤次數(shù),記錄每個實驗對象的潛伏期與5 min內(nèi)的錯誤次數(shù)。每天進行3次實驗,連續(xù)7 d實驗,以正常組大鼠潛伏期時間為標(biāo)準(zhǔn),對各組大鼠潛伏期進行分析,排除造模失敗的動物模型,各組篩選10只大鼠作為后期實驗對象。

1.2.3給藥 因手術(shù)造模具有無法避免的創(chuàng)造性,且實驗用大鼠月齡較大,易死亡,所以經(jīng)被動回避實驗篩選出10只實驗大鼠進入后期實驗。對篩選出的實驗動物進行灌胃給藥,正常組、假手術(shù)組、模型組(生理鹽水30 mL/kg),陽性藥組(石杉堿甲0.150 mg/kg), TSG低劑量組(TSG 0.033 g/kg),TSG中劑量組(TSG 0.1 g/kg),TSG高劑量組(TSG 0.3 g/kg),每組每日灌胃給藥1次,連續(xù)給藥4周。

1.2.4取材 灌胃給藥結(jié)束后,每組大鼠隨機取5只,經(jīng)腹腔注射甲苯噻嗪(8 mg/kg)進行麻醉,全程冰上操作迅速分離出海馬組織-80 ℃保存?zhèn)溆?用于后期檢測基因及蛋白表達(dá)。剩余5只大鼠進行心臟灌流取出完整大腦組織用于TUNEL凋亡實驗病理檢測和免疫組織化學(xué)實驗檢測。

1.2.5TUNEL凋亡實驗病理形態(tài)觀察 冰上操作取出完整腦組織后,用4%多聚甲醛對含海馬體的腦組織塊進行固定24 h,再進行酒精梯度脫水,石蠟包埋,切片厚度為4 μm,石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟后,按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒步驟進行操作,中性樹膠封片,光鏡下觀察腦組織海馬區(qū)及皮層區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(qRT-RCR) 按照Trizol試劑盒實驗步驟進行操作,提取大鼠腦組織內(nèi)RNA,通過微量紫外分光光度計檢測RNA濃度、純度。OD260/OD280比值在1.8～2.1范圍內(nèi)的RNA樣本可繼續(xù)進行逆轉(zhuǎn)錄實驗。按cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒實驗步驟進行操作,將RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA。配制反應(yīng)體系(共20 μL):上/下引物各1 μL、模板cDNA2 μL、通用型快速反應(yīng)SYBR綠色熒光染料混合物10 μL、無酶水6 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性600 s,95 ℃變性10 s,60 ℃延伸30 s,共40個循環(huán),通過qRT-PCR儀兩步法對其進行擴增。以GAPDH為內(nèi)參,2-ΔΔCt法計算各目的mRNA的相對表達(dá)量。引物序列合成由武漢金開瑞生物工程有限公司完成,引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.7免疫組織化學(xué)染色法(IHC) 將預(yù)凍石蠟塊進行切片,切片厚度4 μm,60 ℃烤片2 h。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟后,至蒸餾水中待染。切片放入煮沸的檸檬酸抗原修復(fù)液中,進行抗原修復(fù)2 min,每張切片加50 μL 3%過氧化氫,室溫下孵育10 min,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性;切片加50 μL的Bax、Bcl-2一抗溶液(按1∶100稀釋),在4 ℃溫度下孵育過夜;一抗孵育結(jié)束后每張切片加50 μL免疫組化通用試劑盒中的二抗,室溫下孵育15 min;經(jīng)DAB試劑顯色,顯微鏡下觀察,適時終止反應(yīng),蒸餾水洗滌,蘇木素輕度復(fù)染30 s,自來水沖洗;梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡觀察海馬區(qū)和皮層區(qū)蛋白表達(dá)變化。

2 結(jié)果

2.1TSG對各組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響 正常組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列有序,細(xì)胞完整性良好,少見棕色反應(yīng),皮層區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量豐富,棕色反應(yīng)不顯著;與正常組海馬區(qū)和皮層區(qū)比較,假手術(shù)組和陽性藥組未見明顯變化;模型組棕色反應(yīng)加深且面積擴大,可見固縮深染現(xiàn)象,神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)減少,細(xì)胞完整性被破壞。與模型組海馬區(qū)和皮層區(qū)比較,陽性藥組與TSG各劑量組出現(xiàn)不同程度的好轉(zhuǎn)現(xiàn)象,棕色反應(yīng)不同程度減弱,神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量逐漸增加,細(xì)胞完整性逐漸恢復(fù)。見圖1、圖2。

注:A.正常組;B.假手術(shù)組;C.模型組;D.陽性藥組;E.TSG低劑量組;F.TSG中劑量組;G.TSG高劑量組。

注:A.正常組;B.假手術(shù)組;C.模型組;D.陽性藥組;E.TSG低劑量組;F.TSG中劑量組;G.TSG高劑量組。

2.2TSG對各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響 與正常組比較,假手術(shù)組Bax mRNA相對表達(dá)量無顯著變化,陽性藥組Bax mRNA相對表達(dá)量出現(xiàn)增加(P<0.05),模型組Bax mRNA相對表達(dá)量出現(xiàn)顯著增加(P<0.01);與模型組比較,陽性藥組和TSG各劑量組Bax mRNA相對表達(dá)量出現(xiàn)不同程度的減少(P<0.05);與陽性藥組比較,TSG低、中劑量組Bax mRNA相對表達(dá)量出現(xiàn)增加(P<0.05),TSG高劑量組Bax mRNA相對表達(dá)量無明顯變化。見圖3。

