基于臘葉標(biāo)本分析的木姜葉柯表型性狀變異及地理分化研究

趙鵬霞，楊 旭，楊志玲，田朝霞，羊奕珣

（1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河北 保定 071000；3.浙江省林木育種技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311400）

【研究意義】植物表型是現(xiàn)代植物育種研究中的重要方向之一，對(duì)植物表型性狀的研究有助于全面、系統(tǒng)地揭示樹(shù)種遺傳變異規(guī)律，以及植物在生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)資源的分配利用和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)規(guī)律[1]。植物的表型性狀是基因型對(duì)外界環(huán)境變化的適應(yīng)性響應(yīng)，在長(zhǎng)期的選擇壓力中發(fā)生不可逆的變化，經(jīng)穩(wěn)定遺傳后產(chǎn)生的[2-3]。植物表型性狀中，葉片是對(duì)環(huán)境變化敏感且可塑性較大的器官[4]，葉片表型性狀不僅影響植物的基本行為和光合功能，而且能反映植物對(duì)不同生境適宜能力及其與環(huán)境相互作用等信息[5-6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物標(biāo)本承載著大量的植物信息以及生境信息，為記錄生物多樣性的檔案，亦是人類分類調(diào)查資源研究活動(dòng)的百科全書(shū)[7]?！爸袊?guó)數(shù)字植物標(biāo)本館”（Chinese Virtual Herbarium，簡(jiǎn)稱CVH）以電子數(shù)據(jù)形式存儲(chǔ)植物標(biāo)本資料，為不同需求的用戶提供標(biāo)本數(shù)據(jù)查詢及共享服務(wù)，使植物標(biāo)本得到充分有效利用[8-9]，植物標(biāo)本數(shù)據(jù)信息化也是國(guó)際上的發(fā)展趨勢(shì)[10-11]，據(jù)統(tǒng)計(jì)僅在2006—2016 年CVH 標(biāo)本資源信息支撐了17 部專著、近600 篇科研論文的發(fā)表，其科研成果主要應(yīng)用于瀕危物種評(píng)估、國(guó)家重點(diǎn)野生植物分布、中醫(yī)藥植物分析等多個(gè)領(lǐng)域[7,12]。木姜葉柯（Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun）為殼斗科（Fagaceae）柯屬（Lithocarpus）常綠喬木，其葉片含有二氫查耳酮類化合物，味甜，可代茶飲，又名甜茶?，F(xiàn)代藥理研究表明，木姜葉柯葉片二氫茶耳酮類化合物中根皮苷能抑制葡萄糖在腎臟的重吸收，進(jìn)而控制血糖，干預(yù)糖尿病、腎病的發(fā)生和發(fā)展，還可促進(jìn)葡萄糖的分泌、降低空腹和餐后血糖水平，而不發(fā)生低血糖副作用[13]；二氫查耳酮類化合物中根皮苷、三葉苷和根皮素能預(yù)防和改善糖尿病并發(fā)癥，它們?cè)诳固悄虿∽饔蒙鲜艿皆絹?lái)越多的關(guān)注[14-15]。2017 年木姜葉柯被國(guó)家衛(wèi)計(jì)委批準(zhǔn)為新食品資源原料[16]。

【本研究切入點(diǎn)】木姜葉柯廣泛分布于我國(guó)秦嶺以南的廣大亞熱帶地區(qū)[17]，由于其分布區(qū)生境多樣，其不同地理居群間在區(qū)域尺度上產(chǎn)生一定形態(tài)分化，目前有文獻(xiàn)[18]報(bào)道過(guò)廣西境內(nèi)的木姜葉柯葉片表型性狀，在其廣大分布區(qū)內(nèi)葉片表型性狀變異及地理分化特性尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本文通過(guò)研究國(guó)內(nèi)多個(gè)植物標(biāo)本館內(nèi)木姜葉柯的臘葉標(biāo)本的葉片表型性狀變異，揭示居群內(nèi)和居群間地理變異模式，探明葉片表型性狀變異及其與地理-氣候因子的關(guān)系，研究結(jié)果能為種質(zhì)資源收集保存評(píng)價(jià)及開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所觀測(cè)的木姜葉柯1 200余份標(biāo)本來(lái)自中國(guó)科學(xué)院植物研究所標(biāo)本館（PE）、中國(guó)科學(xué)院華南植物園標(biāo)本館（IBSC）、中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所標(biāo)本館（KUN）、江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所標(biāo)本館（NAS）、中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所植物標(biāo)本室（CDBI）、江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院樹(shù)木標(biāo)本館（JXAU）、廣西植物研究所標(biāo)本館（IBK）、四川大學(xué)生物系植物標(biāo)本室（SZ）、浙江自然博物館植物標(biāo)本室（ZM）、中南林業(yè)科技大學(xué)林學(xué)院森林植物標(biāo)本（CSFI）、廈門(mén)大學(xué)標(biāo)本館（AU）等。選取其中標(biāo)本保存完好，采集地清楚，且采集號(hào)大于3 份的館藏標(biāo)本，共計(jì)469 份，它們分別屬于62 個(gè)居群。不同居群地理氣候因子見(jiàn)表1，其中各地經(jīng)緯度信息來(lái)自GoogleEarth，氣象數(shù)據(jù)來(lái)自中國(guó)氣象科學(xué)數(shù)據(jù)共享服務(wù)網(wǎng)。

