硫氰酸鹽高效降解菌群的動(dòng)力學(xué)及微生物多樣性研究

汪流偉，肖小雙，安雪姣，李寧健，謝 東，張慶華

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045）

【研究意義】硫氰酸鹽是一種在金礦開采和焦化工業(yè)過程產(chǎn)生的含碳、氮、硫等元素的常見化合物，排放濃度高達(dá)5 000 mg/L，具有較強(qiáng)的毒性和化學(xué)穩(wěn)定性[1-2]，其主要是通過抑制多種酶的活性，使得多種生物受到迫害[3]，對(duì)生活環(huán)境造成了極大的危害。鑒于其毒性和來源廣泛，工業(yè)排放指令規(guī)定，硫氰酸鹽在焦化廢水中的排放濃度必須降低至4 mg/L，為此，硫氰酸鹽降解研究就顯得尤為重要[4]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，通過物理、化學(xué)和生物方法可有效去除硫氰酸鹽[5]，其中物化法效果較差，實(shí)施成本較高，有時(shí)還會(huì)產(chǎn)生二次污染，不能達(dá)到排放的標(biāo)準(zhǔn)[6-9]；相比之下，由微生物介導(dǎo)的生物法去除硫氰酸鹽具有低成本、高效率、降解完全、不產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點(diǎn)，也是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究的主要方法之一。具備降解硫氰酸鹽的微生物已從多種來源中分離和鑒定，如Arthrobacter、Klebsiella、Pseudomonas、Ralstonia、Thioba-cillus thioparus、Thioalkalivibrio thiocyanoxidans、Paracoccus thiocyanatus等[10-13]，這些微生物利用硫氰酸鹽作為能量和碳、氮、硫源[14-15]，可在不同程度上實(shí)現(xiàn)硫氰酸鹽的降解?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】與僅借助單一微生物降解硫氰酸鹽相比，含有多種微生物的活性污泥的去除具有更穩(wěn)定、更高的去除率[16]。有研究表明，以硫桿菌為主的微生物群落在連續(xù)流動(dòng)反應(yīng)器中的最大硫氰酸鹽去除率為1.07 mmol/（L·h）[17]；用于自養(yǎng)硫氰酸鹽去除的微生物群落也以硫桿菌屬物種為主，能夠在5 d 內(nèi)將2 109 mg/L 降解到890 mg/L[18]。這些研究始終檢測(cè)到硫桿菌屬的細(xì)菌是降解菌群中的關(guān)鍵菌群，主要參與硫氰酸鹽的降解，但是關(guān)于復(fù)合菌群的降解動(dòng)力學(xué)和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)及降解硫氰酸鹽的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)了解甚少，對(duì)其進(jìn)行分子生態(tài)學(xué)研究，為處理實(shí)際含硫氰酸鹽廢水提供新見解。【擬解決的關(guān)鍵問題】本課題組前期從焦化工業(yè)廢水中富集馴化獲得了一組降解速率快、酶活高且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的硫氰酸鹽高效降解復(fù)合菌群。該菌群可在27 h內(nèi)將3 g/L硫氰酸鹽完全降解，且可在11 d內(nèi)將12 g/L硫氰酸鹽完全降解，遠(yuǎn)超現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的最高水平（7 g/L，12 d）[19]。在此基礎(chǔ)上，對(duì)復(fù)合菌群降解硫氰酸鹽速率和菌群生長(zhǎng)速率進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析；采用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)復(fù)合菌群微生物多樣性分析及其馴化富集前后的群落結(jié)構(gòu)的演替變化，確定其優(yōu)勢(shì)菌群，以期為含高濃度硫氰酸鹽廢水處理提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 復(fù)合菌群來源 本課題組前期從江西省豐城市新高焦化廠的初曝池取樣后富集馴化得到的高效降解復(fù)合菌群。