注:A.正常組;B.假手術(shù)組;C.模型組;D.陽性藥組;E.TSG低劑量組;F.TSG中劑量組;G.TSG高劑量組。與正常組比較,#P<0.01;與假手術(shù)組比較,*P<0.01;與模型組比較,▽P<0.05;正常組各指標(biāo)mRNA表達(dá)量均為1。(n=5)。

與正常組比較,假手術(shù)組Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量無顯著變化,陽性藥組Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量出現(xiàn)增加(P<0.01),模型組Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量出現(xiàn)顯著減少(P<0.01);與模型組比較,TSG低劑量組Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量出現(xiàn)小幅增加,但不具統(tǒng)計學(xué)意義,陽性藥組和TSG中、高劑量組Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量出現(xiàn)不同程度的增加(P<0.01);與陽性藥組比較,TSG各劑量組Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量出現(xiàn)減少(P<0.01),見圖4。

2.3TSG對各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 與正常組海馬區(qū)和皮層區(qū)比較,假手術(shù)組和陽性藥組Bax蛋白表達(dá)量無顯著改變,模型組Bax蛋白表達(dá)量出現(xiàn)明顯增加(P<0.01);與模型組海馬區(qū)和皮層區(qū)比較,陽性藥組和TSG各劑量組Bax蛋白表達(dá)量出現(xiàn)不同程度的減少(P<0.01);與陽性藥組海馬區(qū)和皮層區(qū)比較,TSG低劑量組Bax蛋白表達(dá)量出現(xiàn)增加,TSG中、高劑量組Bax蛋白表達(dá)量無明顯改變。見表2、圖5、圖6。

注:A.正常組;B.假手術(shù)組;C.模型組;D.陽性藥組;E.TSG低劑量組;F.TSG中劑量組;G.TSG高劑量組。與正常組比較,#P<0.01;與假手術(shù)組比較,*P<0.01;與模型組比較,▽P<0.01;正常組各指標(biāo)mRNA表達(dá)量均為1。(n=5)。

表2 TSG對各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響結(jié)果

注:A.正常組;B.假手術(shù)組;C.模型組;D.陽性藥組;E.TSG低劑量組;F.TSG中劑量組;G.TSG高劑量組。

注:A.正常組;B.假手術(shù)組;C.模型組;D.陽性藥組;E.TSG低劑量組;F.TSG中劑量組;G.TSG高劑量組。

與正常組海馬區(qū)和皮層區(qū)比較,假手術(shù)組和陽性藥組Bcl-2蛋白表達(dá)量無顯著改變,模型組Bcl-2蛋白表達(dá)量出現(xiàn)明顯減少(P<0.01);與模型組皮層區(qū)比較,陽性藥組和TSG各劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)量出現(xiàn)不同程度的增加(P<0.01);與模型組海馬區(qū)比較,陽性藥組和TSG中、高劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)量出現(xiàn)不同程度的增加(P<0.01);與陽性藥組海馬區(qū)和皮層區(qū)比較,TSG中、高劑量組Bax蛋白表達(dá)量無明顯改變。見表3、圖7、圖8。

表3 各組大鼠腦組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)結(jié)果

注:A.正常組;B.假手術(shù)組;C.模型組;D.陽性藥組;E.TSG低劑量組;F.TSG中劑量組;G.TSG高劑量組。

注:A.正常組;B.假手術(shù)組;C.模型組;D.陽性藥組;E.TSG低劑量組;F.TSG中劑量組;G.TSG高劑量組。

3 討論

AD是一種多因素導(dǎo)致的疾病,其機制可能包含有Aβ沉積、Tau蛋白過度磷酸化、自由基損傷、膽堿缺乏和反應(yīng)性突觸丟失等,各種因素最終導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的減少或凋亡[14]。AD已成為老年人群體死亡的重要原因之一,隨著我國人口老齡化的加重,預(yù)計到2050年,我國將有超過1 507萬的癡呆癥患者,這對個人和社會都是巨大的經(jīng)濟和醫(yī)療負(fù)擔(dān)[15-16],尋找AD的有效治療藥物已成為全球共同關(guān)注的話題之一。Bcl-2蛋白家族是所有凋亡途徑中的下游蛋白家族,包含有Bcl-2和Bax,抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax是一組凋亡穩(wěn)態(tài)因子,Bcl-2是抑制細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子,正常情況下它在腦組織中高度表達(dá),保護神經(jīng)元細(xì)胞,減少神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡[17-19]。Bcl-2基因在1984年首次被發(fā)現(xiàn),來源于淋巴瘤中的一種癌基因,它在正常細(xì)胞的生長增殖中呈現(xiàn)高度表達(dá)狀態(tài),而在凋亡細(xì)胞中則幾乎不表達(dá)[3-4]。Bax通過調(diào)節(jié)線粒體外膜的通透性,使細(xì)胞色素C由線粒體釋放入胞質(zhì)內(nèi),導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)源性的凋亡。已有實驗驗證,中草藥可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)量改善AD疾病的癥狀[20]。在本實驗中,通過對TUNEL實驗凋亡細(xì)胞的觀察、實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法和免疫組織化學(xué)法的檢測,與模型組比較,TSG各劑量組的神經(jīng)元凋亡情況呈現(xiàn)不同程度的好轉(zhuǎn),Bax mRNA相對表達(dá)量和Bax蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)不同程度降低,Bcl-2m RNA相對表達(dá)量和Bcl-2蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)不同程度的升高,且表現(xiàn)出劑量依賴性,這些結(jié)果提示,TSG可以在一定程度上通過調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2 mRNA的表達(dá),改善神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的情況。

綜上所述,TSG可以在一定程度上調(diào)節(jié)凋亡途徑中的因子,減緩腦組織神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡,達(dá)到緩解AD癥狀的可能性。