表1 木姜葉柯標(biāo)本地的地理氣候因子Tab.1 Geographic and climate factors of specimen collection place of L.litseifolius

續(xù)表 Continued tab.

續(xù)表 Continued tab.

1.2 試驗(yàn)方法

利用Adobephotoshop 軟件中的標(biāo)尺對(duì)數(shù)字標(biāo)本館下載獲得的標(biāo)本圖片進(jìn)行葉片形態(tài)參數(shù)的測(cè)量和統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)的指標(biāo)包括葉片長(zhǎng)度（leaf length，LL），葉片寬度（leaf width，LW），葉面積（leaf area，LA），葉尖長(zhǎng)度（tip length，TL），葉尖夾角（tip angle，TA），葉基夾角（base angle，BA），葉柄長(zhǎng)度（petiole length，PL），數(shù)出一級(jí)側(cè)脈數(shù)（primary lateral veins，PLV），并計(jì)算葉片長(zhǎng)寬比（LL/LW）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用SPSS19.0軟件One-way ANOVA 計(jì)算木姜葉柯居群間葉片均值、方差、變異系數(shù)，葉片表型可塑性指數(shù)（PPI）用來(lái)解釋表型可塑性的特征。

式（1）中，MAX 和MIN 表示某一環(huán)境下的最大平均值和最小平均值，PPI 取值為0～1[19]，其值越大表示表型可塑性越大。用巢式方差分析計(jì)算葉片表型性狀的變異來(lái)源，用Person 相關(guān)分析分析葉片各表型性狀之間以及表型性狀與各地理氣候因子的相關(guān)系數(shù)，以各居群測(cè)定值的平均值為單元，利用樣本相關(guān)矩陣進(jìn)行主成分分析，并利用主成分分析的結(jié)果對(duì)各居群進(jìn)行UPGMA聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木姜葉柯葉片表型變異特征

表型可塑性大小用變異系數(shù)（CV）和表型可塑性指數(shù)（PPI）表示。對(duì)469 份木姜葉柯葉片的9 個(gè)表型性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（表2）。由表2 可知，木姜葉柯葉片表型性狀變異范圍較大，差異明顯，遺傳多樣性豐富。一般而言，變異系數(shù)大于10%表明樣本間差異較大，木姜葉柯葉片性狀的平均變異系數(shù)在9.79%～42.57%，平均變異系數(shù)為22.59%，其中TL 度的變異幅度最大（42.57%），其次為PL（31.28%），TA、BA 和PLV 的變異幅度相對(duì)較小，分別為9.79%、16.87%和10.43%。計(jì)算不同居群葉片表型可塑性發(fā)現(xiàn)，木姜葉柯葉片性狀的表型可塑性在0.50～1，TL＞PL＞LW＞LA＞LL＞LL/LW＞BA＞PLV＞TA。說(shuō)明這兩種表型可塑性分析方法的結(jié)果相似。在木姜葉柯表型性狀中，TL 可塑性最大，TA 表型可塑性最小。

表2 木姜葉柯葉片表型性狀特征Tab.2 Leaf phonotype traits characteristics of L.litseifolius

木姜葉柯數(shù)字標(biāo)本葉片表型性狀的各個(gè)指標(biāo)居群內(nèi)和居群間的差異分析見(jiàn)表3。由表3可知，不同居群間葉片表型性狀存在著極顯著的變異（P＜0.01），葉片LL、LW、LL/LW、TL、TA、BA 及LA 的變異主要來(lái)源于居群間，PL和PLV數(shù)的變異不僅來(lái)源于居群間，也來(lái)源于居群內(nèi)。