1.1.2 培養(yǎng)基 無機(jī)鹽培養(yǎng)基[20]：NaCl 0.15 g/L，MgSO40.15 g/L，F(xiàn)eSO40.075 g/L，CaCl20.01 g/L，K2HPO41.1 g/L，KH2PO41.1 g/L，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 硫氰酸鹽檢測(cè)方法 硫氰酸鹽檢測(cè)采用鐵比色法[21]。

1.2.2 生物量檢測(cè) 將發(fā)酵液在4 ℃下8 000 r/min 離心5 min 后收集復(fù)合菌群，菌群經(jīng)蒸餾水3次潤(rùn)洗，離心后再次收集菌群。菌群在室溫下干燥后稱重。復(fù)合菌群生物量計(jì)算公式：

1.3 不同初始濃度對(duì)復(fù)合菌群的影響

將活化的復(fù)合菌群按10%（V/V）的接種量接種至分別以硫氰酸鹽初始濃度為0.1～15 g/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在其他條件保持一致的情況下探究復(fù)合菌群降解硫氰酸鹽及菌群生長(zhǎng)的影響。

1.4 硫氰酸鹽降解復(fù)合菌群的微生物多樣性分析

將原始活性污泥與復(fù)合菌群菌液離心，將洗滌后的污泥與復(fù)合菌群由北京百邁克公司用于細(xì)菌總DNA 的提取、PCR 擴(kuò)增和16S rRNA 測(cè)序分析。采用引物27F5′-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3′和1492R5′-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3′進(jìn)行PCR 擴(kuò)增?？侱NA 提取按照土壤基因組DNA 抽提試劑盒進(jìn)行。通過數(shù)據(jù)處理對(duì)物種進(jìn)行注釋及分類學(xué)分析、Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析、組間差異顯著性分析、相關(guān)性與關(guān)聯(lián)性分析[22]。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用origin繪圖軟件進(jìn)行繪圖，利用SPSS Statistics 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，每組試驗(yàn)3次重復(fù)。

2 結(jié)果和討論

2.1 不同初始硫氰酸鹽濃度對(duì)復(fù)合菌群的影響

硫氰酸鹽在一定濃度下對(duì)多種酶有抑制作用，因此，硫氰酸鹽初始濃度過高時(shí)，研究其耐受性是必要的[23]。為了深入探究硫氰酸鹽初始濃度對(duì)降解率及生長(zhǎng)速率的影響，選取濃度范圍0.1～15 g/L 的硫氰酸鹽進(jìn)行分析，其結(jié)果如圖1所示，當(dāng)硫氰酸鹽初始濃度在0.1～1 g/L 時(shí)，復(fù)合菌群降解速率越來越快；但隨著硫氰酸鹽初始濃度的提高（2～15 g/L），復(fù)合菌群降解速率越來越慢，這可能是復(fù)合菌群經(jīng)歷了一段適應(yīng)期，且硫氰酸鹽濃度越高，適應(yīng)期越長(zhǎng)。同樣，當(dāng)硫氰酸鹽初始濃度在1～4 g/L 時(shí)，復(fù)合菌群生長(zhǎng)速率越來越快；當(dāng)濃度進(jìn)一步提高時(shí)（5～15 g/L），復(fù)合菌群生長(zhǎng)速率越來越慢。在低濃度時(shí)（1 g/L），復(fù)合菌群降解硫氰酸鹽及其生長(zhǎng)不受底物限制，當(dāng)提高濃度（4 g/L），復(fù)合菌群的生長(zhǎng)速率依舊處于上升的趨勢(shì)，但降解速率卻在降低，結(jié)果表明復(fù)合菌群生長(zhǎng)速率并不完全吻合于復(fù)合菌群降解硫氰酸鹽速率。

由圖1可知，隨著硫氰酸鹽濃度的逐漸增加，降解所需時(shí)間顯著延長(zhǎng)，硫氰酸鹽降解速率和復(fù)合菌群生長(zhǎng)速率均呈先增后減的趨勢(shì)。由此說明高濃度硫氰酸鹽對(duì)該復(fù)合菌群的降解及生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。因此，可以采用底物抑制模型-Haldane方程來描述該復(fù)合菌群的降解及生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)方程（方程式如下）。隨后利用硫氰酸鹽降解時(shí)間和降解速率（復(fù)合菌群生長(zhǎng)速率）進(jìn)行擬合，結(jié)果如表1所示，硫氰酸鹽降解速率（菌群生長(zhǎng)速率）和降解時(shí)間符合線性關(guān)系，故該復(fù)合菌群對(duì)硫氰酸鹽的降解動(dòng)力學(xué)和菌群生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。

表1 復(fù)合菌群對(duì)硫氰酸鹽降解及細(xì)菌生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)方程及參數(shù)Tab.1 Kinetic equation and parameters of thiocyanate degradation and microbial growth of the microbial community

圖1 復(fù)合菌群對(duì)不同濃度硫氰酸鹽的降解性能Fig.1 Degradation of thiocyanate at different concentrations by microbial community

式中，V為降解速率[g/（L·h）]，S為硫氰酸鹽初始濃度（g/L），Vmax為硫氰酸鹽的最大降解率[（g/（L·h）]，Ki為底物抑制常數(shù)（g/L），Ks為底物飽和常數(shù)（g/L）。Vopt為硫氰酸鹽的最佳降解速率/最佳生長(zhǎng)速率[g/（L·h）]，Sopt為硫氰酸鹽的最佳降解/生長(zhǎng)濃度（g/L）。

分別對(duì)不同硫氰酸鹽濃度下初始階段降解速率和菌體生長(zhǎng)速率的實(shí)驗(yàn)值與理論值進(jìn)行擬合，結(jié)果如圖3 所示，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.916 51 和0.941 28，說明擬合效果較好。隨著硫氰酸鹽濃度的不斷升高，降解速率和生長(zhǎng)速率也依次增大，直到達(dá)到最高點(diǎn)即存在最大降解速率Vmax和復(fù)合菌群最大生長(zhǎng)速率Vmax分別為0.148 79 g/（L·h）和0.236 46 g/（L·h），底物抑制常數(shù)Ki分別為32.845 5 g/L 和5.928 0 g/L，底物飽和常數(shù)Ks分別為0.051 74 g/L 和1.337 59 g/L，如表2 所示。代入公式計(jì)算，得到最佳降解速率Vopt與最佳硫氰酸鹽濃度Sopt分別為0.137 85 g/（L·h）、0.121 26 g/L，最佳菌群生長(zhǎng)速率Vopt和最佳硫氰酸鹽濃度Sopt分別為1.278 28 g/（L·h）、2.784 68 g/L，這些結(jié)果與圖2的峰值點(diǎn)基本一致。

表2 復(fù)合菌群降解硫氰酸鹽動(dòng)力學(xué)及細(xì)菌群落生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.2 Parameters of thiocyanate degradation and microbial community growth kinetics

圖2 復(fù)合菌群的霍爾丹模型擬合曲線Fig.2 Fitted curves of Haldane model of microbial community

高濃度硫氰酸鹽降解速率的降低可能是因?yàn)榈孜餄舛雀?、毒性大，難以被微生物快速利用，其次還可能是高濃度硫氰酸鹽阻止了酶的活性區(qū)域，降低酶活，從而阻礙了生物降解和復(fù)合菌群生長(zhǎng)。表明復(fù)合菌群在硫氰酸鹽降解過程中符合底物抑制模型，進(jìn)一步明確了硫氰酸鹽降解模型的適用性。這與黃會(huì)靜[24]等研究結(jié)果相似，但是其研究的硫氰酸鹽底物濃度最大為3 227.21 mg/L，本研究的最高濃度為15 g/L。眾所周知硫氰酸鹽在實(shí)際廢水中的含量?jī)H有0.5～3 g/L，但該復(fù)合菌群可降解15 g/L的硫氰酸鹽，遠(yuǎn)超報(bào)道的最高水平70 mmol[19]，并且能保持較高的降解效率。這為后期利用復(fù)合菌群處理高濃度復(fù)雜的實(shí)際硫氰酸鹽廢水提供了重要的理論支持。