2.2 木姜葉柯葉片表型性狀的相關(guān)分析

對(duì)木姜葉柯9 個(gè)葉表型性狀作person 相關(guān)分析（表4）。由表4 可知，葉片表型性狀間存在顯著或極顯著的相關(guān)關(guān)系，其中葉片長(zhǎng)與葉片寬、葉尖長(zhǎng)度、葉面積呈極顯著的正相關(guān)，與葉基夾角呈顯著負(fù)相關(guān)；葉片寬與葉片長(zhǎng)寬比呈極顯著負(fù)相關(guān)，與葉面積呈極顯著正相關(guān)，與葉柄長(zhǎng)呈顯著負(fù)相關(guān)；葉片長(zhǎng)寬比與葉尖長(zhǎng)度和葉尖夾角呈顯著正相關(guān)，與葉基夾角呈極顯著正相關(guān)；葉尖長(zhǎng)度與葉基夾角呈顯著負(fù)相關(guān)，與葉面積呈極顯著正相關(guān)；葉尖夾角與葉脈對(duì)數(shù)呈極顯著的負(fù)相關(guān)；葉基夾角與葉脈對(duì)數(shù)呈顯著正相關(guān)。

進(jìn)一步將葉片表型性狀與標(biāo)本采集地經(jīng)緯度和氣候因子進(jìn)行相關(guān)性分析（表4）。由表4 可知，LL、LW 及LA 與采集地經(jīng)度呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)，BA 與緯度呈極顯著負(fù)相關(guān)，LL 與LA 與年降水呈顯著負(fù)相關(guān)，BA 與極端最低溫度呈極顯著正相關(guān)，結(jié)果表明生境的地理氣候因子對(duì)葉片表型性狀產(chǎn)生一定影響。

表4 木姜葉柯葉片表型性狀與地理因子的相關(guān)系數(shù)Tab.4 Correlation coefficient of leaf phonotype traits and geographic factors of L.polystachya

2.3 木姜葉柯葉片表型性狀的主成分分析

對(duì)9 個(gè)葉片表型性狀進(jìn)行主成分分析，得到3 個(gè)特征值大于1 的主成分（表5）。由表5 可知，第一主成分與LL、LW、LA、TA 顯著相關(guān)，貢獻(xiàn)率為38.845%，第二主成分與LL/LW、BA、PLV 顯著相關(guān)，貢獻(xiàn)率為24.910%，第三主成分與PL、PLV 顯著正相關(guān)，貢獻(xiàn)率為17.699%。以上3 個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為81.454%。

表5 木姜葉柯葉片表型性狀的主成分分析Tab.5 Results of principal components analysis of leaf phonotype traits of L.polystachya

利用提取的主成分?jǐn)?shù)值對(duì)62 個(gè)居群進(jìn)行聚類分析（圖1）。由圖1 可知，62 個(gè)居群分為4 大類，其中第Ⅰ類為長(zhǎng)披針形葉片，包括浙江、云南、湖北居群，廣西金秀、凌云、隆林、上林居群，四川德昌、天全居群和江西貴溪、井岡山居群，它們?nèi)~片的特征：葉片較長(zhǎng)，葉尖長(zhǎng)度較大，葉柄較短；第Ⅱ類為寬披針形葉片，包括貴州各個(gè)居群，廣西賀州和龍勝居群，湖南桂東、新寧、宜章居群，四川峨眉、米易居群和重慶奉節(jié)居群，它們?nèi)~片的特征：葉片長(zhǎng)且寬，葉片長(zhǎng)寬比較小，葉尖長(zhǎng)度較大，葉柄較長(zhǎng)；第Ⅲ類為長(zhǎng)橢圓形葉片，包括福建將樂(lè)、泰寧、武夷山居群，廣西鳳山、靖西、那坡居群，四川敘永居群和重慶南川居群，它們?nèi)~片的特征：葉片相對(duì)較短而窄，葉片長(zhǎng)寬比較大，葉尖長(zhǎng)較小，葉柄較短；第Ⅳ類為寬橢圓形葉片，包括廣東和海南居群以及江西、湖南南部、福建西部和廣西東部且靠近廣東居群，它們?nèi)~片的特征：葉片較短而寬，葉片長(zhǎng)寬比較小，葉尖長(zhǎng)較小而葉柄較長(zhǎng)。

圖1 不同居群木姜葉柯葉片表型性狀聚類分析Fig.1 Cluster analysis result of populations based on L.polystachya leaf phenotypic trait

3 討論

3.1 木姜葉柯葉片遺傳變異豐富

植物表型性狀多樣性是其遺傳適應(yīng)性和環(huán)境異質(zhì)性長(zhǎng)期共同作用的結(jié)果，表型性狀變異越豐富，越能提高其對(duì)不同環(huán)境的適應(yīng)程度[20-21]。表型性狀變異是遺傳變異的重要組成部分，表型性狀變異越大，存在的遺傳變異可能越大[22]。木姜葉柯廣泛分布在亞熱帶地區(qū)，該區(qū)域受海洋或內(nèi)陸等環(huán)境和自然條件差異較大，同時(shí)作為一種雌雄同株和風(fēng)媒傳粉植物，其不同居群葉片表型性狀上存在極大的變異，9個(gè)葉片表型性狀變異系數(shù)9.79%～42.57%，且葉片表型性狀遺傳分化顯著，表明葉片對(duì)異質(zhì)生境具有較強(qiáng)可塑性。表型性狀變異的豐富性為育種專家尋找符合生產(chǎn)需求的品種提供了資源的可能性。木姜葉柯是以葉片為主要利用部位的樹(shù)種，不同居群葉片表型性狀變異較大證實(shí)其存在豐富的遺傳多樣性，從中挖掘優(yōu)異基因作為育種材料，將為種質(zhì)資源保護(hù)、利用、創(chuàng)新及遺傳改良提供基礎(chǔ)。