2.2 硫氰酸鹽降解復(fù)合菌群微生物多樣性分析

2.2.1 硫氰酸鹽降解復(fù)合菌群群落結(jié)構(gòu)多樣變化 為了分析硫氰酸鹽降解復(fù)合菌群與原始活性污泥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)以及豐富度，在97%相似水平上計(jì)算了常見的多樣性指數(shù)。原始活性污泥和復(fù)合菌群細(xì)菌多樣性指數(shù)（表3），覆蓋率指數(shù)是樣品的測(cè)序深度也表明樣品的覆蓋率，6 個(gè)樣品的覆蓋率分別是0.997 4、0.998 5、0.998 2、0.999 2、0.999 2 和0.998 7，表明絕大部分的細(xì)菌種群都被檢測(cè)出來。隨著硫氰酸鹽降解菌群的富集馴化，降解菌群中的細(xì)菌多樣指數(shù)隨之減少，如原始的活性污泥經(jīng)過培養(yǎng)馴化后，生物分類單元（OTUs）從87、89、84 降為44、44、40，香農(nóng)指數(shù)也從2.667 8、2.857 4、2.714 3 減為1.512 6、1.813 8、1.393 1，這表明細(xì)菌多樣性及結(jié)構(gòu)在復(fù)合菌群中發(fā)生了改變，不斷提高硫氰酸鹽濃度對(duì)群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生脅迫壓力，使其生物多樣性減少。而保存下來的這部分微生物有些可能是硫氰酸鹽降解菌，還有些可能與保持污泥穩(wěn)定性相關(guān)，也有可能是它們可以利用硫氰酸鹽降解的產(chǎn)物或者次級(jí)產(chǎn)物進(jìn)行生存。

表3 細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Tab.3 Diversity indices of bacterial community

2.2.2 硫氰酸鹽降解復(fù)合菌群群落組成變化 如圖3（a）所示，原始污泥的優(yōu)勢(shì)菌門主要有Acidobacteria、Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes。其豐度大約為：57.95%、22.05%、12.49%、1.32%;復(fù)合菌群的優(yōu)勢(shì)菌門主要有Proteobacteria、Bacteroidetes、Patescibacteria、Armatimonadetes，其豐度大約為：81.04%、14.46%、1.80%、1.34%，這與Wang 等[19]的研究結(jié)果相似。其中復(fù)合菌群獨(dú)有的Patescibacteria 已被報(bào)道其常與反硝化菌共存[25]，Armatimonadetes 對(duì)廢水中酚類物質(zhì)具有較好的降解效果[26-27]。Acidobacteria 在復(fù)合菌群中消失的原因可能是在硫氰酸鹽脅迫下由于不能有效的利用硫氰酸鹽而逐漸被淘汰，有研究表明Acidobacteria 與環(huán)境中的C 和N 含量成反比[28]，這也解釋了在硫氰酸鹽降解過程中氨氮濃度越來越高的原因。Proteobacteria 在原始污泥和復(fù)合菌群中都是優(yōu)勢(shì)菌門，且在富集馴化過程中豐度明顯提高，這說明其在硫氰酸鹽的脅迫下不受影響，而且能很好地代謝繁殖[29]。同樣Bacteroidetes 也是原始污泥和復(fù)合菌群中共有的優(yōu)勢(shì)菌門，在后期富集馴化過程中豐度無明顯差異，說明Bacteroidetes 能適應(yīng)硫氰酸鹽的脅迫，唐濤濤[30]發(fā)現(xiàn)其可降解多環(huán)芳烴。

如圖3（b）所示，原始污泥中的優(yōu)勢(shì)菌屬及其豐度為：Uncultured_bacterium_f_Blastocatellaceae、Alicy-cliphilus、uncultured_bacterium_f_NS9_marine_group、Diaphorobacter、uncultured _bacterium_f_Mitochondria、Thiobacillus。其豐度大約為：57.95%、12.40%、5.98%、2.80%、2.93%、2.69%;復(fù)合菌群中優(yōu)勢(shì)菌屬和豐度分別為：Thiobacillus、uncultured_bacterium_f_Chitinophagaceae、uncultured_bacterium_f_NS9_marine_group、Dokdonella、uncultured_bacterium_f_Saccharimonadaceae。其豐度大約為：77.73%、6.16%、5.63%、2.09%、1.80%。在復(fù)合菌群中，原始污泥中的優(yōu)勢(shì)菌群Alicycliphilus、uncultured_bacterium_f_Blastocatellaceae和Diaphorobacter均未出現(xiàn)，表明這些菌屬不能生存在硫氰酸鹽的脅迫下。Thiobacillus已被廣泛報(bào)道能有效降解硫氰酸鹽，且是含硫氰酸鹽廢水處理系統(tǒng)中的關(guān)鍵菌屬，亦可利用H2S 作為能源生長(zhǎng)[31-32]，在復(fù)合菌群中其豐度大約為77.73%，而在原始活性污泥中其豐度大約為2.69%，結(jié)果表明Thiobacillus可能是硫氰酸鹽主要的降解菌屬。Dokdonella、uncultured_bacterium_f_Saccharimonadaceae和WPS-2在菌群富集馴化過程中出現(xiàn)，說明這些菌屬可以協(xié)同利用硫氰酸鹽或其降解物生長(zhǎng)代謝。uncultured_bacterium_f_NS9_marine_group豐度在富集馴化過程中沒有明顯改變，這可能是該菌屬可以在高濃度硫氰酸鹽脅迫下生長(zhǎng)代謝。不同的細(xì)菌具有不同污染物降解的功能，同一種細(xì)菌也可具有降解多種不同污染物的功能，如Thiobacillus不僅能降解硫氰酸鹽，還具有很強(qiáng)的反硝化能力[33-34]?？偟慕Y(jié)果表明兩組樣品中不同屬在不同樣品中的豐度不同，有些菌屬的豐度會(huì)有變化，說明細(xì)菌種群在高濃度硫氰酸鹽脅迫下有一定的適應(yīng)性，群落結(jié)構(gòu)可以通過自身的組成變化適應(yīng)高濃度硫氰酸鹽環(huán)境。這也進(jìn)一步說明該復(fù)合菌群的適應(yīng)性強(qiáng)，這對(duì)處理成分復(fù)雜的實(shí)際硫氰酸鹽廢水具有極大的優(yōu)勢(shì)。

圖3 門/屬水平上的細(xì)菌群落組成Fig.3 Composition of bacterial community at phylum/ genus level

3 結(jié)論

（1）研究發(fā)現(xiàn)硫氰酸鹽降解菌群的降解動(dòng)力學(xué)和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)均符合Haldane模型，最佳降解速率Vopt值和最佳硫氰酸鹽濃度Sopt為0.137 85 g/（L·h）、0.121 26 g/L；最佳復(fù)合菌群生長(zhǎng)速率Vopt值和最佳硫氰酸鹽濃度Sopt分別為1.278 28 g/（L·h）、2.784 68 g/L。

（2）復(fù)合菌群中發(fā)現(xiàn)Thiobacillus、uncultured_bacterium_f_Chitinophagaceae、uncultured_bacterium_f_NS9_marine_group、uncultured_bacterium_f_Saccharimonadaceae、Dokdonella等菌屬的豐度較高，其中，Thiobacillus由活性污泥的劣勢(shì)菌屬（豐度大約為2.69%）變?yōu)閺?fù)合菌群的優(yōu)勢(shì)菌屬（豐度大約為77.73%），被認(rèn)為是復(fù)合菌群降解硫氰酸鹽的關(guān)鍵菌屬。

本研究結(jié)果可為復(fù)合菌群在硫氰酸鹽廢水的實(shí)際處置提供研究基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。