3.2 木姜葉柯葉片表型性狀與地理-氣候因子的關(guān)系

通過(guò)在較大尺度上針對(duì)特定植物類群基于居群水平表型性狀變異分析及研究表型性狀及其與地理-氣候因子間的關(guān)系，可以更準(zhǔn)確地揭示植物表型性狀的變異格局及生態(tài)響應(yīng)策略[23]。木姜葉柯葉片表型性狀變異呈現(xiàn)經(jīng)緯雙向變異模式，其中葉片LL、LW、LA 與經(jīng)度呈極顯著負(fù)相關(guān)，表現(xiàn)為典型的經(jīng)向變異模式；葉片LL 和LA 與年降雨量呈顯著負(fù)相關(guān)，表明降水是影響葉片性狀的主要驅(qū)動(dòng)因子；葉片BA 與緯度呈極顯著負(fù)相關(guān)，與極端最低溫度呈極顯著正相關(guān)，證明低溫是影響葉片基部性狀的主導(dǎo)因子，即隨著經(jīng)度遞減，降雨逐漸遞減，葉片變短，葉面積遞減，但隨著緯度增加，極端低溫越來(lái)越低，葉片基部越來(lái)越寬，以減少水分散失，提高葉片對(duì)溫度和水分利用效率，從而適應(yīng)復(fù)雜多變的生態(tài)環(huán)境。

3.3 木姜葉柯葉片表型性狀聚類分析

廣闊的分布區(qū)、多樣的生境和氣候的異質(zhì)性，為研究木姜葉柯葉片表型性狀的地理變異模式提供可能。聚類分析表明木姜葉柯按葉片表型性狀提取的主成分?jǐn)?shù)值可分為4個(gè)大類，從大的景觀尺度來(lái)看，各居群并未嚴(yán)格按照地理距離而聚類，說(shuō)明居群的葉表型性狀變異具有不連續(xù)性；從較小的區(qū)域尺度來(lái)看，地理距離較近居群又聚為一大類。木姜葉柯葉片表型性狀的聚類結(jié)果，說(shuō)明生長(zhǎng)環(huán)境的相似性是居群按照地理距離聚類的重要原因，從大的景觀尺度可發(fā)現(xiàn)居群所生長(zhǎng)的環(huán)境大多相對(duì)獨(dú)立，環(huán)境異質(zhì)性也加劇了各居群間的獨(dú)立分化。木姜葉柯依靠風(fēng)媒遠(yuǎn)距離傳播花粉，種子結(jié)實(shí)量大，以果實(shí)為食的嚙齒類動(dòng)物可使種子長(zhǎng)距離擴(kuò)散，居群間基因交流距離可能大于居群間的地理距離，這顯然造成了居群間基因交流較密切，使得地理距離較近居群具有相似的生態(tài)適應(yīng)策略和地理變異格局。

4 結(jié)論

木姜葉柯葉片制作甜茶在我國(guó)有悠久的歷史，葉片中根皮苷、三葉苷和根皮素含量高及在抗糖尿病作用使其近年受到越來(lái)越多的關(guān)注。作為在我國(guó)亞熱帶地區(qū)分布極廣的資源樹(shù)種，長(zhǎng)期適應(yīng)性進(jìn)化過(guò)程中因自身遺傳和外部自然地理環(huán)境等多因素綜合作用，木姜葉柯葉片表型性狀形成了豐富的遺傳變異，在不同地理居群間出現(xiàn)了顯著分化，且葉片表型性狀變異呈現(xiàn)經(jīng)緯雙向變異模式，年降水量和極端最低溫度為主要驅(qū)動(dòng)因子。隨著全球氣候的變化，二氧化碳濃度增高、降水量及極端溫度等關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子的變化可能引發(fā)木姜葉柯在適生區(qū)面積的日漸減少和分布中心的向北移動(dòng)[24]。

基于臘葉標(biāo)本的不同居群間木姜葉柯葉片表型性狀變異較大證實(shí)其種質(zhì)資源有豐富的遺傳基礎(chǔ)，但對(duì)于其葉片表型性狀地理變異模式的辨析還需要實(shí)地采集更多葉片樣本、全面系統(tǒng)地深入研究，以期為資源保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。